一种提高金藻油脂含量与多不饱和脂肪酸产量的培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及海洋单细胞微藻金藻及细胞内多不饱和 脂肪酸。
【背景技术】
[0002] 多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids,PUFAs)是指含有两个或更多个 不饱和双键结构的直链脂肪酸，又称多帰脂肪酸。根据第一个不饱和键位置不同，PUFAs通 常分为ω -3、ω -6在多不饱和脂肪酸分子中。ω -3和ω -6系列PUFAs具有重要生物学意 义并与人类健康密切相关，其中ω-3PUFA还具有防治人类必血管疾病，促进婴幼儿大脑发 育和改善视力的功效。
[0003] 海洋微藻是海洋生态系统中食物链的最初生产者，其种类多、数量大、生长繁殖 快，因其体内含有丰富的PUFAs而受到人们的广泛关注。利用海洋微藻生产多不饱和脂肪 酸比直接从鱼类中提取具有较大的优势，研究表明，鱼类本身不能合成PUFAs,它是通过吞 食富含PUFAs的海洋微藻后在体内实现PUFAs的积累，可见微藻才是PUFAs的真正生产者。 通过培养海洋微藻生产多不饱和脂肪酸理论上是一条相对更直接的途径。利用微藻生产 PUFAs具有W下优点；（1)微藻生长速度快、细胞PUFAs含量高，某些藻体内PUFAs的相对含 量高达5%~6%细胞干重。（2)微藻藻体细胞结构简单，其生长和代谢易受外界条件的影 响，可W通过改变培养条件，如温度、光强、培养基组成等促进PUFAs的合成，还可利用基因 工程筛选出高产PUFAs的藻株。（3)容易利用户外大型水池、光生物反应器等进行微藻的大 规模生产，并人为控制生产条件，容易高效获得稳定的代谢产物。（4)从微藻中提取PUFAs, 其提取纯化工艺远比从大型藻类和鱼类中提取要简单得多；而且获得的PUFAs制品不含鱼 腥味，不含胆固醇，不受杀虫剂和重金属的污染，而鱼油中却可能含有送些物质。
[0004] 湛江等鞭金藻（Isoc虹ysis zhangjiangensis)，属于金藻口、普林藻纲、等鞭藻 目、等鞭藻科、等鞭藻属。湛江等鞭金藻个体小，繁殖快，具无纤维素的细胞壁，营养丰富，尤 其在藻体中富含多不饱和脂肪酸，是海洋中鱼、奸和贝类的等幼体生长发育过程中必需的 营养成分。所W它作为一种优质的PUFA海洋生物资源，有很好的应用前景。因此，找到一 种既能提高金藻油脂含量又能提高其多不饱和脂肪酸含量的培养方法是实现海洋微藻产 业化生产多不饱和脂肪酸的基础。
【发明内容】
[0005] 本发明是在反应器培养的过程中，仅通空气提高金藻油脂含量和多不饱与脂肪酸 产量的培养方法。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用的培养方法包括W下步骤：
[0007] 1)藻种培养于锥形瓶中，培养至指数生长期使用；
[0008] 2)将指数生长期的藻细胞接种于灭菌的F/2培养基中，通空气培养至平台期收获 藻细胞，测定干重；
[0009] ：3)总脂测定：氯仿-甲醇-水法测定（参考文献；[l]Bli曲EG，Dyer WJ.A r曰pid method of total lipid extraction 曰nd puri円c曰tion[J]. C曰n曰di曰n Journal of Biochemistry and Physiology, 1959, 37(8):911 - 915. )〇
[0010] 4)脂肪酸成分分析；将收获的藻细胞烘干得藻粉，采用酸催化转醋化法，气质联 用方法对金藻脂肪酸成分进行测定（参考文献：[2]冯迪娜，艾江宁，刘亚男，等.含氮 类培养基对海洋微藻Isochrysiszhanjiangensis油脂与碳水化合物积累的影响[J].中国 生物工程杂志，2011，31 (10) :29-34.)。
[0011] 培养参数：
[0012] 1)常规无额外〔化添加的空气，W恒定通气速率0. 16vvm~0. 24vvm培养金藻。
[0013] 2)反应器培养的第3天起每24h添加12. 5mg/L的氮元素（F/2培养基中的NaN〇3)。
[0014] 3)所述培养环境温度23~27°C，在反应器培养的24h内光强为25~55 μ mol. m2s 1，4她内光强为45~85 μ mol. m 2s i，72h内光强为85~140 μ mol. m 2s 1，7化~平台期 内光强为120~260 μ mol. m 2s 1。光暗比为14h: lOh。
[0015] 本发明的优点如下：
[0016] 1、此培养体系藻细胞的油脂产量、多不饱和脂肪酸含量及产量，与通c〇2的培养体 系达到相当的水平，其中油脂含量提高30% W上。
[0017] 2、培养过程中仅通空气，无额外的C〇2通入，但可达到相同的效果，降低成本。
【附图说明】：
[001引 图1.金藻生长曲线图；
[0019] 图2.培养体系氮含量消耗曲线图。
【具体实施方式】
[0020] 实施例1 ;培养过程生长阶段判定
[0021] 每天用 Jasco V-530UV/VIS Spectrophotometer (JASC0, Tokyo, Japan)监测金藻 细胞数和氮消耗量：
[0022] 细胞数的测定：利用0D法，在680nm处测定培养系统中的金藻吸光度，利用公式 "细胞密度（Xl〇4cells/mL) = (0DewX 1250-90. 125) X稀释倍数"计算出对应的细胞密度。 绘制生长曲线，W判定细胞生长至稳定期。不同培养条件下，金藻的生长曲线见图1。
[0023] 培养体系氮测定；含量具体计算公式为；（0〇22。-〇〇27日）X6. 5397-0. 6642,（0〇22〇和 〇〇27日分别为220皿和275皿处的吸光值），见图2。
[0024] 实施例2营养盐及培养基配制 [00巧]无娃酸盐的F/2营养盐母液配制：
[002引 （1)氮源；称取75g NaN03溶于1L去离子水；
[0027] 似磯源：称取5g NaH2P〇4 · &0溶于1L去离子水；
[0028] (3)金属元素：分别称取 3. 15g 化CI3 · 6&0, 4. 36g 胞2邸TA, 0. 0098g CuS04·5H20,0.0063g化2Mo04·2H20,0.022gZnS04·7H20,0.01gCoCl2·細20,0.18g MnClz · 4&0溶于1L去离子水；
[0029] (4)维生素；0.0 Olg vitamin Bi2, 0. 2g vitamin Bi, 0.0 Olg D-生物素，溶于 1L 去 离子水；
[0030] F/2培养基的制备：
[0031] 天然海水经莫氧杀菌，两层0.45μm醋酸纤维滤膜过滤，ll(rC灭菌15min，冷却后 备用；向海水中添加上述（1)，（2)，（3)，（4)制得的无娃酸盐的F/2营养盐，其中氮源、磯源、 金属元素各1血/L，维生素0. 5血/L。
[0032] 实验所用甘油：分析纯甘油与经0. 45 μ m醋酸纤维滤膜过滤的海水W体积比1 ;1 混匀，12rC灭菌20min后冷却，常温保存。
[003引实施例3 ;金藻培养
[0034] 采用实施例2中的F/2培养基，W等鞭金藻化zhangjiangensis)0D6s。= 0. 1~ 0. 2、藻液体积约1. 5~2.化接种于化Η角瓶，用日光灯做光源，光强为30~40 μ mol. m 2s 1，培养3~5天至指数生长期；离必（3000~4000巧m，3~5min)，收获藻细胞，弃上清 液，沉淀中添加约3~5mL灭菌的海水，使之重新悬浮，加至F/2培养基中，该培养基浓度为 3倍实施例1所述F/2培养基，即氮源、磯源、金属元素、微量元素各添加常规F/2营养盐的 3倍，调至孤ew = 0. 28~0. 32, 500血藻液接种于60