，温度为350°C。中心离子数据设置为m/z80-1100,安捷 伦的MassHunter工作站进行后续分析，该结果鉴定出2000多种细胞代谢物。胞外代谢物 UPLC-QT0F的总离子流如图1所示。
[0025] 建立HPLC-MS/MS分析方法，极性代谢产物液相色谱柱选择AtlantisC18反相 色谱柱（waters, 150mmX2.lmm, 3. 0iim);流动相A为纯水，流动相B为甲醇；总流速为 200iiL*min\柱温箱温度为20°C，进样量为10UL。非极性代谢产物液相色谱柱选择 UfavourC8反相色谱柱（中谱科技，150mmX2.lmm, 3. 0ym);流动相A为ImM乙酸铵水溶 液，流动相B为ImM乙酸铵乙腈溶液；总流速为250iiL?min\柱温箱温度为40°C，进样量 为10iiL。HPLC-MS/MS的喷雾电压为3000V;辅助气为5psi;鞘气为30psi;毛细管温度和 蒸发气的温度均为300°C，利用该方法，对氨基酸，脂肪酸，甘油尿素50种代谢产物进行了 定量定性分析。检测到的标靶向代谢物的峰面积的RSD均小于10%，这说明仪器的精密度比 较高。各代谢物色谱保留时间的RSD值均小于3%，这有利于代谢组学数据预处理时的峰对 齐。代表性的几种代谢物的检出限、线性范围、相关系数、精密度见表1。
[0026] 表1典型代谢物的检出限（L0D)、线性范围、相关系数（r2)、精密度（以峰面积的 RSD计）和回收
[0027]
[0028] 对检测到的胞内代谢产物进行统计分析，可以得到显著性差异大的代谢产物，对 代谢产物的分析见图1，图1的结果表明，不同的代谢物变化表现出了不同的变化趋势，但 低浓度的处理时，代谢产物的含量显著降低，随着暴露浓度的升高，绝大多数代谢物相对于 空白组表现出了显著的上调趋势。
[0029] 为了进一步的探索苯并芘的毒性机制，将高浓度代谢物的含量代入在线的 http: //www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst进行代谢路径处理，结果表明，苯并花主要 影响的代谢路径分别是蛋白质合成，尿素代谢及一些特定的氨基酸代谢，影响的大小程度 和影响的路径如图2所示。同时检测到的高浓度的胞外的代谢物的含量变化代入代谢流量 系统，寻找差异性的代谢物及影响的代谢路径，结果如图3所示，图3的结果表明，高浓度的 苯并芘通过影响氨基酸的代谢使蛋白合成受到影响，由于尿素很精氨酸代谢的变化导致氨 代谢异常，此结果与胞内的代谢路径分析结果相吻合，因此代谢流量系统恶化代谢路径相 结合是有效的评价污染物代谢毒性作用的手段。
【主权项】
1. 一种有机污染物细胞代谢毒性的评估方法，其特征在于： 基于质谱的代谢组学技术研究有机污染物对细胞的毒性效应，其操作步骤如下： a) 采用液液萃取法分别对细胞外及细胞内的代谢物进行提取，分别得到胞外及胞内代 谢产物提取液； b) 建立了细胞代谢产物的UPLC-QTOF全景式分析方法，包括极性及非极性化合物同时 高通量分析，同时利用UPLC-QT0F的检测结果，寻找污染物处理组与未加污染物的对照组 比较相对含量变化较大(采用SPSS19.0软件在p=0. 05置信水平对检测化合物的含量对进 行单因素方差分析（one-way AN0VA)，用Duncan's法对均值进行多重比较，p〈0.05、p〈0. 01 分别认为差异显著和极显著）的化合物，对此类化合物(包括氨基酸，脂肪酸，甘油，尿素及 糖）建立HPLC-MS/MS的定性及定量分析方法； c) 采用代谢流量分析系统(陈琦，王卓，魏冬，代谢网络流分析进展及应用，2010,55， 14 :1302-1309)对b)中HPLC-MS/MS检测的胞外代谢物利用外标定量法进行计算分析，污 染物处理组与未加污染物的对照组相比较，计算出污染物处理组对细胞显著性影响的代谢 路径，并对影响的程度做分析；采用路径分析系统利用对b)中HPLC-MS/MS检测的胞内代谢 物进行追踪分析，污染物处理组与未加污染物的对照组相比较，同样计算出污染物处理组 对细胞显著性影响的代谢路径，并对影响的程度做分析；代谢流量分析系统和路径分析系 统共同计算出的与对照组显著差异的代谢路径(且差异程度一致）既可限定为污染物影响 的代谢路径，用此方法可以用于分析高关注新型有机污染物对细胞的毒性效应。2. 按照权利要求1所述的评估方法，其特征在于： 此方法涉及到的有机污染物主要包括一些对甲状腺、肝脏、肾脏、肺等器官具有潜在 的致癌性，已列入或将被列入POPs候选名单的污染物中的一种或二种以上，如短链氯化石 蜡、六溴环十二烷、得克隆和苯并[a]芘二醇环氧化物等中的一种或二种以上。3. 按照权利要求1所述的评估方法，其特征在于： 步骤a中供试细胞为人肝癌细胞IfepG2,暴露浓度参考环境中污染物的实际浓度(不同 的污染物的浓度范围不同，例如短链氯化石錯I-IOOy g/L)，暴露时间为24小时,萃取液胞 外代谢物的为甲醇/水(体积比80:20)，萃取液胞内代谢物的为MTBE、甲醇和水（体积比 20 ：6 ：7)； 步骤b中通过优化色谱分析条件和质谱参数实现了 UPLC-QT0F全景式分析2000多 种(包括极性的及非极性的化合物，如氨基酸，脂肪酸，脂类等）胞外代谢产物，同时利用 HPLC-MS/MS对氨基酸脂肪酸等50种(氨基酸、脂肪酸、甘油、尿素等）靶向代谢物的定量分 析； 步骤c中代谢流量分析及代谢通路(路径)分析主要包括了糖代谢，能量代谢、蛋白质合 成，氨代谢，氨基酸代谢等步骤中的一种或二种以上。4. 按照权利要求1所述的评估方法，其特征在于：步骤a中液液萃取后溶液需要高速 离心3-5min，以达到沉淀蛋白的目的。5. 按照权利要求1所述的评估方法，其特征在于：步骤b中UPLC-QT0F的流动相为乙 腈和水（1%乙腈保留lmin，线性增加到40%乙腈从Imin到5min，继续到50%乙腈从5min 至Ij 8min,继续到65%乙臆从8min到IOmin,到76%乙臆从IOmin到16min,最后到100%乙 腈从16min到20min保持5min)流动相体积比为40:60)，相对于甲醇，乙腈能检测到更多的 代谢产物，步骤b中HPLC-MS/MS的流动相为：甲醇和水(梯度洗脱程序为：0-2min时甲醇用 量为5% ;3min后甲醇用量提高到40%，保持5min ;在Imin内甲醇用量降到5%，然后再保持 9min)，相对于乙腈，甲醇更有利于同分异构体的分离； UPLC-QTOF质谱参数为：正离子模式，毛细管电压4000V，裂解电压为175V，喷雾气氮 气为45psi，干燥气氮气为9L/min，温度为350°C。中心离子数据数据设置为m/z80-1100， 安捷伦的MassHunter工作站进行后续分析； 步骤b中HPLC-MS/MS的喷雾电压为3000V ;辅助气为5psi ;鞘气为30psi ;毛细管温度 和蒸发气的温度均为300°C，此参数设置很适于检测化合物的高灵敏度及稳定性。6. 按照权利要求1或5所述的评估方法，其特征在于：步骤b中UPLC-QT0F检测的高 通量代谢产物采用安捷伦的MPP软件进行峰提取及定量分析，MPP的峰设定值为：电荷价态 为1，绝对峰高>=1000, ID BROWSER容差为质量lOppm。7. 按照权利要求1所述的评估方法，其特征在于：步骤c中的代谢流量分析是基于 KEGG数据库，步骤c中的路径分析基于KEGG数据库的基础上同时基于在线的http://www. metaboanalyst. ca/MetaboAnalyst 进行处理； 步骤c中的代谢流量是基于拟稳态假设，根据流量平衡及生物化学反应方程，根据胞 外的代谢物的含量变化计算胞内的代谢物的变化量； 步骤c中的代谢路径分析是基于统计学分析得到的潜在生物标志物及KEGG数据库进 行整个路径的串通； 步骤c中的代谢流量结果和步骤c中的代谢路径结果是相互呼应，相互佐证，相比于单 方面的评价结果更具有说服性及准确性。
【专利摘要】本发明利用HepG2细胞为供试细胞，通过污染物的暴露处理实验，a）建立了快速提取胞内及胞外代谢产物的前处理方法；b)利用UPLC-QTOF及HPLC-MS/MS对细胞的代谢产物进行全景式分析及靶向分析；c)统计学分析对高通量代谢物进行分类及筛选；d）代谢流量分析系统结合路径分析技术分析高关注新型有机污染物影响细胞的代谢路径。该发明前处理方法简单，利用UPLC-QTOF结合HPLC-MS/MS能有效的对细胞的胞内及胞外代谢产物进行分析，结合统计学处理、代谢流量分析及代谢路径分析能直观的分析高关注新型有机污染物影响细胞的代谢路径；具有操作简单，分析时间短，重复性好，获得信息量全面等优点。
【IPC分类】G01N30/06, G01N30/02
【公开号】CN105021716
【申请号】CN201410161518
【发明人】陈吉平, 张保琴, 耿柠波, 张海军, 王菲迪
【申请人】中国科学院大连化学物理研究所
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2014年4月21日