膜分选培养器、膜分选培养试剂盒、和使用其的干细胞分选方法、以及分离膜的制作方法

膜分选培养器、膜分选培养试剂盒、和使用其的干细胞分选方法、以及分离膜的制作方法
【专利摘要】膜分选培养器1，其含有上部结构体10和下部结构体13，所述上部结构体10由至少一部分含有具有干细胞透过用孔121的膜12的容器构成，所述下部结构体13由保持使所述上部结构体的膜浸渍于其中的量的流体的容器构成；膜分选培养试剂盒，其含有上述膜分选培养器1和细胞迁移因子；干细胞分选方法，其包括将样本细胞或样本组织接种于所述上部结构体10的膜12的步骤、将含有细胞迁移因子的培养基填充于所述下部结构体13的步骤、和使所述上部结构体10的膜12与所述下部结构体13中的培养基接触的步骤；以及分离膜，其是具备基材膜和功能层的分离膜，所述基材膜由疏水性聚合物构成，所述功能层是选自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的1种以上亲水性聚合物通过共价键键合于所述基材膜的表面而成的功能层，构成所述功能层的亲水性聚合物的重量为所述分离膜总重量的1.5重量%至35重量%。
【专利说明】膜分选培养器、膜分选培养试剂盒、和使用其的干細胞分选方法、以及分离膜
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于分选任意生物种类的干细胞和牙髓干细胞的膜分选培养器、膜分选培养试剂盒、和使用其的干细胞分选方法。本发明特别涉及用于分选为了牙髓再生而填充于根管中的牙髓干细胞或间充质干细胞的膜分选培养器、膜分选培养试剂盒和使用其的干细胞分选方法。本发明还涉及分离膜、表面改性方法和利用其的分离膜的制造，提供不损害分离性能而将由疏水性聚合物构成的膜亲水化以抑制将细胞透过分离时对膜的粘附的分离膜。因此，本发明适用于以血液净化领域、再生医疗为中心的细胞分离纯化领域中。另外，聚合物表面改性方法可以简便地进行仅聚合物表面的改性，由于同时还可进行灭菌处理，因而与以往方法相比可有助于生产效率化。
【背景技术】
[0002]现在，拔髓治疗或感染根管治疗的生物学根管填充材料中所用的牙髓干细胞是血管新生能力、神经再生能力和牙髓再生能力优异的级分。主要使用的是来源于牙髓的CD31-SP (边缘群)细胞、CD105+细胞或CXCR4+细胞等。SP细胞是用Hoechst33342标记，并通过流式细胞仪用Hoechst Blue和Hoechst Red来对强烈排出该色素的级分进行分选，大量含有干细胞。然而，由于H0echst33342是DNA结合色素，而且必须使用流式细胞仪，因而人们认为在细胞的安全性方面存在问题。
[0003]另ー方面，开发有在使用针对干细胞特异性膜表面抗原的抗体时，不使用流式细胞仪而使用磁珠的方法。例如，作为骨髄干细胞，已知CD34或CD133抗体珠，但需要一定程度的组织细胞量。所以，不适于从牙髓组织进行分选的情形。另外，人牙髓的情形中，CD34阳性细胞和CD133阳性细胞分别为牙髓样本细胞的0.01%和0.5%，基本不存在，因而现存(市售)的磁珠法不适合。对CD105或CXCR4的抗体珠来说，由于是定制品，因而有可能非常昂贵。另外，作为从脂肪组织分离干细胞的仪器，在临床上已经使用了以利用酶消化法和离心分离法的细胞分离为基本的Celution 800/CRS系统，但需要大量组织，所得细胞为异源群体且多含前体细胞，而且昂贵。进而，作为从骨髄组织分离干细胞的仪器，商品化有BoneMarrow MSC Separation Device。据说其通过用由人造丝和聚乙烯形成的纤维来捕获骨髄间充质细胞，从而可在短时间(20分)内采集干细胞，比较廉价，但却需要比较大量的骨髄组织(髄液)，所得细胞仍然为异源群体且多含前体细胞。因此，不使用酶消化法而从固体的组织分选干细胞并使之増殖的装置尚未发明。
[0004]另外作为膜分选器，可以将作为上部结构的插入式细胞培养皿(CellcultureInsert)(聚碳酸酯膜(Polycarbonate Membrane)Transwell(注册商标)Inserts、2 X IO5孔/cm2、孔尺寸8 ii m、底面的直径6.4 mm、开ロ部的直径11.0 mm、高度17.5 mm) (Corning)插入作为下部结构的24孔板(直径15.0 mm、开ロ部的直径15.0 mm、高度22.0 mm)(Falcon)来使用。然而，对于PET膜或聚碳酸酯膜来说，细胞的附着多，无法有效地进行向下层的迁移。进而，由于是开放形状，因而微生物所致的污染的危险大，无法保证细胞的安全性。
[0005]因此，需要开发廉价且有效地从人牙髓组织或人牙髓细胞分选干细胞的方法。
[0006]迄今为止，已知可以将骨髄中存在的CXCR4+细胞、C-MET+细胞或LIF-R +细胞分别利用其配体SDFl、HGF或LIF的浓度梯度，通过迁移趋化效果而浓缩为骨髄的干细胞(非专利文献I)。
[0007]另外，已知可以将骨髄、末梢血和脐带血的干细胞(CXCR4 +/IirT/⑶133 + /⑶45 +细胞的造血干细胞和CXCR4 + /lin7⑶133 + /⑶45—细胞的间充质干细胞)通过SDFl的浓度梯度同样地浓缩(非专利文献2)。此时,在现成的Costar Transwell 24-孔的5iim孔径(孔尺寸)的滤器下部的腔室中装入SDF-1，在上部装入欲要浓缩的细胞。然而，考虑安全性吋，由于SDF-1还未受到药事认可，因而期望使用替代SDF-1的安全且有效的迁移因子。
[0008]另外，作为对骨髄干细胞的迁移有效的因子，已知来源于血小板的鞘胺醇-1-磷酸(SlP)(非专利文献3)，作为对脂肪干细胞的迁移有效的因子，已知原儿茶酸(非专利文献4)。但是，仍然尚未解決安全性的问题。进而，还已知血管新生神经再生和牙髓再生能力优异的牙髓CD31_SP细胞相对于SDF-1或VEGF迁移(非专利文献5)。但是，目前对SDF-1以外的血管新生神经再生和牙髓再生能力优异的牙髓干细胞的分选有效的迁移因子并不明确。
[0009]能够安全且实用地分选牙髓干细胞的膜分选培养器和迁移因子受到需求。另外，在人干细胞之外，各种生物种类中由干细胞分化诱导各组织的机理的阐明在生物学研究中受到追求。伴随再生医疗的进展，能够简便且稳定地分选干细胞的膜分选培养器和迁移因子受到期待。
[0010]对于与体液、血液或细胞接触的医疗用的分离膜，若蛋白质或血小板、细胞等附着则分离膜的性能降低、或成为引起机体反应的原因，细胞自身的吸附也受到促进等，要解决的问题多。另外，浄水器等的水处理膜中，蛋白质或有机物的附着会引起分离膜的性能降低。对于上述问题，尝试了通过将分离膜亲水化来解决，进行各种研究。例如，公开了使作为亲水性高分子的聚乙烯基吡咯烷酮与由聚砜形成的膜在制膜原液的阶段混合并进行成形，由此对膜赋予亲水性以抑制污垢的方法(专利文献I)。然而，这些方法中，对表面赋予亲水性时受到下述制约:需要增多制膜原液中的亲水性高分子的量、或者限干与作为基材的高分子具有相容性的亲水性高分子、或者对应于材料的使用用途必需研究最适的原液组成
坐寸O
[0011]另外，专利文献2中公开了将聚乙烯醇缩醛二乙基氨基こ酸酯和亲水化试剂涂布于膜来实现亲水化的方法。该方法中，有可能聚乙烯醇缩醛二乙基氨基こ酸酯被覆亲水化试剂、非附着相关的效果·骤減。另外，由于使膜浸溃于聚乙烯醇缩醛二乙基氨基こ酸酯和亲水化试剂的各溶液中，因而膜的分离性能也有可能降低。
[0012]公开了通过高能射线使要进行水不溶化的聚乙烯基吡咯烷酮等亲水性成分水不溶化并导入所形成的膜中的方法(专利文献3)、或使聚砜系的分离膜与聚乙烯基吡咯烷酮等亲水性高分子溶液接触后、通过放射线交联而形成不溶化的被膜层的方法(专利文献4)。然而，聚乙烯基吡咯烷酮等水性高分子和聚砜系高分子由于分子间的相互作用弱，因而存在难以形成被膜层的问题。
[0013]因此，公开了使一定范围的皂化度的聚乙烯醇水溶液与聚砜系分离膜接触，通过聚砜和こ酸乙烯酯的疏水性相互作用而有效地形成膜表面的被膜层的方法(专利文献5)。然而，该文献并非关于附着抑制的方法，因而本发明人的研究结果得知，若将聚乙烯醇单纯地被覆于分离膜，则分离膜的性能降低显著。另外，已知聚乙烯醇的羟基在与血液接触时容易将补体活化。
[0014]进而，据说即使用聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇之类的亲水性高分子被覆材料表面，附着抑制效果也仅能暂时性地抑制(非专利文献6)。即，尚未确立用高性能的分离膜来满足血液适合性的分离膜组件。
[0015]现有技术文献 专利文献
专利文献1:日本特公平2-18695号公报 专利文献2:日本特开平8-131791号公报 专利文献3:日本特公平8-9668号公报 专利文献4:日本特开平6-238139号公报 专利文献5:日本特开2006-198611号公报 非专利文献
非专利文献 I:Kucia M., et al., Arch.1mmunol.Ther.Exp.2006
非专利文献 2:Baumert B.et al., Folia Histochemica Et Cytobiologica 2008
非专利文献 3:Meriane M., et al., Stem Cells 2006
非专利文献 4:ffang H., et al., Eur.J.Pharmacol.2008
非专利文献 5: 1hara K.et al., STEM CELLS Volume 26, Issue 9, pages2408-2418, September 2008
非专利文献6:医疗ナ ノテクノロジー杏林图書ppll5-116。

【发明内容】

[0016]发明要解决的技术问题
以往的流式细胞仪或磁抗体珠法无法成为满足临床使用基准(药品和准药品的制造管理和品质管理的基准相关的部令(医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理の基準に閨する省令)(GMP))的安全且高效、廉价的分选方法。本发明是鉴于上述问题而完成的发明，其目的在于针对牙髓再生治疗和其它再生治疗提供不使用流式细胞仪或磁抗体珠而由少量的组织也可以安全、高效且廉价地得到所期望的干细胞的培养器、用于其的迁移因子以及干细胞分选方法。进而，其目的在于提供能够适用于所有生物种类的干细胞(胚胎干细胞、iPS细胞和组织干细胞)的分选的膜分选培养器、膜分选培养试剂盒和干细胞分选方法。
[0017]本发明的进ー步的目的在于提供改良了分离膜相关的现有技术的缺点，具有能够在通常的细胞培养用孵育器、洁净台中使用的紧凑性，改良了基于孔径的过滤性能以及表面亲和性的高性能的分离膜。
[0018]用于解决技术问题的方法
本发明人为了达成上述课题而进行了深入研究，结果发现，利用细胞迁移因子的浓度梯度，可以使干细胞从膜上部至膜下部选择性地通过，可以分选干细胞，从而完成了本发明。所以，根据ー个方式，本发明是膜分选培养器，其含有上部结构体和下部结构体，所述上部结构体由容器构成，该容器的底面的至少一部分用具有干细胞透过用孔的分离膜形成，所述下部结构体由容器构成，该容器保持使所述上部结构体的膜浸溃于其中的流体。
[0019]优选的是所述分离膜具备基材膜和功能层，所述基材膜由疏水性聚合物构成，所述功能层是选自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的I种以上的亲水性聚合物通过共价键键合于所述基材膜的表面而成的功能层，构成所述功能层的亲水性聚合物的重量为所述分离膜总重量的1.5重量％至35重量％。
[0020]优选的是所述孔的尺寸为3 iim~lOiim，密度为I X IO5~4X IO6孔/cm2。
[0021]优选的是具备多个所述上部结构体，并进一歩含有框体，所述框体容纳于所述下部结构体中、且具备设置有将该多个上部结构体的各个固定的多个孔的板状构件。
[0022]或者优选的是具备多个所述上部结构体，并进一歩含有框体，所述框体容纳于所述下部结构体中、且具备设置有将该多个上部结构体的各个固定的多个孔的板状构件，所述下部结构体由于所述该多个上部结构体的各个对应的多个容器构成。
[0023]或者还优选所述多个上部结构体具有不同孔尺寸和/或不同孔密度的膜。
[0024]优选进一歩含有盖状结构体，所述盖状结构体可覆设或密封上述上部结构体和下部结构体。
[0025]优选所述盖状结构体进ー步含有具备气体导入口和气体排出ロ的气体交換装置。
[0026]优选所述盖状结构体的至少一部分是由具有孔尺寸I~IOOnm的孔的膜形成的。
[0027]优选在所述盖状结构体和所述下部结构体之间设置有密封用的弾性体。
[0028]优选进一步具备温度调节系统，该温度调节系统含有温度測定装置和温度调节装置。
[0029]优选所述下部结构体进ー步含有具备培养基导入口和培养基送出ロ的培养基交换系统。
[0030]根据另一方面，本发明是膜分选培养试剂盒，其含有前述任ー项中所述的膜分选培养器、和用于注入所述下部结构体的细胞迁移因子。
[0031]优选所述细胞迁移因子是选自SDF-1、G-CSF、bFGF、TGF-P、NGF、PDGF、BDNF、ffl)NF、EGF, VEGF, SCF, MMP3、Slit、GM-CSF, LIF、HGF, SIP、原儿茶酸、和血清中的ー种以上。
[0032]优选所述细胞迁移因子的浓度为lng/ml~500ng/ml。
[0033]优选进一歩含有用于注入所述下部结构体的血清，所述细胞迁移因子为G-CSF或bFGFo
[0034]根据又一方面，本发明是使用上述任一膜分选培养器的干细胞分选方法，其包括:将样本细胞或样本组织接种于所述上部结构体的膜的步骤、将含有细胞迁移因子的培养基填充于所述下部结构体的容器的步骤、和使所述上部结构体的膜与所述下部结构体中的培养基接触的步骤。
[0035]优选所述细胞迁移因子是选自SDF-1、G-CSF、bFGF、TGF-P、NGF、PDGF、BDNF、ffl)NF、EGF, VEGF, SCF, MMP3、Slit、GM-CSF, LIF、HGF, SIP、原儿茶酸、和血清中的ー种以上。
[0036]优选所述细胞迁移因子的浓度为lng/ml~500ng/ml。
[0037]优选将所述样本细胞以相对于分离膜Imm2为3 X IO2细胞~3 X IO4细胞进行接种。
[0038]另外，本发明为上述的干细胞分选方法，其中，所述干细胞为牙髓干细胞，所述细胞迁移因子为G-CSF或bFGF，所述G-CSF或bFGF的浓度为50~150ng/ml，将所述样本细胞以相对于分离膜Imm2为3X IO2~1.5X IO3细胞进行接种，或将前述样本组织以相对于分离膜Imm2为0.1mg~Img进行静置，在所述含有细胞迁移因子的培养基中添加相对于该培养基的体积为5~20vol%的血清。
[0039]另外，本发明为上述的干细胞分选方法，其中，所述干细胞为骨髄干细胞或脂肪干细胞，所述细胞迁移因子为G-CSF或bFGF，所述G-CSF或bFGF的浓度为50~150ng/ml，将所述样本细胞以相对于分离膜Imm2为3X IO2~1.5X IO3细胞进行接种，或将前述样本组织以相对于分离膜Imm2为0.1mg~Img进行静置，在所述含有细胞迁移因子的培养基中添加相对于该培养基的体积为5~20vol%的血清。
[0040]进ー步地，本发明人为了实现与分离膜相关的上述课题而进行了深入研究，结果发现血液适合性优异、蛋白质或有机物的附着少的本发明的分离膜和分离膜组件通过下述的构成得以实现。
[0041]即，根据其它的方式，本发明为一种分离膜，其具备基材膜和功能层，所述基材膜由疏水性聚合物构成，
所述功能层是选自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的I种以上的亲水性聚合物通过共价键键合于所述基材膜的表面而成的功能层，其中，构成所述功能层的亲水性聚合物的重量是所述分离膜总重量的1.5重量％至35重量％。
[0042]优选的分离膜中，所述基材膜具有I~IOym的孔，并用于细胞分离。
[0043]优选所述疏水性聚合物选自砜系聚合物、酰胺系聚合物、碳酸酯系聚合物、酯系聚合物、氨基甲酸酯系聚合物、烯烃系聚合物和酰亚胺系聚合物中。
[0044]优选前述任一项所述的分离膜是用于将细胞透过分离。
[0045]根据其它方面，本发明是上述任一项所述的分离膜的制造方法，其具备:将吸水率为2%以下的由疏水性聚合物构成的基材膜浸溃于含有10~2000ppm的选自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的I种以上亲水性聚合物、且含有0.01~0.2%的醇的处理水溶液中的浸溃步骤、和对所述基材膜照射高能射线，将膜表面改性为蛋白附着抑制性、细胞附着抑制性的改性步骤。
[0046]或者，本发明是上述任一项所述的分离膜的制造方法，其具备:将吸水率超过2%的由疏水性聚合物构成的基材膜浸溃于含有10~2000ppm的选自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的I种以上亲水性聚合物的水溶液中的浸溃步骤、和对所述基材膜照射高能射线，将膜表面改性为蛋白附着抑制性、细胞附着抑制性的改性步骤。
[0047]优选所述疏水性聚合物选自砜系聚合物、酰胺系聚合物、碳酸酯系聚合物、酯系聚合物、氨基甲酸酯系聚合物、烯烃系聚合物和酰亚胺系聚合物中。
[0048]根据其它方面，本发明为成形体的表面改性方法，其具备:将吸水率为2%以下的成形体浸溃于含有10~2000ppm的选自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和こ烯醇系聚合物中的I种以上亲水性聚合物、且含有0.01~0.2%的醇的处理水溶液中的浸溃步骤、和对所述成形体照射高能射线，将成形体表面改性为蛋白附着抑制性、细胞附着抑制性的改性步骤。
[0049]或者本发明为成形体的表面改性方法，其具备:将吸水率超过2%的成形体浸溃于含有10~2000ppm的选自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的I种以上亲水性聚合物的水溶液中的浸溃步骤、和对所述成形体照射高能射线，将成形体表面改性为蛋白附着抑制性、细胞附着抑制性的改性步骤。
[0050]另外，本发明还是使用这些成形体的改性方法来制造上述任一项所述的分离膜的方法。
[0051]发明效果
根据本发明，使用膜分选培养器和细胞迁移因子，即使是由少量的细胞也可以安全、高效且廉价地分选干细胞。另外，通过对应于细胞的大小来选择透过用孔的适合尺寸，可以广泛用于所有生物种类的干细胞分选。或者，通过选择适合的迁移因子，可以应对包括胚胎干细胞、iPS细胞和组织干细胞的所有干细胞的分选。进而，通过改变膜分选培养的分离膜的数量，还可以应对各种组织细胞量。通过使上部结构体和下部结构体为完全密封型，可以对应GMP，分选能在临床上实际使用的干细胞。进而，本申请发明的膜分选培养器无论是作为实验用还是作为临床用，均可广泛使用，极大地有助于再生医疗的发展。作为膜分选细胞的进一步的优点，特别是对于中老年人来说，膜分选的干细胞的扩增所伴随的表型变化(phenotypical change )少。伴随扩增，由于难以变老、难以老化，因而在临床使用中可以有效地发挥功能。另外，作为膜分选器的进ー步的优点，不仅可以从细胞、而且从组织也可分选干细胞，而不用预先通过酶消化等来分散细胞，这使得可以节约酶消化的时间和通过不使用酶来确保安全性。
[0052]另外，本发明的分离膜是在分离细胞时抑制细胞发生粘附而使分离效率降低的分离膜，其特征在干，以聚合物状局部化于分离膜功能层的表面。可适宜地用于抑制未向制膜原液中混合亲水性聚合物而进行成型得到的分离膜、例如使电子射线透过而形成孔的膜表面的蛋白质或细胞附着性。
【专利附图】

【附图说明】
[0053][图1]第一实施方式的膜分选培养器`的模式图。
[0054][图2]第二实施方式的膜分选培养器的模式图。
[0055][图3]示出第三实施方式的膜分选培养器的构成的模式图。
[0056][图4]示出第四实施方式的膜分选培养器的构成的模式图。
[0057][图5]不出第五实施方式的膜分选培养器的构成的模式图。
[0058][图6]Ca)是利用TaxiScan来显示细胞迁移因子所致的狗⑶105阳性细胞的迁移的差异、时间历程的图，(b)是利用TaxiScan来显示细胞迁移因子G-CSF的各种浓度所致的狗⑶105阳性细胞的迁移的差异的图。
[0059][图7]Ca)是利用TaxiScan来显示胎牛血清浓度变化所致的人牙髓样本细胞的迁移的差异、时间历程的图，(b)是利用TaxiScan来显示与胎牛血清相比的细胞迁移因子G-CSF和SDF-1 (最终浓度100ng/ml)所致的人牙髓样本细胞的迁移的差异的图。
[0060][图8]Ca)是示出使用本发明的膜分选培养器(2X IO5孔/cm2、孔尺寸为3 y m)，将IX IO5细胞/250 的狗新鲜初代牙髓细胞接种于分离膜上部，在分离膜下部结构体中于含10%狗血清的DMEM中加入G-CSF 100ng/ml，6小时后更换培养基除去G-CSF并进ー步培养I天后的牙髓干细胞的图，(b)是示出使用本发明的膜分选培养器(2X IO5孔/cm2、孔尺寸为3 i! m)，将I X IO5细胞/250 U I的狗新鲜初代牙髓细胞接种于分离膜上部，在分离膜下部结构体中于含10%狗血清的DMEM中加入G-CSF 100ng/ml,6小时后更换培养基，除去G-CSF并进ー步培养7天后的牙髓干细胞的图，(c)是示出使用本发明的膜分选培养器(2X105孔/cm2、孔尺寸为3iim)，将I X IO5细胞/250 的狗新鲜初代牙髓细胞接种于分离膜上部，在分离膜下部结构体于含10%狗血清的DMEM中加入SDF-1 100ng/ml，6小时后更换培养基，除去SDF-1并进ー步培养I天后的牙髓干细胞的图。
[0061][图9](a)是示出使用本发明的膜分选培养器和G-CSF进行分选培养得到的牙髓干细胞的第5代的试验管内的血管诱导能力的图，(b)是示出使用本发明的膜分选培养器和G-CSF进行分选培养得到的牙髓干细胞的第5代的试验管内的神经球(neurosphere)形成能力的图。[0062][图10]Ca)是示出将使用本发明的膜分选培养器和G-CSF进行分选培养得到的牙髓干细胞移植至狗拔髓后的根管内，14天后的牙髓再生的图，(b)是(a)的B所示位置的高倍图，(C)是(a)的C所示位置的高倍图，是示出沿根管内再生牙髓的牙本质侧壁分化并排列的成牙本质细胞的高倍图。(d)是示出相同年龄、相同部位的狗的正常牙髓的图。
[0063][图11]是示出使用本发明的膜分选培养器(2X105孔/cm2、孔尺寸为3i!m)，将IXlO5细胞/250 Ul的人新鮮初代牙髓细胞接种于分离膜上部，在分离膜下部结构体中于含10%人血清的DMEM中加入G-CSF 100ng/ml，6小时后更换培养基，除去G-CSF并进ー步培养8天后的人牙髓干细胞的图。
[0064][图12](a)是示出使用本发明的膜分选培养器(I X IO5孔/cm2、孔尺寸为8 U m),将IX IO5细胞/IOOiil的人新鮮初代牙髓细胞接种于分离膜上部，在分离膜下部结构体中加入含10%人血清的DMEM，22小时后更换培养基，并进ー步培养3天后的分选得到的人牙髓干细胞的图，(b)是示出使用相同的膜分选培养器，将I X IO5细胞/100 u I的人新鮮初代牙髓细胞接种于分离膜上部，在分离膜下部结构体中于含10%人血清的DMEM中加入G-CSF10ng/ml，22小时后更换培养基除去G-CSF并进ー步培养3天后的人牙髓干细胞的图，(c)是示出使用相同的膜分选培养器，将IXlO5细胞/IOOiU的人新鮮初代牙髓细胞接种于分离膜上部，在分离膜下部结构体中于含10%人血清的DMEM中加入G-CSF 100ng/ml，22小时后更换培养基除去G-CSF并进ー步培养3天后的人牙髓干细胞的图。(d)是示出(a)的10%人血清的培养7天后的人牙髓干细胞的图。(e)是示出(c)的G-CSF 100ng/ml的培养7天后的人牙髓干细胞的图。
[0065][图13](a)是示出使用本发明的膜分选培养器(I X IO5孔/cm2、孔尺寸为8 U m),将IX IO5细胞/IOOiil的猪新鮮初代牙髓细胞接种于分离膜上部，在分离膜下部结构体中于含10%胎牛血清的DMEM中加入G-CSF 100ng/ml，22小时后更换培养基除去G-CSF并进ー步培养3天后的猪牙髓干细胞的图，(b)是示出替代(a)中的猪新鮮初代牙髓细胞而接种猪新鮮初代骨髄细胞，进行膜分选并培养3天后的猪骨髄干细胞的图，(c)是示出替代(a)中的猪新鮮初代牙髓细胞而接种猪新鮮初代脂肪细胞，并培养3天后的猪脂肪干细胞的图。(d)是示出接种(a)中的猪新鮮初代牙髓细胞，进行膜分选并培养8天后的猪牙髓干细胞的图。
[0066][图14]是示出取决于各种迁移因子的未分选的人牙髓样本细胞的迁移能力的比较的图。[0067][图15]是示出取决于制剂化的迁移因子和血清的人牙髓样本细胞的迁移能力的比较的图。
[0068][图16]是示出使用各种浓度的G-CSF进行分选得到的牙髓膜分选细胞的、取决于人血清的细胞増殖能力的比较的图。 [0069][图17]是示出使用各种浓度的G-CSF进行分选得到的牙髓膜分选细胞的、取决于100ng/ml的G-CSF的细胞增殖能力的比较的图。
[0070][图18]是示出使用各种浓度的G-CSF进行分选得到的牙髓膜分选细胞的、相对于G-CSF的细胞迁移能力的比较的图。
[0071][图19]是示出使用100ng/ml的G-CSF进行分选得到的牙髓、骨髄、脂肪膜分选细胞的、相对于胎牛血清的细胞増殖能力的、与样本细胞的比较的图。
[0072][图20]是示出使用100ng/ml的G-CSF进行分选得到的牙髓、骨髄、脂肪膜分选细胞的、相对于100ng/ml的G-CSF的细胞增殖能力的、与样本细胞的比较的图。
[0073][图21]是示出使用100ng/ml的G-CSF进行分选得到的牙髓、骨髄、脂肪膜分选细胞的、相对于G-CSF的迁移能力的、与样本细胞的比较的图。
[0074][图22]是示出第六实施方式的膜分选培养器的构成的模式图。
[0075][图23](a)是示出使用本发明的膜分选培养器(I X IO5孔/cm2、孔尺寸为8 U m),将2mg/200 u I的切碎的狗新鮮牙髓组织静置于膜上部，并在膜下部结构体中于含10%血清的DMEM中加入G-CSF 100ng/ml,24小时后的牙髓干细胞的图，(b)是示于与(a)同样地将2mg/200ul的切碎的狗新鮮脂肪组织静置于膜上部，并在膜下部结构体中于含10%血清的DMEM中加入G-CSF 100ng/ml,24小时后的脂肪干细胞的图。
【具体实施方式】
[0076]以下參照附图详细地说明本发明。但以下说明并不限定本发明。
[0077](第I实施方式)
本发明的第I实施方式的膜分选培养器I由上部结构体10和下部结构体13构成。上部结构体10是用于加入含有样本细胞200或样本组织的培养基100，并将样本细胞200或样本组织保持在分离膜12上的结构体。另ー方面，下部结构体13是用于加入含有迁移因子(未图示)的培养基300，并接收迁移的干细胞的结构体。
[0078]上部结构体10是由侧面部11和圆形的底面部构成的容器,底面部由具有多个孔121的分离膜12形成。上部结构体10只要其内部可以容纳培养基100和样本细胞200或样本组织即可。本说明书中，样本细胞是指通过酶处理从组织将细胞间的粘附解散且未进行分选的细胞。或者是指传代并分散的细胞。例如，优选可以容纳100~250iU左右的培养基100和样本细胞200的容器。样本组织是指切碎的但未进行酶消化处理的未分散的组织。
[0079]构成上部结构体10的底面的分离膜12具有用于使干细胞透过的多个孔121。孔尺寸为I U m~100 V- m、优选为3 ii m~10 y m、进一步优选为5 y m~8 y m。这是为了使干细胞能够通过。另外，孔密度为2.5 X IO3~2.5 X IO7孔/cm2、优选为I X IO5~4X IO6孔/cm2。为了使干细胞能够高效地通过，开孔率可以尽可能地高。
[0080]作为分离膜12的材料，优选使用以PET、聚碳酸酷、聚砜、聚丙烯、聚偏氟乙烯、聚酰胺等疏水性聚合物为基材的材料。另外，分离膜12的厚度优选为10~100 u m、进ー步优选为10~25 ii m。这是为在干细胞迁移时,特别是在干细胞通过孔时,不对干细胞表面造成损伤。
[0081]对于分离膜12，为了形成为细胞非粘附性，优选为利用涂覆剂对分离膜表面进行了涂覆的分离膜。特别地，可以在在接种样本细胞200或样本组织时，向作为与样本细胞200或样本组织接触的面的、上部结构体10的内侧的面适用涂覆剂。作为涂覆剂，可使用已知的细胞非粘附性的涂覆剂，例如，将环氧乙烷/环氧丙烷共聚物(旭电化工业(旭電化工業)株式会社的商品名:Pluronic F108)、聚甲基丙烯酸2-羟基こ酯以达到5mg/ml的方式溶解于 95% こ醇中而得的涂覆剂(Folkman J & Moscona A, Nature 273:345-349,1978、日本特开平8-9966号公报等)、分支聚亚烷基二醇衍生物(W02009/072590)等，但并不限定于此。可以使用任意的细胞非附着性的涂覆剂。涂层厚度只要是足以对PET、聚碳酸酷、聚偏氟乙烯等基材膜赋予细胞的非粘附特性的范围即可。这样的厚度也根据涂覆剂的种类而不同，例如，优选为10~100 iim，进ー步优选为10~25iim。
[0082]对分离膜12的特别优选的修饰方法进ー步进行说明。上述使用涂覆剂的方法中，由于有可能使分离膜的孔闭塞、或因水系培养液而发生溶出等有机溶剂残存造成对细胞的不良影响，因而优选进行以下所述的利用共价键合法的分离膜表面修饰。
[0083]即，将所期望的孔径且以高开孔率开ロ的由疏水性聚合物构成的基材膜浸溃于添加有乙烯基吡咯烷酮系聚合物、乙二醇系聚合物和/或乙烯醇系聚合物、和根据需要的醇的处理水溶液中后，照射高能射线，由此进行表面修饰，制造分离膜。
[0084]聚乙烯基吡咯烷酮系聚合物是指选自聚乙烯基吡咯烷酮、乙烯基吡咯烷酮こ酸乙烯酯共聚物、乙烯基吡咯烷酮乙烯醇共聚物、乙烯基吡咯烷酮苯乙烯共聚物、乙烯基吡咯烷酮二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯共聚物和它们的改性聚合物中的聚合物，乙二醇系聚合物也包括侧链含有酯基的那些。乙烯醇系聚合物可根据皂化度而获得各种种类，并无限定。其中，这些膜表面修饰聚合物优选为水溶性。因此，例如，可以使用数均分子量为I万至100万的聚合物，但只要·为水溶性则并不限于上述分子量。该处理水溶液中的聚吡咯烷酮系聚合物的浓度优选为10~5000ppm。若浓度变高，则有时会闭塞孔，因而更优选为10 ~2000ppmo
[0085]另外，为了有效地进行基材膜的表面修饰，在基材膜的吸水率为2%以下时，优选在该处理水溶液中进ー步添加醇。应予说明，基材膜的吸收率是指，将IOOym以下的膜厚的基材膜浸溃于23°C水中24小时，測定重量増加量，将该重量増加率的值定义为吸水率。
[0086]作为在吸水率为2%以下时添加的醇，若考虑残留时的安全性，则优选为こ醇，但并不限定于此。相对于处理水溶液的重量，醇的浓度优选为I重量％以下，为了安全则为0.5重量％以下、进ー步优选为0.1重量％以下。
[0087]作为高能射线，可使用UV、电子射线、Y射线中的任一者，电子射线或Y射线容易提高反应率，因而更优选。照射的射线量优选为5~35kGy，特别是将培养装置整体用例如相当于被视为灭菌射线量的25kGy的射线量进行照射，由此还可以同时实施表面修饰和灭菌。
[0088]这样得到的分离膜从细胞非附着性的观点来看是有用的，可以有效地用于本实施方式中的膜分选装置。[0089]作为上部结构体10的侧面部11的材料，可以使用通常用作细胞培养器的常规材料，可以设定为聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚苯乙烯、聚丙烯(PP)、聚碳酸酯等塑料制。
[0090]上部结构体10的尺寸并不限于特定的大小，例如，可将底面部的直径设为5~8mm。由侧面部11的上端规定的容器开ロ部的直径可以设为例如6~10mm。从底面部12至开ロ部的高度、即容器的深度可以设为例如10~15mm。应予说明，上述值为一例，本领域技术人员可以根据样本细胞、样本组织的种类、或收集的干细胞的种类等目的而适宜确定构成上部结构体10的容器的尺寸。
[0091]接着，下部结构体13是由底面部和侧面部构成、且上面具有开ロ部的容器。作为下部结构体13的材料，侧面和底面均可使用相同的材料，优选使用聚苯乙烯、玻璃等。这是为了赋予细胞附着性、细胞増殖性。应予说明，下部结构体不必将底面部和侧面部固定而成为一体，根据实施方式，也可以用与下部结构体不同的其它构件来构成下部结构体的底面部。
[0092]下部结构体13能够可装卸地装载上部结构体10。进行装载时，构成上部结构体10的容器的分离膜12容纳于下部结构体13中。这是为了在后述干细胞分选方法中，使加入下部结构体13的培养基和构成上部结构体10的分离膜12接触，从而细胞能够通过分离膜的两侧。在图示的实施方式中，分离膜12不与下部结构体13的底面相接，在分离膜12和下部结构体13的底面部之间形成有空隙。可以在该空隙填充培养基。
[0093]为了将下部结构体13与上部结构体10的装载时的位置关系固定，可以进一歩具有未图示的保持机构。保持机构可以设置于上部结构体10或下部结构体13的一方，也可设置于双方。作为保持机构，例如，可以是从上部结构体10的侧面上端或侧面的规定高度起、向开ロ部的外侧延伸的凸缘或爪状的构件。该保持机构与下部结构体13的侧面上端相接，可以将上部结构体10保持于规定的高度。作为保持机构的其它例子，可以是设置于上部结构体10，由上部结构体10的底面向下延伸的脚状的构件。该保持机构与下部结构体13的底面相接，可以将上部结构体10保持于规定的高度。此时，在下部结构体的底面上还可以设置嵌合于上述脚状的构件而进行固定的构件。
`[0094]作为下部结构体13的尺寸的一例，在与上述上部结构体10的尺寸的关系上，例如,可以将底面部的直径设为7~15mm。另外，由下部结构体13的侧面部的上端规定的容器开ロ部的直径的尺寸也可以同样设定。下部结构体13的深度优选比上部结构体10的深度更深，例如，可以设为11~20mm。
[0095]应予说明，本实施方式中，将具有圆形的底面和开ロ部、且底面的直径比开ロ部的直径更小的形状的上部结构体作为一例进行说明，但底面部12的形状并不限定于圆形，可以设为楕圆形、方形、多边形、或任意的形状。另外，底面部的尺寸和开ロ部的尺寸的关系也不限定于本实施方式所述，底面部和开ロ部的尺寸也可以相同。进而，对于上部结构体，只要其底面的至少一部分具有包含多个孔的分离膜，且可以在分离膜上接种并保持细胞，则可以构成为含有底面和侧面连续的球体的部分面。另外，本实施方式中，下部结构体13是以圆形为一例进行说明，但底面和开ロ部的形状并不限定于特定形状。进而，下部结构体不必是底面与侧面可以明确区别的结构体，也可以构成为含有底面和侧面连续的球体的部分面。
[0096]这样的膜分选培养器I可用于从包括哺乳类的任意的生物组织或细胞中分选干细胞。作为可分选的干细胞，可举出例如:胚胎干细胞、iPS细胞和组织干细胞。特别地，为了再生包括人的哺乳类的牙髓，可用于从牙髓细胞或间充质细胞分选牙髓干细胞或间充质干细胞。间充质干细胞包括例如:骨髄干细胞、脂肪干细胞、羊膜干细胞、脐带血干细胞。但是，本实施方式的膜分选培养器I的用途并不限于上述。
[0097]具体地，作为分选目标的前述牙髓干细胞或其它组织干细胞优选含有下述中的至少任ー种:来源于牙髓或其它组织(例如骨髄、脂肪组织、羊膜、牙根膜、滑膜、脐带)的CD105阳性细胞、CXCR4阳性细胞、SSEA-4阳性细胞、FLK-1阳性细胞、⑶31阴性且⑶146阴性细胞、⑶24阳性细胞、⑶150阳性细胞、⑶29阳性细胞、⑶34阳性细胞、⑶44阳性细胞、⑶73阳性细胞、⑶90阳性细胞、FLK-1阳性细胞、G-CSFR阳性、和SP细胞。前述SP细胞优选为下述中的任ー种:CXCR4阳性、SSEA-4阳性、FLK-1阳性、CD31阴性且CD 146阴性、CD24阳性、⑶105阳性、CD 150阳性、CD29阳性细胞、CD34阳性细胞、CD44阳性细胞、CD73阳性细胞、CD90阳性细胞、FLK-1阳性或G-CSFR阳性。
[0098]接着，从干细胞分选方法的观点来说明本实施方式的膜分选培养器I。干细胞分选方法包括:在上部结构体10的分离膜12上接种样本细胞200或样本组织的步骤、向下部结构体13注入含有细胞迁移因子的培养基300的步骤、和使分离膜12与培养基300接触的步骤。通过这些步骤，利用加入下部结构体13的细胞迁移因子的浓度梯度，可以选择性地使干细胞从分离膜12上部通过，可以分选干细胞。
[0099]在上部结构体10的分离膜12上接种样本细胞200或样本组织的步骤中，使可通过已知方法，例如，Nakashima, Archs oral Biol 36,1991获得的样本细胞200溶解于培养基100，并接种于上部结构体10的分离膜12上。作为用作干细胞的分选源的样本细胞200，可举出牙髓细胞或间充质细胞。间充质细胞包括来源于骨髄、脂肪组织、羊膜、牙根膜、滑膜、脐带的细胞，但并不限定于此。另外，在分选胚胎干细胞、iPS细胞时，作为用作分选源的样本细胞200，可以使用胚和胚泡、实施了基因导入或蛋白导入等的体细胞。使用样本组织时，切碎后浸溃于培养基，并静置于上部结构体10的分离膜12上。
[0100]样本细胞以相对于分离膜Imm2为3X IO2细胞~3X IO4细胞进行接种。例如，相对于直径6.5mm的分离膜，细胞密度优选为I X IO2细胞/100 ~I X IO7细胞/100 yl，进ー步优选为I X IO4细胞/100 ill~I X IO6细胞/100 yl。这是因为若细胞密度过低则难以増殖，若过高则难以迁移。应予说明，根据要分选的干细胞的种类，所需的样本细胞的量有所不同，例如，分选I X IO3细胞的牙髓干细胞时所需的来源于牙髓组织的样本细胞极其少量，为例如I X IO5细胞左右即可。特别地，分选牙髓干细胞时的最优选的样本细胞的密度为3 X IO2~1.5 X IO3细胞/mm2。另ー方面，分选等量的骨髄干细胞或脂肪干细胞时所需的样本细胞例如有时分别需要为3X IO5细胞和I X IO6细胞左右。另外，分选iPS细胞吋，样本细胞200的量根据导入效率而不同。这种所需的样本细胞的量对于本领域技术人员来说是已知的，可以适宜決定。另外，使用样本组织时，可以将样本组织以相对于分离膜Imm2为0.1mg~Img进行静置。
[0101]在向下部结构体13注入含有细胞迁移因子的培养基300的步骤中，使细胞迁移因子溶解于培养基并注入下部结构体13。加入下部结构体13的添加于培养基的细胞迁移因子优选为选自下述中的至少任ー者:SDF-1、G-CSF, bFGF、TGF-^、NGF, PDGF, BDNF,⑶NF、EGF、VEGF、SCF、MMP3、Slit, GM-CSF, LIF、HGF, SIP、原儿茶酸、和血清。特别地，从迁移活性和临床使用中的安全性的观点出发，最优选G-CSF或bFGF。另外，前述细胞迁移因子的浓度优选为lng/ml~500ng/ml。这是因为若过于稀薄则有时会没有迁移效果，若过浓则干细胞有可能发生分化。特别地，将G-CSF或bFGF用作细胞迁移因子吋，G-CSF或bFGF的浓度优选为50~150ng/ml,特别优选为约100ng/ml左右、例如95~105ng/ml。这是为了能够分选最多的干细胞，并且在分选得到的干细胞中，血管新生因子、神经营养因子的mRNA表达也达到高值。
[0102]作为使用的培养基，可以使用Dulbecco’ s改良Eagle培养基、EBM2等,但并不限定于此。可以是能够在干细胞的培养中使用的任意的培养基。培养基的量可根据下部结构体13的容量而适宜決定。在培养基中优选与细胞迁移因子一起添加血清。这是因为血清具有促进细胞迁移活性的效果。为了分选人干细胞，优选使用人血清，也可以使用胎牛血清。相对于培养基的体积，血清的添加量优选设为5~20vol%。
[0103]在使分离膜12与培养基300接触的步骤中，使上部结构体10层叠于下部结构体13，使分离膜12的外侧与培养基300充分接触。由此，可以产生细胞迁移因子的浓度梯度。作为其结果，样本细胞200或样本组织中的干细胞通过孔121，向下部结构体13迁移，从而可进行干细胞的分选。接触后的作用时间优选设为40~50小吋。
[0104]应予说明，上述中，采用向上部结构体10中加入样本细胞200或样本组织、向下部结构体13中加入含有细胞迁移因子的培养基、然后将上部结构体10装载于下部结构体、使分离膜12与培养基接触的方式进行了说明，但上述三步骤的顺序并无限定。组合上部结构体10和下部结构体13后，可以分别进行接种、注入，也可以实质上同时进行。
[0105]应予说明，该干细胞培养方法也可以不依赖于特定的容器形状而实施，此时，干细胞培养方法包括:使样本细胞或样本组织与具有孔的分离膜的细胞非粘附性的面接触的步骤、和使含有细胞迁移因子的培养基与前述分离膜的另一面接触的步骤。
[0106]根据本实施方式的·膜分选培养器I和使用其的干细胞分选方法，可以安全且有效地分选干细胞。
[0107]根据第二实施方式，本发明为具备气体交换系统和培养基交换系统的膜分选培养器。图2是本实施方式的膜分选培养器2的概念图。膜分选培养器2除了上部结构体20和下部结构体23之外，还含有盖状结构体24。
[0108]上部结构体20和下部结构体23的基本结构、材料和功能如第一实施方式中说明所述。本实施方式中，下部结构体23进ー步具备培养基导入口 231和培养基送出ロ 232。它们构成培养基交换系统。培养基导入口 231和培养基送出ロ 232是将下部结构体23的容器内部和外部连通的开ロ部。通过该开ロ部，可以将细胞迁移因子和/或含有分选的干细胞的培养基在下部结构体23和外部之间连通。即，可以从培养基送出ロ 232获得含有分选的干细胞的培养基d，可以从培养基导入口 231送入含有细胞迁移因子的新鲜培养基C。因此，培养基导入口 231和培养基送出ロ 232可以与未图示的管连接。通过这样的培养基的更换机构，从而具有下述优点:通过能够适应GMP的非开放体系(密封体系)从而避免细菌或病毒、支原体感染，安全性和效率得到提高。
[0109]另ー方面，盖状结构体24装载于上部结构体20，是覆盖上部结构体20的开ロ部和下部结构体23的开ロ部的盖状结构体。盖状结构体优选为与下部结构体23、或与上部结构体20和下部结构体23两者密合，将膜分选培养器2密闭而隔离外界空气。为了进行密闭，下部结构体23的侧面上端可以具备橡胶或有机硅制的垫片。
[0110]盖状结构体24进ー步具备气体导入口 241和气体排出ロ 242。它们构成气体交换系统。气体导入口 241和气体排出ロ 242是将盖状结构体的内部与外部连通的开ロ部。气体导入口 241和气体排出ロ 242可以与未图示的管连接。例如，可以从气体导入口 241向膜分选培养器2内部送入C02、N2等惰性气体a，从气体排出ロ 242排出含有CO2等的使用完的气体b。
[0111]盖状结构体24中，可以进一歩具备设置有孔尺寸为IOOnm以下、特别为I~lOOnm、优选为10~IOOnm的多个孔的有机硅膜。在盖状结构体中，有机硅膜可以以覆盖气体导入口 241和气体排出ロ 242的方式设置。这是为了隔绝来自外部的支原体的侵入路径。具备这样的气体交换系统24具有下述优点:通过能够适应GMP的非开放体系(密封体系)而使安全性、效率以及存活率提高。
[0112]本实施方式的膜分选培养器还可具备未图示的温度调节系统。温度调节系统由测定经密封的膜分选培养器2的内部的温度的温度測定装置、和从膜分选培养器2的外部对膜分选培养器2进行加热或冷却的加热冷却装置构成。通过具备温度调节系统，例如，对下部结构体23使用温度敏感性的培养基系统，也可以进行温度调节管理。
[0113]应予说明，本实施方式中，对具备培养基的更换机构和气体交换系统24两者的膜分选培养器2进行了说明，但本发明的膜分选培养器并不限定于此，也可以是具备任ー者的培养器。根据第2实施方式的膜分选培养器2，可以更安全、且以循环方式进行无需特别更换培养基的培养，可以高效地获得适于组织再生的干细胞。
[0114]根据第三实施方式，本发明是具备盖状结构体的膜分选培养器。图3是示出本实施方式的膜分选培养器3的构成的概念图。膜分选培养器3除了上部结构体30和下部结构体33之外，还含有盖状结构体34。
[0115]本实施方式中，上部结构体`30是由具有圆形底面的轴状部和具有开ロ部的圆锥台形部构成的ー个容器。上部结构体30构成为开ロ部的直径大于底面的直径。圆锥台形部的开ロ部具备由向外侧突出的凸缘构成的保持机构35。
[0116]图示的下部结构体33是具备直径相同的圆形底面和开ロ部的筒状构件。开ロ部附近具备沟，沟中保持有密封用的弾性体331。沟可以是一条也可以是两条。此时使用的密封用的弾性体的材质理想的是如有机硅橡胶等那样组成明确的合成橡胶等。另外，在圆筒的中央部附近、且在设置有弾性体331的沟和底面之间，具备由从圆筒的内壁面向内侧突出的凸缘构成的保持机构335。保持机构335与上部结构体30的保持机构35啮合，将上部结构体30保持于下部结构体33内部的规定位置。
[0117]上部结构体30和下部结构体33的上述以外的基本结构、材料和功能如第一实施方式中说明所述。
[0118]盖状结构体34是可以覆设或密封前述上部结构体30和下部结构体33的构件。盖状结构体34只要可以从上部结构体30的上方覆盖上部结构体30和下部结构体33的开ロ部即可，其材质为与第一实施方式中说明的下部结构体相同的材质。理想的是盖状结构体34中进ー步具备气体交换机构(未图示)。作为该气体交换机构，例如，可以是设置于盖状结构体34的整个面或一部分的孔尺寸为IOOnm以下、特别为I~lOOnm、优选为10~IOOnm的多个孔。作为其它例子，可以在盖状结构体34的至少一部分设置例如气体管道滤器用的四氟乙烯(PTFE)层合膜那样的基于高分子膜的气体透气膜。应予说明，盖状结构体34可以进ー步具备如第二实施方式中说明所述的气体导入口和气体排出ロ。
[0119]盖状结构体34与下部结构体33组合时，可以与保存于前述下部结构体33的沟的弾性体331密合。通过该构成，可简单地实施密封，通过进一歩具备气体交換功能(未图示)，则提供不对干细胞赋予压カ变化的结构。
[0120]具备本实施方式的这种盖状结构体34和下部结构体33具有下述优点:在覆设的情形中降低污染的危险率，在密封的情形中避免例如支原体等的污染，还避免温度变化导致的压カ变化。
[0121]根据第四实施方式，本发明是具备多个上部结构体而成的膜分选培养器。图4是不出本实施方式的膜分选培养器4的构成的概念图。膜分选培养器4含有:多个前述上部结构体40、固定多个前述上部结构体40的框体45、以及下部结构体43，所述下部结构体43由容器构成，该容器共同地保持使多个前述上部结构体40的分离膜浸溃于其中的流体。
[0122]本实施方式中，各上部结构体40的结构可以与第三实施方式相同。多个上部结构体40各自可以具备不同孔尺寸和/或孔密度的分离膜，或者可以全部相同。
[0123]框体45是容纳于下部结构体43中的结构体，并且将多个上部结构体40分别支持于各孔451。即，框体45是具备多个孔451的、上下开ロ的构件，所述孔451设置于通过保持机构453保持于距离下部结构体40 —定高度的板状构件上。格子状的隔室452将板状构件上侧的区域分割开而形成分隔，一个分隔中存在ー个孔451。框体45的材质可以与第ー实施方式中说明的下部结构体相同。另外，保持机构453是从板状构件的边缘向下方延伸的脚状构件。保持机构453仅在板状构件的边缘以外框的形式形成，在与板状构件上侧的隔室452对应的位置，形成有狭缝(slit)。图4示出了具有24个孔的框体45的结构，框体45的孔数可以是2孔也可以是96孔，孔数并无限定。另外，设置于框体24的板状构件上的孔的配置也不限于图示的方式。另外，本实施方式中的保持机构453是从板状构件向下延伸的脚状构件，也可以设置从下部结构体的内壁向内侧延伸的凸缘而卡于其中。
[0124]能够将上部结构体40可装卸地插入框体45的各孔451中。插入上部结构体40时，以构成上部结构体40的底面的分离膜位于孔451与下部结构体43的底面内壁之间的方式，孔451将上部结构体40固定。即，形成为孔451的直径大于上部结构体40的底面的直径，且小于开ロ部的直径。
[0125]下部结构体43是可装卸地容纳框体45的容器。下部结构体43中设置有一条沟。沟中设置有第三实施方式中说明的弾性体431。这是为了与后述的盖状结构体44密合，以密闭膜分选培养器4的内部。其它的下部结构体43的结构、材料和功能如第一实施方式中说明所述。另外，下部结构体43还可以具备培养基导入口和培养基送出ロ(未图示)。图示的下部结构体具有方形的底面，但下部结构体并不限于方形，也可以为例如圆形或楕圆形。
[0126]盖状结构体44从多个上部结构体40的上方覆盖多个上部结构体40和下部结构体43的开ロ部。盖状结构体44的基本结构、材料和功能如第三实施方式中说明所述。应予说明，盖状结构体44可以具备第三实施方式中例示的气体交换机构(未图示)，也可以进一步具备气体导入口和气体排出ロ。
[0127]具备这样的框体42和下部结构体43具有下述优点:例如在如iPS细胞那样目标干细胞的数目少的情形中，可以使用大量的组织细胞作为样本，且可以用単一的下部结构体进行收集。
[0128]根据第五实施方式，本发明是具备多个上部结构体、和由多个容器构成的下部结构体的膜分选培养器。图5是不出本实施方式的膜分选培养器5的构成的概念图。
[0129]膜分选培养器5含有:多个上部结构体50、前述框体55、和下部结构体53，所述下部结构体53由多个容器构成，该多个容器分别单独地保持使各个前述上部结构体50的分离膜浸溃于其中的流体。
[0130]上部结构体50的基本结构和功能如第四实施方式中说明所述。本实施方式中，多个上部结构体50各自可以具备不同孔尺寸和/或孔密度的分离膜，或者可以全部相同。
[0131]框体55的基本结构和功能如第四实施方式中说明所述，但本实施方式中，框体55的下部的保持机构553上设置有多个狭缝，以避免与下部结构体53的隔室532的干扰。
[0132]另ー方面，本实施方式的下部结构体53由与前述该多个上部结构体的各个对应的多个容器构成。具体地，下部结构体的主体由多个容器构成，该多个容器由被格子状的隔室532所间隔形成的分隔构成。格子状的隔室532可以与下部结构体53 —体地形成，也可以是可装卸于下部结构体53的构件，在使用吋，以由隔室532形成的各容器间的物质无法连通的程度固定于下部结构体中。
[0133]下部结构体53中可以装载并容纳框体55。装载时，框体52的各孔551与下部结构体53的多个容器的每ー个对应。另外，框体55的隔室552重合于下部结构体53的隔室532之上。进而，可以将多个上述结构体50的各个装载于框体52的各孔551中。此时，下部结构体53的ー个容器与ー个上述结构体50的组合作为独立的膜分选培养器发挥功能。所以，可以在被隔室 532所间隔的容器中分别保持使上部结构体50的分离膜浸溃于其中的流体。例如，可以将含有不同的迁移因子和/或培养基的不同种类的流体加入分别的容器，进行膜分尚。
[0134]另外，本实施方式的膜分选培养器5还可以具备未图示的盖状结构体。盖状结构体可以具备第三实施方式中例示的气体交换机构(未图示)，也可以进ー步具备气体导入口和气体排出ロ。图示的下部结构体53不具有密封用的沟，可以与覆设的盖状结构体组合使用。
[0135]通过使用第五实施方式的膜分选培养器5，例如，在对迄今为止没有分选过的干细胞进行分选时，配置多种孔尺寸的上部结构体，配置多种含有各种细胞迁移因子的培养基并进行组合，由此具有可以一次性进行分选条件筛选的优点。
[0136]根据第六实施方式，本发明是可以进行传代培养的封闭体系膜分选培养器。图22是不出本实施方式的膜分选培养器6的构成的概念图。
[0137]膜分选培养器6除了上部结构体60、下部结构体63之外，以皿66之外必须的构成。上部结构体60的基本结构、材料和功能如第一实施方式中说明所述。上部结构体60的开ロ部设置有从上部结构体60的上方覆盖开ロ部的盖状结构体64。盖状结构体64具备导入口 65。导入口 65是贯穿盖状结构体64而设置的优选为有机硅制的管，将上部结构体60构成的容器内部和外部连通。导入口 65主要用于在封闭体系中将切碎的牙髓组织或牙髓样本细胞插入膜分选培养器6的内部而不受外界污染。在封闭体系中也可以由导入口65进行培养基更换。上部结构体60所具备的膜62的结构、材料和功能与上述第一实施方式相同。另ー方面，本实施方式中的下部结构体63不存在与侧面部一体地固定的底面部，而仅由侧面部构成，除此之外，具有与第一实施方式相同的构成。
[0138]皿66是由底面部和侧面部构成的可进行细胞培养的容器。皿66设置有培养基的回收ロ 661，可以在封闭体系中进行培养基更换、培养上清的回收或细胞回收，而不受外界污染。在皿66的底面部、且在朝向容器内侧的表面，设置有未图示的表面处理层。表面处理层具有细胞附着和扩增性优异的特性，并且优选为可以针对热或光、或针对这两者发生反应并分解。根据ー个实施方式，表面处理层可以设计为针对特定波长的光照射发生反应、使构成表面处理层的物质发生分解。作为一例，可以形成使聚(N-异丙基丙烯酰胺)接枝聚合于皿66的底面部且面向容器内侧的表面而成的表面处理层。该表面处理层在37°C保持疏水性，但通过将温度降至30°C左右则发生相变而改变为亲水性，由此可以使附着于层表面的细胞剥离。根据其它实施方式，表面处理层可以设计为针对特定的温度变化发生反应，使构成表面处理层的物质发生分解。作为一例，可以形成含有胶原而成的表面处理层。此时，通过将温度上升至胶原的改性温度，表面处理层发生分解，可以使附着于层表面的细胞剥离。
[0139]皿66的上部进ー步具备从皿66的上方覆盖皿66的开ロ部的盖状结构体67。盖状结构体67构成为将皿66的内部密闭，且即使上部结构体60和下部结构体63的层叠体沿垂直方向移动也会保持密闭状态。
[0140]本实施方式中，下部结构体63设置为能够在皿66的内部沿垂直方向移动来使用。图22 (a)是示出进行膜 分选时的设置方式的概念图。此时，膜62、下部结构体63的侧面部、和皿66的底面部构成封闭的空间，将从上部结构体60迁移的细胞保持于空间的内部。皿66的直径优选为下部结构体63的直径的约7~10倍。应予说明，图6中为了明确地表示各构件而改变比例尺进行了记载。
[0141]下部结构体63可以在垂直方向向上移动，并固定。为了培养基的更换或干细胞的回收而使下部结构体63移动时的膜分选培养器6的概念图不于图22(b)。此时,盖状结构体67也可以将皿66密闭。
[0142]接着,从封闭体系培养方法的观点说明第六实施方式的膜分选培养器6。封闭体系培养方法包括:进行膜分选的步骤、使干细胞増殖的步骤、将干细胞传代的步骤、以及扩增并回收干细胞的步骤。进行膜分选的步骤中，按照第一实施方式中说明的方法进行干细胞的膜分选。该步骤中，从上部结构体60迁移至下部结构体63的细胞附着于被下部结构体63的侧壁部围住的皿66的底面。接着，在使干细胞增殖的步骤中，使上部结构体60和下部结构体的层叠体在垂直方向向上移动，通过培养基的回收ロ 661更换为含10%血清的DMEM等増殖培养基，将迁移因子除去，使上部结构体60和下部结构体的层叠体在垂直方向向下移动，与66的底面部接触并固定，由此使干细胞増殖。进而，实施将干细胞传代的步骤。此时，使上部结构体60和下部结构体的层叠体在垂直方向向上移动、并固定。接着，通过对表面处理层赋予光或赋予热、或者降低温度，而使表面层分解，使増殖的干细胞剥离。此时，下部结构体63的侧壁部和皿66的底面部没有接触，因而干细胞扩散于整个皿66中。接着，在扩增并回收干细胞的步骤中，经由培养基的回收ロ 661，可以回收传代干细胞。此时，可以将离心管与回收ロ 661连接，在封闭体系中进行离心分离，从而回收细胞或培养上清。另外，各步骤中，培养基更换可经由培养基的回收ロ 661进行。
[0143]本实施方式中，通过在皿66设置表面处理层，可以不必将以往通常用于从培养容器剥离细胞的胰蛋白酶等酶用于细胞剥离。该细胞培养上清和细胞由于不含酶，因而可不进行离心洗涤而直接用于移植。
[0144]根据第七实施方式,本发明为膜分选培养试剂盒。膜分选培养试剂盒含有膜分选培养器和细胞迁移因子。作为膜分选培养器，可使用上述第一实施方式至第六实施方式中的膜分选培养器I~6中的任一者、或其变形形式。
[0145]细胞迁移因子优选为选自下述中的至少任ー者:SDF-1、G-CSF、bFGF、TGF-P、NGF、PDGF、BDNF、⑶NF、EGF、VEGF、SCF、MMP3、SIit、GM-CSF、LIF、HGF、SIP、原儿茶酸、和血清。另外，前述细胞迁移因子的浓度优选为lng/ml~500ng/ml。这是为了高效地使干细胞迁移。即，这是因为若过于稀薄则有时会没有迁移效果，若过浓则有时为发生分化。细胞迁移因子可以添加于培养基中使用。所以，本实施方式的试剂盒还可以含有培养基。此时，培养基可以使用Dulbecco’s改良Eagle培养基、EBM2等,但并不限定于此。
[0146]特别优选本实施方式的试剂盒含有作为细胞迁移因子的、优选为50~150ng/ml的浓度的G-CSF或bFGF作为试剂盒的构成构件。另外，除了细胞迁移因子之外，作为添加于培养基中的成分，还可以含有人自体血清或胎牛血清作为试剂盒的构成构件。这些血清构成为以相对于培养基的体积为5~20vol%的浓度进行添加。试剂盒可以按照第一实施方式至第五实施方式中的装置和方法的说明进行制造、使用。
[0147]根据本实施方式的膜分选培养试剂盒，可以使用用于膜分选培养器和分选的细胞迁移因子，更加快速地实施第一实施方式所详述的干细胞分选方法。
[0148]根据第八实施方式，本发明为分离膜。
[0149]本实施方式的分离膜具备基材膜和功能层，所述基材膜由疏水性聚合物构成，所述功能层是选自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的I种以上的亲水性聚合物通过共价键键合于前述基材膜的表面而成的功能层，构成前述功能层的亲水性聚合物的重量是前述分离膜总重量的1.5重量％至35重量％。
[0150]由于有可能使膜的孔闭`塞或因水系培养液而发生溶出，因有机溶剂残存而对细胞造成不良影响，因而本发明中优选进行利用共价键合法的膜表面修饰。即，可以将为所期望的孔径且以高开孔率开ロ的基材膜浸溃于添加有乙烯基吡咯烷酮系聚合物、和/或乙二醇系聚合物、和/或乙烯醇系聚合物、以及根据需要的醇的处理水溶液中后，照射高能射线，由此进行基材膜的表面修饰。
[0151]形成本发明的分离膜的基材膜的聚合物适宜使用疏水性聚合物。本发明中，疏水性聚合物是指相对于20°C的水100g的溶解度小于0.0Olg的聚合物。具体地，疏水性聚合物可以是选自砜系聚合物、酰胺系聚合物、碳酸酯系聚合物、酯系聚合物、氨基甲酸酯系聚合物、烯烃系聚合物和酰亚胺系聚合物中的聚合物，但并不限定于此。其中，根据这些构成基材膜的疏水性聚合物的吸水率改变表面改性条件，由此可以更有效地赋予蛋白质和细胞的附着抑制性。
[0152]基材膜只要是用于分离2个区域的膜，则不需要开有孔。例如，为了透过物质，可以使用如透析膜那样开有40至SOnm的孔的膜，为了分离细胞，可以使用开有I至10 y m的孔的膜等，根据使用目的来选择孔径。特别地，本发明的分离膜可以适宜地用于利用细胞的趋化性的分离，此时3~8 y m的孔径容易使用。
[0153]构成这些基材膜的聚合物一般疏水性强，具有大量附着蛋白质和细胞等的倾向。特别是由于活化的蛋白质或血小板、附着性细胞容易附着于膜表面，因而得到的结论是需要均匀地实施一定量以上的表面改性、即亲水性聚合物的共价键合。
[0154]乙烯基吡咯烷酮系聚合物是指选自聚乙烯基吡咯烷酮、乙烯基吡咯烷酮こ酸こ烯酯共聚物、乙烯基吡咯烷酮乙烯醇共聚物、乙烯基吡咯烷酮苯乙烯共聚物、乙烯基吡咯烷酮二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯共聚物和它们的改性聚合物中的聚合物，乙二醇系聚合物也包括侧链含酯基的那些。乙烯醇系聚合物可根据皂化度而获得各种种类，并无限定。本发明中将这些聚合物表述为亲水性聚合物。其中，这些用于膜表面修饰的亲水性聚合物优选为水溶性。因此，例如，可以使用数均分子量为I万至100万的聚合物，但只要为水溶性则并不限于上述分子量。
[0155]本发明中，水溶性的聚合物是指相对于2 0で的水I OOg的溶解度为I g以上、优选I 0 g以上的聚合物。从蛋白质、血小板或附着性细胞等的附着抑制的观点出发，优选本发明的分离膜含有这种水溶性聚合物。表面的适度的亲水性和疏水性的平衡被认为对于蛋白质或血小板的附着抑制是重要的。实际上，已知亲水性更强的水溶性聚合物存在的情形中，蛋白质、血小板或附着性细胞等的附着抑制效果进ー步提高。
[0156]分离膜中所含有的水溶性聚合物的量是分离膜总重量的优选1.5重量％以上、更优选5重量％。另外，含量即使过多效果也不改变，因而优选为40重量％以下、更优选为35重量％。
[0157]进而，亲水性聚合物只要是具有水溶性单元和酯基单元的共聚物，则可在I个分子中获得适度的亲水性和疏水性的平衡，因而适宜。因此，作为共聚物，与接枝共聚物相比，更适宜使用嵌段共聚物或交替共聚物、无规共聚物。其原因认为是接枝聚合物中，主链上接枝的単元部分与蛋白质等接触的机会大，因而相比于作为共聚物的特性，接枝链部分的特性的影响更大。另外，相比于嵌段共聚物，更优选交替共聚物、无规共聚物。认为这是因为嵌段共聚物中，各个单元的特性明确区別。从I个分子中的亲水性和疏水性的平衡的方面出发，适宜使用具有选自无 规共聚物和交替共聚物中的至少ー者的共聚物。含酯基的聚合物中的酯基单元的摩尔比优选为0.3以上且0.7以下。酯基单元的摩尔比若小于0.3，则酯基的附着抑制效果降低。另外，若超过0.7，则水溶性単元的效果降低。
[0158]作为存在于分离膜表面的表面改性聚合物的亲水性聚合物的存在量可通过，例如，元素分析或核磁共振(NMR)測定、ESCA和全反射红外分光法(以下有时记为ATR)的组合来得到。这是因为，ESCA測定表面的直至约IOnm深度的方法，ATR是表面測定，是测定直至数Pm深度的组成的方法。列举聚砜分离膜为例子时，若将膜中的任意位置的亲水性聚合物的存在量相对于聚砜单元的存在量之比作为单元量比，则只要ESCA中所得的単元量比的值比ATR中所得的值大30%以上，则可以使本发明中所述的膜表面的含酯基的聚合物的存在量比膜内部大30%以上。应予说明，各測定的值是3点的平均值。
[0159]接着，从成形体的表面改性方法的观点出发，对本实施方式进行说明。成形体的表面改性方法具备:将由疏水性聚合物构成的成形体浸溃于含有10~2000ppm的选自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的I种以上亲水性聚合物、且含有根据需要的0.01~0.2重量％的醇的处理水溶液中的浸溃步骤；和对由浸溃步骤得到的成形体照射高能射线，将成形体表面改性为蛋白附着抑制性、细胞附着抑制性的改性步骤。该成形体的表面改性方法在成形体为特定基材膜的情形中，也可以说是上述说明的分离膜的制造方法。该方法由于简便且少量即可实施，因而是适宜的方法。
[0160]这里所说的由疏水性聚合物构成的成形体并不限于膜，只要是具有特定形状的成形体即可。在使用膜的情形中，可以是在上述分离膜的构成中作为基材膜进行说明的膜，此时，成形体的表面改性方法成为分离膜的制造方法。
[0161]处理水溶液是用于浸溃由疏水性聚合物构成的成形体的水溶液。处理水溶液中，优选以总浓度计为10~5000ppm、更优选为10~2000ppm的方式含有选自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的I种以上的亲水性聚合物。应予说明，具体的浓度有时根据亲水性聚合物的种类而不同。亲水性聚合物溶液的浓度若低，则有时无法充分涂布由疏水性聚合物构成的成形体。另外，若浓度过高，例如在成形体为膜时，则将孔闭塞、或溶出物增多、或引起分离膜性能降低的情况多。应予说明，通过如后所述添加醇，可进ー步有效地进行表面改性，因而可将浓度设定更低。
[0162]另外，为了有效地进行表面修饰，优选根据由疏水性聚合物构成的成形体的原材料的吸水率改变处理水溶液的组成。这里，本发明中，由疏水性聚合物构成的成形体的吸水率是指，将成形体的原材料制为30~lOOym膜厚的膜时，用纯水洗涤后，将进行了干燥的膜在23°C的水中浸溃24小时，測定该过程中的重量増加率。该重量増加率为吸水率。另外，成形体为分离膜时，若为200 以下的膜厚，则可以直接用纯水洗涤后干燥，在23°C的水中浸溃24小时，可以由该过程中的重量増加率算出。
[0163]由疏水性聚合物构成的成形体的吸水率为2%以下时，优选在该处理水溶液中进一歩添加醇。这是因为，通过使醇共存，可以将由疏水性聚合物构成的成形体的表面均匀地被覆。制为添加的醇，若考虑残留时的安全性，则优选为こ醇，但并不限定于此。例如，也可以使用甘油之类的多元醇。添加的醇的浓度优选为处理水溶液总重量的I重量％以下，为了安全则为0.5重量％以下，进ー步优 选为0.1重量％以下。通过预先使用醇提高吸附效率，可以有效地进行表面改性，即使是使用更低浓度的亲水性聚合物也可以实现相同程度的表面改性。即，可以减少亲水性聚合物的使用量，对于降低生产时的成本有效。
[0164]另ー方面，由疏水性聚合物构成的成形体的吸水率超过2%时，不必向处理水溶液中加入醇。
[0165]在进行浸溃的步骤中，可以将整个成形体浸溃于处理水溶液中，也可以仅将欲进行表面改性的成形体的一部分浸溃于处理水溶液中。
[0166]作为改性步骤中使用的高能射线，可以使用UV、电子射线、Y射线、X射线。电子射线或Y射线由于容易提高反应率，因而更优选。另外，从残留毒性少或简便性的观点出发，优选使用Y射线或电子射线。照射的射线量优选为5~35kGy，特别是将培养装置整体用例如相当于被视为灭菌射线量的25kGy的射线量进行照射，由此还可以同时实施表面修饰和灭菌。然而，照射射线量若为IOOkGy以上，则生产率变差，发生聚合物的分解等，故不优选。
[0167]应予说明，已知在照射高能射线时，若存在氧，则会产生氧自由基等，使得由疏水性聚合物构成的成形体分解。所以，理想的是照射放射射线时的成形体周围的氧浓度为10体积％以下。
[0168]第八实施方式的分离膜具有高的附着抑制性，因而可适宜地用作水处理用分离膜或机体成分分离膜。另外，本实施方式的改性方法不仅可适用于膜，也可适用于各种成形体，可以容易地以高效率实施表面改性。该表面改性方法尤其适于血液浄化用组件。这里，血液浄化用组件是指具有使血液循环至体外并将血中的废物和有害物质除去的功能的组件，有人工肾脏或外毒素吸附柱等。
[0169]以下，通过实施例更具体地说明本发明，但本发明并不受以下实施例的任何限定。
[0170]实施例1
[利用TaxiScan比较对牙髓干细胞的迁移有效的迁移因子]
实时水平趋化性分析使用了狗第4代的牙髓干细胞⑶31—SP细胞。TAXIScan-FL(Effector Cell Institute,东京)在开有6 y m的孔的有机娃和玻璃板之间形成针对细胞的大小进行了最优化(8 ym)的通道，在通道内的一端注入细胞(IO5细胞/ml) liU。将10ng/ul的各种迁移因子各I U I加入相反侧，以形成恒定浓度梯度。根据迁移的视频图像，每30分钟测量一次迁移细胞数直至4小吋。图6 (a)示出了迁移因子导致的迁移能力差异的时间历程。对于BDNF，牙髓干细胞非常迅速地迁移，在2小时达到稳定(plateau)。对于SDF-1和bFGF，迁移也较快地进行。对于^即、￥￡6?、丽?3、6-03?，迁移细胞均是缓慢增加，在4小时后，除了 TOGF、GM-CSF之外，达到基本相同的迁移细胞数。
[0171][由TaxiScan得到的对牙髓干细胞的迁移有效的迁移因子的浓度]
在TAXIScan-FL的微通道中注入IO5细胞/ml的狗第4代的牙髓干细胞⑶31_SP细胞Iu 1，在相反侧将G-CSF以浓度0、0.l、l、5、10、20、40、100ng/iil各加入I yl，根据迁移的视频图像，每30分钟测量一次迁移细胞数直至I个半小吋。图6 (b)示出了 G-CSF的浓度差异导致的迁移能力的差异的时间历程。IOng/Ul的情形中，迁移细胞数最多，随后以5、40、20、100、1、0.lng/ U I的顺序确认到迁移细胞数的減少。
[0172][由TaxiScan得到的对牙髓干细胞的迁移有效的血清的浓度]
在TAXIScan-FL的微通道注入IO5细胞/ml的人的牙髓干细胞I U I，在相反侧以浓度为0、5、10、15、20%各加入人血清I Ul，根据迁移的视频图像，每3小时测量一次迁移细胞数直至24小时。进而，对使用人血清10%和20%、以及100ng/ml的GCSF和SDF-1的情形中的迁移能力进行比较。图7 (a)示出了血清的浓度差异导致的迁移能力的差异的时间历程。20%的情形中，迁移细胞数最多，随后，以15、10、5%的顺序确认到迁移细胞数的減少。图7(b)示出了 G-CSF、SDF-1所致的迁移能力的时间历程。G-CSF、SDF-1与20%血清相比，迁移细胞数更多。
[0173][牙髓干细胞的分选] 组装由底面安装有包被为细胞非粘附性的插入式细胞培养皿的PET膜(2 X IO5孔/cm2、孔尺寸为3 u m)的、底面直径6.4mm、开ロ部直径11.0mm、高度17.5mm的PET制的上部结构体与底面直径15.0_、开ロ部直径15.0_、高度22.0mm的聚苯乙烯制的下部结构体构成的膜分选培养器。为了对膜部分赋予细胞附着抑制性，将PET膜表面预先浸溃于在聚乙烯基吡咯烷酮-聚こ酸乙烯酯共聚物(乙烯基吡咯烷酮/こ酸乙烯酯(6/4)共聚物(BASF社制、"Kollidon VA64“))1000ppm水溶液中添加0.1%こ醇而成的水溶液中，进行密封，然后照射Y射线25kGy进行修饰，制成分离膜。在该上部结构体的膜上部接种I X IO5细胞/250 U I的狗新鲜初代牙髓细胞，在下部结构体中于含10%狗血清的Dulbecco’s改良Eagle培养基(DMEM)中加入G-CSF或SDF-1以使最终浓度为100ng/ml。6小时后更换培养基，除去G-CSF，进而在含10%狗血清的DMEM中进行培养。图8 (a)、(b)和(c)中示出了发生迁移、附着、进而増殖的牙髓干细胞的相差显微镜图像。在所有迁移因子的情形中，均确认到星状且具有突起的细胞附着，并与用流式细胞仪分选CD31_SP细胞、CD105 +细胞或CXCR4 +细胞的情形相同地发生増殖。
[0174][分选的牙髓干细胞的特征化]
将在膜分选培养器中使用G-CSF和SDF-1进行膜分选得到的上述牙髓干细胞传代3代后，是细胞以I X IO6细胞/ml分散于含2%血清的DMEM中，使用各种干细胞表面抗原标志物的抗体(CD29、CD31、CD34、CD44、CD73、CD90、CD105、CD146、CD150、CXCR4)在 4°C下标记 30 分钟后，进行流式细胞仪法。即，使用小鼠IgGl阴性对照(AbD Serotec Ltd.)、小鼠IgGl阴性对照(fluorescein isothiocyanate, FITC) (MCA928F) (AbD Serotec)、小鼠 IgGl阴性对照(Phycoerythrin-Cy5、PE-Cy5) (MCA928C) (AbD Serotec)，小鼠 IgGl 阴性对照(Alexa 647) (MRC 0X_34)(AbD Serotec)、针对下述的抗体:CD29 (PE_Cy5) (MEM-101A)(eBioscience)、CD31 (FITC) (QbendlO) (Dako)、CD34 (Allophycocyanin,APC) (1H6) (R& D Systems, Inc.)、CD44 (Phycoerythrin-Cy7, PE_Cy7) (IM7) (eBioscience), CD73(APC) (AD2) (BioLegend)，CD90 (FITC) (YKIX337.217) (AbD Serotec), ant1-humanCD105 (PE) (43A3) (BioLegend) CD146 (FITC) (sc-18837) (Santa Cruz, Biotech,Santa Cruz，CA，USA)，CD150 (FITC) (A12) (AbD Serotec)、CXCR4 (FITC) (12G5) (R& D)，在4°C下标记90分钟。作为对照，使用了用流式细胞仪分选得到的狗牙髓⑶105+细胞。
[0175]表1是示出用上述膜分选培养器分选培养得到的牙髓干细胞的第3代通过流式细胞仪分析的干 细胞的表面抗原的表达的表。与狗牙髓CD105+细胞相同地，用膜分选培养器分选得到的细胞在使用G-CSF时，⑶105阳性率为95.1%，在使用SDF-1时为89.5%。另外，对于⑶29、⑶44、⑶73、⑶90，两种级分中均为95%以上，因而可认为含有大量干细胞前体细胞。另外，对于CXCR4，与用流式细胞仪分选得到的狗牙髓CD105 +细胞相比为一半，进而，⑶31、⑶146大致为阴性。
[0176][表 I]
【权利要求】
1.膜分选培养器，其含有上部结构体和下部结构体， 所述上部结构体由容器构成，该容器的底面的至少一部分用具有干细胞透过用孔的分离膜形成， 所述下部结构体由容器构成，该容器保持使所述上部结构体的膜浸溃于其中的流体。
2.权利要求1所述的膜分选培养器，其中，所述分离膜具备基材膜和功能层， 所述基材膜由疏水性聚合物构成， 所述功能层是选自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的I种以上的亲水性聚合物通过共价键键合于所述基材膜的表面而成的功能层， 构成所述功能层的亲水性聚合物的重量是所述分离膜总重量的1.5重量％至35重量％。
3.权利要求1或2所述的膜分选培养器，其中，所述孔的尺寸是3y m~10 y m，密度是I X IO5 ~4X IO6 孔 /cm2。
4.权利要求1~3中任一项所述的膜分选培养器，其中，具备多个所述上部结构体， 并进一步含有框体，所述框体容纳于所述下部结构体中，且具备设置有将该多个上部结构体的各个固定的多个孔的板状构件。
5.权利要求1或2中任一项所述的膜分选培养器，其中，具备多个所述上部结构体， 并进一步含有框体，所述框体容纳于所述下部结构体中，且具备设置有将该多个上部结构体的各个固定的多个孔的板·状构件， 所述下部结构体由与所述该多个上部结构体的各个对应的多个容器构成。
6.权利要求4或5所述的膜分选培养器，其中，所述多个上部结构体具有不同孔尺寸和/或不同孔密度的膜。
7.权利要求1~6中任一项所述的膜分选培养器,其中,进一步含有盖状结构体,所述盖状结构体可覆设或密封所述上部结构体和下部结构体。
8.权利要求7所述的膜分选培养器，其中，所述盖状结构体进一步含有气体交换装置，所述气体交换装置具备气体导入口和气体排出口。
9.权利要求7或8所述的膜分选培养器，其中，所述盖状结构体的至少一部分是由具有孔尺寸I~IOOnm的孔的膜形成的。
10.权利要求7~9中任一项所述的膜分选培养器，其中，在所述盖状结构体和所述下部结构体之间设置有密封用的弹性体。
11.权利要求7~10中任一项所述的膜分选培养器，其中，进一步具备含有温度测定装置和温度调节装置的温度调节系统。
12.权利要求1~11中任一项所述的膜分选培养器，其中，所述下部结构体进一步含有具备培养基导入口和培养基送出口的培养基交换系统。
13.膜分选培养试剂盒，其含有权利要求1~12中任一项所述的膜分选培养器、和用于注入所述下部结构体的细胞迁移因子。
14.权利要求13所述的试剂盒，其中，所述细胞迁移因子是选自SDF-1、G-CSF,bFGF、TGF- P、NGF、PDGF, BDNF,⑶NF、EGF、VEGF, SCF、MMP3、Slit、GM-CSF, LIF、HGF、SIP、原儿茶酸和血清中的一种以上。
15.权利要求13或14所述的试剂盒，其中，所述细胞迁移因子的浓度为lng/ml~500ng/ml。
16.权利要求13所述的试剂盒，其进一步含有用于注入所述下部结构体的血清，所述细胞迁移因子为G-CSF或bFGF。
17.使用权利要求1~12中任一项所述的膜分选培养器的干细胞分选方法,其包括: 将样本细胞或样本组织接种于所述上部结构体的膜的步骤、 将含有细胞迁移因子的培养基填充于所述下部结构体的容器的步骤、和 使所述上部结构体的膜与所述下部结构体中的培养基接触的步骤。
18.权利要求17所述的方法，其中，所述细胞迁移因子是选自SDF-1、G-CSF、bFGF、TGF- P、NGF、PDGF, BDNF,⑶NF、EGF、VEGF, SCF、MMP3、Slit、GM-CSF, LIF、HGF、SIP、原儿茶酸和血清中的一种以上。
19.权利要求17或18所述的方法，其中，所述细胞迁移因子的浓度为lng/ml~500ng/ml o
20.权利要求17~19中任一项所述的方法，其中，将所述样本细胞以相对于分离膜Imm2为3X102细胞~3X IO4细胞进行接种。
21.权利要求17所 述的干细胞分选方法，其中，所述干细胞为牙髓干细胞，所述细胞迁移因子为G-CSF或bFGF，所述G-CSF或bFGF的浓度为50~150ng/ml，将所述样本细胞以相对于分离膜Imm2为3X IO2~1.5X IO3细胞进行接种，或将所述样本组织以相对于分离膜Imm2为0.1mg~Img进行静置，在所述含有细胞迁移因子的培养基中添加相对于该培养基的体积为5~20vol%的血清。
22.权利要求17所述的干细胞分选方法，其中，所述干细胞为骨髄干细胞或脂肪干细胞，所述细胞迁移因子为G-CSF或bFGF，所述G-CSF或bFGF的浓度为50~150ng/ml，将所述样本细胞以相对于分离膜Imm2为3X IO2~1.5X IO3细胞进行接种，或将所述样本组织以相对于分离膜Imm2为0.1mg~Img进行静置，在所述含有细胞迁移因子的培养基中添加相对于该培养基的体积为5~20vol%的血清。
23.分离膜，其具备基材膜和功能层，所述基材膜由疏水性聚合物构成， 所述功能层是选自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的I种以上的亲水性聚合物通过共价键键合于所述基材膜的表面而成的功能层， 构成所述功能层的亲水性聚合物的重量是所述分离膜总重量的1.5重量％至35重量％。
24.权利要求23所述的分离膜，其中，所述基材膜具有I~10的孔，并用于细胞分离。
25.权利要求23或24所述的分离膜，其中，所述疏水性聚合物选自砜系聚合物、酰胺系聚合物、碳酸酯系聚合物、酯系聚合物、氨基甲酸酯系聚合物、烯烃系聚合物和酰亚胺系聚合物中。
26.权利要求23~25中任一项所述的分离膜，其用于对细胞进行透过分离。
27.权利要求23~26中任一项所述的分离膜的制造方法，其具备:将吸水率为2%以下的由疏水性聚合物构成的基材膜浸溃于含有10~2000ppm的选自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的I种以上亲水性聚合物、且含有0.01~0.2%的醇的处理水溶液中的浸溃步骤、和对所述基材膜照射高能射线，将膜表面改性为蛋白附着抑制性、细胞附着抑制性的改性步骤。
28.权利要求23~26中任一项所述的分离膜的制造方法，其具备:将含水率超过2%的由疏水性聚合物构成的基材膜浸溃于含有10~2000ppm的选自乙烯基吡咯烧酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的I种以上亲水性聚合物的水溶液中的浸溃步骤、和 对所述基材膜照射高能射线，将膜表面改性为蛋白附着抑制性、细胞附着抑制性的改性步骤。
29.权利要求27或28所述的改性方法，其中，所述疏水性聚合物选自砜系聚合物、酰胺系聚合物、碳酸酯系聚合物、酯系聚合物、氨基甲酸酯系聚合物、烯烃系聚合物和酰亚胺系聚合物中。
30.成形体的表面改性方法，其具备:将吸水率为2%以下的成形体浸溃于含有10~2000ppm的选自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的I种以上亲水性聚合物、且含有0.01~0.2%的醇的处理水溶液中的浸溃步骤、和 对所述成形体照射高能射线，将成形体表面改性为蛋白附着抑制性、细胞附着抑制性的改性步骤。
31.成形体的表面改性方法，其具备:将吸水率超过2%的成形体浸溃于含有10~2000ppm的选自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的I种以上亲水性聚合物的水溶液中的浸溃步骤、和 对所述成形体照射高能射线，将成形体表面改性为蛋白附着抑制性、细胞附着抑制性的改性步骤。
32.使用权利要求30或32的改性方法，制造权利要求23~26中任一项所述的分离膜的方法。`
【文档编号】C12N15/09GK103597068SQ201280016688
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年3月30日 优先权日:2011年3月30日
【发明者】中岛美砂子, 庵原耕一郎, 山田和正, 岛垣昌明, 长部真博 申请人:独立行政法人国立长寿医疗研究中心, 东丽株式会社