一种有机污染物细胞代谢毒性的评估方法
【技术领域】
[0001] 本发明是一种环境污染物毒性效应评价的新方法，是基于质谱的代谢组学技术研 究高关注新型有机污染物对细胞的毒性效应，具体地说是一种利用质谱分析技术和代谢 组学软件相结合评估环境污染物对细胞毒性效应的方法，该方法具有前处理简单，分析时 间短，重复性好，获得信息量全面等优点。
【背景技术】
[0002] 持久性有机污染物（persistantorganicpollutant，POPs)具有毒性 高，生物累积性强，远距离迁移的特性，成为典型的全球性污染物。环境介质中 普遍存在短链氯化石錯（shortchainchlorinatedparaffins,SCCPs)、六溴环 十二烧（Hexabromocyclododecanes，HBCDs)、得克隆（DechloranePlus,DPs)、 (tetrabromobisphenolA，TBBPA)和苯并[a]花二醇环氧化物（Benzo[a]pyrene diol印oxides，BPDEs)等有机污染物，它们对甲状腺、肝脏、肾脏、肺等器官具有潜在的致癌 性，已列入或将被列入POPs候选名单。各种环境介质(土壤、沉积物、大气、水体、生物体） 中均已检出该类污染物。因此，针对这些污染物建立快速有效的毒性评价方法并开展相关 的污染调查工作迫在眉睫。针对不断涌现的新型有机污染物，寻找一种简单、快速有效的 毒性评价技术成了摆在众人面前的难题。目前许多新型有机污染物以及环境中存在的持 久性有机污染物可用于人体健康风险评价的基础数据还很少，在毒理学研究中对人体健康 影响的相关研究十分薄弱，不足以支持得出有实际意义的结论(杨永滨，生态毒理学报。 2006, 105-115)，利用代谢组学对细胞毒性评估是污染物毒性研究的新手段(刘鹏，大连医 科大学学报。2008, 565-569)但是传统的细胞代谢毒性评估方法存在分析周期长，测试方 法繁琐，需要多种仪器相结合，且获得的信息量有限等缺点，因此急需发展一种高效快速且 信息量丰富的分析手段来评估细胞的代谢毒性，质谱技术的高速发展成了近年来代谢组学 研究的主要工具，UPLC-QT0F具有高灵敏度，可全景式分析代谢产物的特点，HPLC-MS/MS存 在定量精确，测试范围广的优点（MoniqueP,ChristineV.S，KonstantinosP，etal.Rapid CommunMassSpectrom，2003, 17:1297-1311)，代谢流量分析系统可以利用细胞外代谢产 物的变化量计算相应的胞内代谢物的变化情况（JensN，FoziaN，ElmarH.ToxicolAppl Pharm，2009, 240:327-336)，代谢路径分析可以利用胞内的代谢产物对代谢路径进行深入 的分析，因此有机的结合质谱技术、统计分析平台及代谢组学软件在一起，对于快速高效的 研究环境污染物对细胞的毒性效应具有重要的意义。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于发展一种操作简单、周期短、获得信息量丰富的细胞毒性效应 评价的方法。
[0004] 为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
[0005] 利用UPLC-QT0F对全景代谢物进行分析，分析的结果指导HPLC-MS/MS进行胞内及 胞外代谢物的靶向分析，利用该流程分析了人肝癌细胞H印G2在污染物暴露下的胞内及胞 外代谢物含量，利用统计学分析、代谢路径及代谢流量分析对细胞的毒性评估：
[0006] a)供试细胞为人肝癌细胞IfepG2,暴露浓度参考环境中污染物的实际浓度,暴露时 间为24小时，胞内代谢物的分析采用MTBE/甲醇/水三相系统，使得样品极性代谢物提取、 非极性代谢物提取与除蛋白步骤一步完成；
[0007] b)建立了细胞2000多种代谢产物（细胞全组分非靶标分析）的UPLC-QT0F的分 析方法，同时建立了 50种代谢产物(氨基酸、脂肪酸、甘油、尿素、乳酸等）的HPLC-MS/MS定 量定性方法；
[0008] c)代谢流量分析系统通过胞外的检测结果可以计算胞内的代谢流量，代谢路径分 析可以直观的分析胞内的代谢变化，二者的相互佐证可以系统评价环境污染物对细胞的毒 性效应。
[0009] 此方法涉及到的高关注新型有机污染物包括已列入或将被列入POPs候选名单的 污染物，如短链氯化石蜡、六溴环十二烷、得克隆和苯并[a]芘二醇环氧化物等；
[0010] 步骤a中萃取液胞外代谢物的为甲醇/水比例为80:20,胞内代谢物的为MTBE/ 甲醇/水比列为20:6:7。
[0011] 步骤b中通过优化色谱分析条件和质谱参数实现了UPLC-QT0F全景式分析2000 多种胞外代谢产物，同时利用HPLC-MS/MS对氨基酸脂肪酸等50种靶向代谢物的定量分析； UPLC-QT0F质谱参数为：正离子模式，毛细管电压4000V，裂解电压为175V，喷雾气氮气为 45psi，干燥气氮气为9L/min，温度为350°C。中心离子数据设置为m/z80-1100,安捷伦的 MassHunter工作站进行后续分析。HPLC-MS/MS的喷雾电压为3000V;辅助气为5psi;鞘气 为30psi;毛细管温度和蒸发气的温度均为300°C，此参数设置很适于检测化合物的高灵敏 度及稳定性。
[0012] 步骤c中代谢流量分析及代谢通路分析主要包括了糖代谢，能量代谢、蛋白质合 成，氨代谢，氨基酸代谢等步骤。
[0013] 按照权利要求1所述的毒性效应评估方法，其特征在于：步骤a中的提取溶剂为甲 醇/水，此提取溶剂除了可以除去细胞培养液中的大量蛋白外还可以尽可能多的提取代谢 产物，提高代谢产物的出峰数量。
[0014] 步骤b中UPLC-QT0F结合安捷伦MPP软件能有效的进行峰提取及峰定量，MPP的 峰设定值为：电荷价态为1，绝对峰高>=1000,IDBROWSER容差为质量lOppm。
[0015] 步骤c中的代谢路径涵盖了碳代谢、氮代谢及能量代谢途径，尽可能的从物质代 谢及能量代谢双向说明污染物的毒性效应。且代谢流量分析和代谢路径分析分别从胞外结 果和胞内结果两个方面入手，最终得到共同的结果，更能让最后的结论具有说服性。
[0016] 本发明具有如下优点：
[0017] (1)利用HepG2细胞为供试细胞，将污染物对细胞暴露处理24小时，建立了快速提 取胞内及胞外代谢产物的前处理方法；（2)基于质谱技术对细胞的胞内代谢物及胞外代谢 进行全景式及靶向分析；（3)代谢流量分析系统结合路径分析系统分析高关注新型有机污 染物对细胞影响的代谢路径。
[0018] 该发明前处理方法简单，利用UPLC-QT0F结合HPLC-MS/MS能有效的对细胞的胞内 及胞外代谢产物进行全景式的及靶向的代谢物分析，结合代谢流量分析及代谢路径分析能 直观准确的的反映高关注新型有机污染物对细胞的毒性效应；具有操作简单，分析时间短， 重复性好，获得信息量全面等优点。
【附图说明】
[0019] 图1胞外代谢物UPLC-QT0F的总离子流图；
[0020] 图2苯并芘对HepG2细胞代谢路径的影响；
[0021] 图3代谢流量分析苯并芘对细胞各代谢流的影响。
【具体实施方式】
[0022] 本发明利用HepG2细胞为供试细胞，建立了基于质谱的代谢组学技术研究苯并芘 对细胞的毒性效应。
[0023] 将苯并芘对IfepG2细胞暴露处理，细胞培养条件为DMEM高糖培养基，1%的青链霉 素双抗，10%的胎牛血清，对数期后加入的DMS0溶解的苯并芘处理液或者等量的不含苯并 芘的DMS0,使溶液中的苯并芘的终浓度为分别为0, 5nM，500nM，暴露处理24小时，5%的二 氧化碳培养箱内培养，吸取培养24h的细胞培养液10yL至lml甲醇和水混合液(体积比 80:20)中，漩润震荡2min，然后15000r?min1离心5min，上清液过0. 22ym针头过滤器。 该方法除蛋白与样品稀释一步完成法，取样量仅需10PL。结果表明，该方法的重复性好， 回收率高。用细胞刮刀对六孔板中的细胞进行提取，同时加入800ill的MTBE/甲醇/水 (20:6:7)三相系统，通过漩涡震荡及高速离心达到了除蛋白、提取极性代谢产物及非极性 代谢产物一步完成。各化合物的加标回收率达到了 91% -105%之间，回收率良好。
[0024] 对提取的代谢产物，建立UPLC-QT0F分析方法对胞外代谢产物进行全景式分 析，该方法采用Agilentl200液相色谱结合ESI模式，配备Agilent6500Q-T0F质谱系统 (Agilent，USA).5iiL样品注射入UPLCACQUITYT3 色谱柱（2.1mmX100mmX1.8iim)柱 温箱温度为35°C。水和乙腈作为流动相，两相都包含了 0. 1%的甲酸，流速为0. 3mL/min。 UPLC-QT0F质谱参数为：正离子模式，毛细管电压4000V，裂解电压为175V，喷雾气氮气 为45psi,干燥气氮气为9L/min