用来源于埃希氏菌(Escherichia sp.)的果糖激酶基因转化的棒杆菌(Corynebacterium ...的制作方法
【专利摘要】本发明涉及转化了埃希氏菌(Escherichia?sp.)来源的果糖激酶基因以表达果糖激酶的棒杆菌(Corynebacterium?sp.)以及利用该菌株生产L-氨基酸的方法，所述果糖激酶显示出足以将果糖转化为果糖-6-磷酸的活性，从而阻止不必要的能量损耗。本发明的转化的棒杆菌能从埃希氏菌来源的果糖激酶基因表达果糖激酶，以阻止果糖代谢期间不必要的能量损耗，产生更具成本效益的L-氨基酸的生产。因此，其可以被广泛用于有效生产L-氨基酸。
【专利说明】用来源于埃希氏菌(Escherichia sp.)的果糖激酶基因转
化的棒杆菌(Corynebacterium sp.)及使用该棒杆菌制备
L-氨基酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及用埃希氏菌(Escherichia sp.)来源的基因转化的棒杆菌(Corynebacterium sp.)及使用该棒杆菌菌株生产L-氨基酸的方法。
【背景技术】
[0002]棒杆菌,具体来说，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum),是用于生产L-氨基酸的革兰氏阳性的微生物。诸如L-赖氨酸的L-氨基酸被广泛用于动物饲料生产、人类药品生产、制药工业等，并通过使用棒杆菌菌株的遗传工程方法来大量生产。由于工业发展，对L-氨基酸的不断增加的需求导致需要开发改良的棒杆菌菌株，以更有效和更经济地生产L-氨基酸。
[0003]一般来说，通过将特定的DNA(如L-氨基酸生物合成相关的基因)引入棒杆菌菌株内或者通过改良棒杆菌菌株的活力已经可以增加棒杆菌的L-氨基酸生产。例如，韩国专利公开第2001-51915号和第2001-62279号公开了通过来源于谷氨酸棒杆菌的sucC和sucD基因以及zwa2基因的低表达，增加棒杆菌的L-氨基酸生产力的方法。韩国专利公开第2001-62272号公开了通过来源于谷氨酸棒杆菌的zwal基因的过表达，增加棒杆菌的L-氨基酸生产力的方法。日本专利第1995-121228号公开了引入来源于大肠埃希氏菌(Escherichia coli)的编码柠檬酸合酶的基因的方法。
[0004]同时，棒杆菌能利用蔗糖、葡萄糖和果糖作为碳源。其中，蔗糖被磷酸转移酶系统(PTS)磷酸化并被运送到细胞内。随后，磷酸化的蔗糖被转化酶水解为葡萄糖-6-磷酸和果糖。产生的葡萄糖-6-磷酸进入糖酵解，而未磷酸化的果糖则被从细胞输出。其被PTS磷酸化，随后被运送到细胞内，并在糖酵解中被利用。利用果糖作为碳源需要相对复杂的代谢途径，因为棒杆菌没有果糖激酶活性(Appl Environ Microbiol.(1996) 62:3878-3880)。另一方面，在表达果糖激酶的细菌内，蔗糖被转化酶水解为葡萄糖-6-磷酸和果糖，且果糖被果糖激酶磷酸化。随后，葡萄糖-6-磷酸和磷酸化果糖可以进入糖酵解途径。
[0005] 使用果糖作为培养棒杆菌的碳源有一个问题，由于复杂的代谢途径，其需要不必要的能量损耗，因此已经进行了许多研究来解决这一问题。例如，本发明发明人开发了使用转化的菌株生产L-赖氨酸的方法，所述转化的菌株通过将来源于丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)或枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)的果糖激酶基因引入棒杆菌内来制备(韩国专利第564805号)。然而，随后的研究表明，用果糖激酶基因转化的棒杆菌具有非常低的果糖激酶活性，且当使用蔗糖作为培养棒杆菌的碳源时，来源于蔗糖的一部分果糖被转化为果糖-6-磷酸，且余下的部分在细胞外被PTS磷酸化，随后被运送到细胞内，这如同野生型内的情形，因此引入果糖激酶基因并不提供足够的产出。因此，有必要探索其他显示出足以在棒杆菌内将果糖转化成为果糖-6-磷酸的活性的果糖激酶基因。[0006]从对调节蔗糖吸收和水解作用以赋予蔗糖同化能力的基因的研究中，鉴定出了期望的果糖激酶基因，且通过以下例证:沙门氏菌(Salmonella)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)和解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)中发现的 scr 调节子(J.Bacteriol.，151:68-76，1982;Mol.Microbiol.，2:1-8，1988;J.Bacteriol.，173:7464-7470，1991;J.Gen.Microbiol.，134:1635-1644，1988;J.Bacteriol.，182:5351-5358，2000;USP7, 179，623);来源于埃希氏菌的 csc 调节子(Appl.Environ.Microbiol., 58:2081-2088, 1992; USP6, 960，455)以及来源于革兰氏阳性
的微生物-变异链球菌(Streptococcus mutans)的scr调节子和sac操纵子
(J.Bacteriol.，171:263-271，1989)。其中，在埃希氏菌中发现了两种果糖激酶基因(cscK和mak)。cscK是属于csc调节子的果糖激酶基因，且已知与cscB (质子同向转运型鹿糖通透酶)和cscA (蔗糖水解酶)一起参与蔗糖代谢(J.Bacteriol.，184:5307-5316，2002)。Mak是编码甘露糖激酶的基因，且已知甘露糖激酶具有将诸如甘露糖、果糖和葡萄糖的己糖转化为 6-磷酸-酯形式的活性(Mol.Microbiol.，5:2913-2922，1991)。
[0007]发明概述
[0008]抟术问是页
[0009]因此，本发明发明人分离了埃希氏菌的果糖激酶基因(cscK和mak)，并用该基因转化棒杆菌菌株以提供具有增加的氨基酸生产力的菌株，从而完成本发明。
_0] 技术方案
[0011]本发明的一个目的是提供用埃希氏菌来源的果糖激酶基因转化以表达果糖激酶的棒杆菌，所述果糖激酶显示出足以在细胞内将果糖转化为果糖-6-磷酸的活性，而不需要通过水解磷酸化的蔗糖产生的胞内果糖在输出后的再次进入，从而阻止不必要的能量损耗。
[0012]本发明的另一目的是提供生产L-氨基酸的方法，包括培养转化的棒杆菌和从其收集L-氨基酸的步骤。
[0013]本发明的另一目的是提供生产L-氨基酸的方法，包括在含有蔗糖作为碳源的培养基中培养转化的棒杆菌和从其收集L-氨基酸的步骤。
[0014]本发明的有益.效果
[0015]本发明的转化的棒杆菌能表达埃希氏菌来源的果糖激酶，从而避免果糖代谢期间不必要的能量损耗，产生更具成本效益的L-氨基酸生产。因此，其可以被广泛用于有效生产L-氨基酸。
[0016]附图简要说明
[0017]图1是显示培养用果糖激酶基因转化的谷氨酸棒杆菌后，存在于培养基中的蔗糖和果糖的定量结果的图。
[0018]实施发明的最佳方式
[0019]一方面，为了实现上述目标，本发明提供了用于生产L-氨基酸的棒杆菌，其包含可操作地连接至基因表达单元的埃希氏菌来源的果糖激酶基因。就这一点而言，果糖激酶基因并不具体受限，且优选为cscK或mak，且最优选为cscK。根据本发明的一个实施例，cscK具有SEQ ID N0.17的核苷酸序列，且mak具有SEQ ID N0.18 的核苷酸序列。
[0020]此外，基因表达单元被可操作地连接至载体，且优选通过转化插入到棒杆菌内，或通过插入棒杆菌的染色体中而并入。该基因优选通过基因表达调控区的修饰而被过表达。
[0021]例如，除了基因上游的固有启动子，还可以连接其他的异质启动子，且异质启动子的例子可以包括pcj7启动子、IysCPl启动子、EF-Tu启动子、groEL启动子、aceA启动子和aceB启动子。优选使用棒杆菌来源的启动子——pcj7启动子或IysCPl启动子，且最优选使用pcj7启动子。[0022]如本文中所使用，术语“表达单元”指包含可操作地连接至编码蛋白质的多核苷酸的启动子和所述多核苷酸的片段，且可以进一步包括3’ -UTL、5’ -UTL、聚A尾等。如本文中所使用，术语“表达单元”与“表达盒”可互换。
[0023]如本文中所使用，术语“pcj7启动子”指可以被表达的启动子，其在产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)和埃希氏菌内显示优良的启动子活性,且还在谷氨酸棒杆菌内显示优良的启动子活性(韩国专利第0620092号)。
[0024]如本文中所使用，术语“lysCPl启动子”指通过编码天冬氨酸激酶和天门冬氨酸半醛脱氢酶的基因的启动子区的核苷酸置换而改良的启动子，以及可增加天冬氨酸激酶基因的表达水平从而使酶活增加超过野生型约5倍的强启动子(W02009/096689)。
[0025]本发明中，可以将果糖激酶基因引入的棒杆菌，可以包括属于棒杆菌且具有生产L-氨基酸的能力的所有菌株。其实例可以优选包括，但不限于:谷氨酸棒杆菌(ATCC13032)、热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes) (FERM BP-1539)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum) (ATCC14067)、发酵短杆菌(Brevibacterium fermentum)(ATCC13869)，且更优选为谷氨酸棒杆菌KFCC10881 (韩国专利第0159812号)、KFCC_11074和 KFCCl1001I。
[0026]如本文中所使用，术语“转化”指将果糖激酶基因引入宿主细胞一棒杆菌内，以使其在宿主细胞内表达的全部行为。就这一点而言，果糖激酶基因是能编码果糖激酶的多核苷酸，包括DNA和RNA。只要基因能被引入宿主细胞内并在其中表达，该基因就可以以任何形式被引入。例如，可以以表达盒将基因引入宿主细胞中，所述表达盒是其自身包含用于表达该基因的完整元件的多核苷酸表达体(expressome)。表达盒包含可操作地连接至基因的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。表达盒可以为能自我复制的表达载体。基因还可以单独或以可操作地连接至在宿主细胞内表达所必需的序列的多核苷酸表达体的形式被引入宿主细胞内。
[0027]同时，另一方面，本发明涉及生产L-氨基酸的方法，包括培养用埃希氏菌来源的果糖激酶基因转化的棒杆菌；和从培养物中收集L-氨基酸的步骤。
[0028]就这一点而言，L-氨基酸可以为所有类型的L-氨基酸，且优选为L-赖氨酸、L-苏氨酸或L-谷氨酸。
[0029]棒杆菌的培养可以通过本领域已知的不同培养方法(Chmiel,Bipprozesstechnikl.Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik,GustavFischer Ver lag,Stuttgart, 199 I ;Storhas,Bioreaktoren und periphereEinrichtungen, Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994),在合适的培养基中进行。培养方法的实例可以包括:分批培养、连续培养和补料分批培养。补料分批培养包括补料分批法和重复补料分批法，但不限于此。
[0030]此外，根据培养模式和菌株，本领域技术人员可以恰当地选择本文中用于培养的培养基(“普通细菌学方法手册(Manual of Methods for General Bacteriology) ”,美国细菌学学会，美国华盛顿，1981)。本发明中使用的培养基包括不同的碳源、氮源和微量元素。用于培养棒杆菌的培养基可以包括所有的蔗糖、葡萄糖、果糖、脂质、脂肪酸、醇、有机酸等。具体来说，本发明的棒杆菌具有果糖激酶活性，从而通过果糖激酶直接在细胞内磷酸化果糖，而不需要通过水解磷酸化的蔗糖产生的胞内果糖在输出后的再次进入，因此可在糖酵解中利用磷酸化的果糖。因此，本发明的棒杆菌具有比已知棒杆菌改善的蔗糖同化能力。有用的碳源的具体实例包括:碳水化合物，如蔗糖一包括糖蜜、葡萄糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油，如大豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇，如甘油和乙醇；以及有机酸，如醋酸。可以以不同的方式使用合适量的碳源。氮源包括诸如蛋白胨、酵母提取物、肉汤、麦芽提取物、玉米浆和大豆粉的有机氮源，以及诸如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵的无机氮源。这些氮源可以单独或组合使用。用于培养基的磷源的实例可以包括:磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和相应的钠盐。另外，培养基可以包含诸如硫酸镁或硫酸亚铁的金属盐。此外，可以包含氨基酸、维生素和合适的前体物质。可以通过分批式或连续式方法将培养基或前体物质加入到培养物中。
[0031]可以以合适的方法，通过在培养期间加入诸如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸的化合物来调节培养物的pH。可以通过在培养期间使用诸如聚乙二醇脂肪酸酯的消泡剂来抑制气泡的产生。为了维持培养物的需氧条件，可以将氧气或含氧气体(例如，空气)注入到培养物中。培养温度为20至45°C，且优选为25至40°C。可以持续培养直到达到L-氨基酸生产的期望水平，且优选持续10至160小时。
[0032]可以使用本领域已知的典型方法从培养基中分离L-氨基酸。分离方法的实例可以包括:离心、过滤、离子交换层析、结晶等。例如，可以通过低速离心从培养物中移除生物质，并可以通过离子交换层析纯化产生的上清液。
[0033]另一方面，本发明涉及生产L-氨基酸的方法，包括在含有蔗糖的培养基中培养上述棒杆菌，和从培养物分离L-氨基酸的步骤。就这一点而言，由生产L-氨基酸的棒杆菌产生的L-氨基酸可以为，但不具体限于，L-赖氨酸、L-苏氨酸或L-谷氨酸。
[0034]在本发明的一个实施方案中，生产L-赖氨酸的方法包括在含有蔗糖的培养基中培养上述棒杆菌，和从培养物收集L-氨基酸的步骤。
[0035]在本发明的另一个实施方案中，生产L-苏氨酸的方法包括以下步骤:将包含cscK启动子连接的果糖激酶基因cscK的表达载体和包含苏氨酸生物合成相关基因及输出相关基因的质粒载体引入谷氨酸棒杆菌KFCC10881内，以获得转化菌株，随后培养该菌株并从培养物收集L-苏氨酸。就这一点而言，包含cscK启动子连接的果糖激酶基因cscK的表达载体优选为pDZTn-pCj7_CSCK或pDZTn-lySCPl_CSCK，但不具体限于此。包含苏氨酸生物合成相关基因及输出相关基因的质粒载体优选为pECCG117-homthrBCE，但不具体限于此。
[0036]在本发明的另一个实施方案中， 生产L-谷氨酸的方法包括以下步骤:将包含cscK启动子连接的果糖激酶基因cscK的表达载体引入谷氨酸生产菌株一谷氨酸棒杆菌KTCC10774内，以获得转化菌株，随后培养该菌株并从培养物收集L-谷氨酸。就这一点而言，包含cscK启动子连接的果糖激酶基因cscK的表达载体优选为pDZTn-pCj7_CSCK或pDZTn_lysCPl_cscK,但不具体限于此。
[0037]根据本发明的一个实施例，相比引入已知的丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutyricum)来源的果糖激酶基因-CFK(韩国专利第0564805号)，引入埃希氏菌
来源的果糖激酶基因cscK或mak极大地增加了 L-赖氨酸的生产力。具体来说，当引入与异质的启动子pc j7或IysCPl而非其固有启动子连接的果糖激酶基因cscK时，效果提高更多(表1)。此外，当将通过引入与pcj7启动子连接的果糖激酶基因cscK而转化的菌株培养在含有蔗糖作为碳源的培养基中时，由蔗糖水解产生的果糖并没有被分泌到培养基中，因此通过存在于培养基中的蔗糖的胞内水解产生的果糖被完全磷酸化，并在糖酵解中被利用(图1)。此外，相比没有引入果糖激酶基因的情形，当引入果糖激酶基因时，果糖激酶活性增加了 1.95至4.24倍。相比引入已知的果糖激酶基因的情形，当引入果糖激酶基因中的cscK时，果糖激酶活性增加了 1.80至2.16倍(表3)。
[0038]通过引入埃希氏菌来源的果糖激酶基因而转化的菌株不仅增加了 L-赖氨酸的生产力，还增加了其他L-氨基酸一L-苏氨酸(表4)和L-谷氨酸(表5)的生产力。因此，通过引入本发明的埃希氏菌来源的果糖激酶基因而转化的菌株可以用于生产所有的L-氨基酸。
[0039]因此，本发明发明人将显示最优效果的用pDZTn_pcj7_cscK转化的转化株(KFCC-10881-Pcj7_cscK)命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CA01-2012，并于2011年3月28日将其保藏于韩国微生物培养中心(Korean CultureCenter of Microorganisms,下文缩写为“KCCM”，361-221，Yurim B/D, Hongje-l-dong, Seodaemun-gu, SEOUL 120-091, Republic of Korea)，其登录号为 KCCMl 1183P。
[0040]本发明的实施例
[0041]下文中，将参考实施例对本发明进行更详细地描述。然而，这些实施例仅用于说明目的，并且本发明并不意图受限于此。
[0042]实施例1:大肠埃希氏菌来源的果糖激酶基因的获得和载体的构建
[0043]大肠埃希氏菌来源的果糖激酶基因的碱基序列已经被清晰揭示和公开。来源于大肠埃希氏菌EC3231 (登录号X81461)的cscK基因(SEQ ID N0.17)和来源于W3110(登录号AC000091)的mak基因(SEQ ID N0.18)的序列信息从NIH GenBank获得。
[0044]基于报导的碱基序列，合成了具有5’端EcoRI限制位点和3’端SpeI限制位点的引物，并使用购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的大肠埃希氏菌W菌株(ATCC9637)的染色体作为模板，以PCR扩增包含启动子区的约1200bp的cscK基因(使用以下的SEQ ID N0.1和2引物)，以及mak基因(使用以下的SEQ ID N0.3和4引物)。此时，在以下条件下进行PCR，包括94°C变性5分钟，30个循环的94°C变性30秒、56 °C退火30秒和72°C聚合I分钟，随后72°C聚合7分钟。
[0045]SEQ ID N0.1:5’-gcgaattcgaaaatggggataga-3’
[0046]SEQ ID N0.2:5，-gcactagtattacctgcctgtcg-3’
[0047]SEQ ID N0.3:5’ _cagaattcacgtgcgttaacgcatcg_3’
[0048]SEQ ID N0.4:5，_ctactagtcaccttttgtaggcctga_3，
[0049]用EcoRI和SpeI限制酶处理两条扩增的果糖激酶基因的多核苷酸。得到每种DNA片段，随后将其连接入PECCG117的EcoRI和SpeI位点内，其中pECCG117为大肠埃希氏菌和棒杆菌的穿梭载体。其后，用该载体转化大肠埃希氏菌DH5ci，并涂布在含有卡那霉素的LB固体培养基上。挑选用含有PCR扩增基因的载体转化的克隆，随后通过已知的质粒抽提方法获取质粒，将其分别命名为“pECCG117-cscK”和“pECCG117_mak”。
[0050]实施例2:果糖激酶基因至赖氨酸生产菌株的引入和赖氨酸生产力的比较
[0051]使用电脉冲法，用pECCG117-cscK或pECCG117_mak载体转化L-赖氨酸生产菌株——谷氨酸棒杆菌KFCC10881，并挑选卡那霉素抗性克隆。
[0052]培养了用两种来源于大肠埃希氏菌的果糖激酶基因转化的菌株和用上述丙酮丁醇梭菌来源的果糖激酶CFK (韩国专利第0564805号)转化的菌株，并比较了它们的赖氨酸生产力。
[0053]将每种菌株接种到含有25ml种子培养基(加入了 25 μ Ι/ml的卡那霉素)的250ml角挡板瓶(corner-baffle flask)中，并在200rpm和30°C下震荡培养20小时。此时,种子培养基(PH7.0)具有以下组份:蔗糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物10g、尿素5g、KH2P044g、K2HP048g、MgSO4.7Η200.5g、生物素100 μ g、盐酸硫胺1000 μ g (基于IL的生产用水)。
[0054]接着，将Iml种子培养液接种到含有24ml生产培养基(加入了 25 μ Ι/ml的卡那霉素)的250ml角挡板瓶中，并在200rpm和30°C下振荡培养72小时。此时，生产培养基(pH7.0)具有以下组分:蔗糖80g、糖蜜或预处理过的糖蜜(作为还原糖)20g、玉米浆 5g、(NH4) 2S0440g、尿素 4g、KH2PO4Ig' NaC12.5g、MgSO4.7H201g、FeSO4.7H2010mg、MnSO4.5Η2010π^、生物素 100 μ g、盐酸硫胺 200 μ g、CaC0340g、L_ 亮氨酸 0.4g (如有必要)、L-苏氨酸0.1g (如有必要)、L-甲硫氨酸0.1g (如有必要)(基于IL的生产用水)。
[0055]最后，结束培养，并通过HPLC测定L-赖氨酸的平均浓度(见表1)。
[0056]表1 [0057]依据引入的果糖激酶基因的L-赖氨酸浓度的比较(单位:g/L)
[0058]
实验组j菌株Il-赖氨酸的平均浓度~
1KFCC10881/pECCG11732?9
2KFCC10881/pECCG117-cscK
3KFCC10881/pECCGII7-mak 35?4
4KFCC10881/pECCG-CFKΜΛ
[0059]如表1中所显示，用果糖激酶基因转化的菌株(实验组2-4)比没有用果糖激酶基因转化的菌株(实验组I)显示更高的L-赖氨酸平均浓度。在用果糖激酶基因转化的菌株中，用cscK或mak转化的菌株(实验组2和3)比用已知的果糖激酶基因转化的菌株(实验组4)显示更高的L-赖氨酸平均浓度。
[0060]因此，为了更有效地生产L-赖氨酸，使用来源于大肠埃希氏菌的果糖激酶基因比使用已知的果糖激酶基因更优选。
[0061]实施例3:用于替代cscK基因启动子的重组载体的构建及染色体引入
[0062]为了将大肠埃希氏菌来源的果糖激酶基因引入棒杆菌的染色体内，使用引入了棒杆菌的转座子基因的载体PDZTn (韩国专利公开第2009-0107665号)作为基础载体。从两种大肠埃希氏菌来源的果糖激酶基因中挑选出了 cscK基因，因为其显示高得多的赖氨酸生产力。将来源于棒杆菌的强启动子连接到cscK基因起始密码子的上游以增加其表达水平。
[0063]基于SEQ ID N0.17，仅扩增了 ORF区，并合成了具有5’端NdeI限制位点和3’端SpeI限制位点的引物(以下的SEQ ID N05和6)，且使用大肠埃希氏菌W菌株(ATCC9637)的染色体DNA作为模板来PCR扩增cscK基因的ORF (约900bp)。此时，使用与实施例1相同的方式进行PCR。
[0064]SEQ ID N0.5:5’ _atgccatatgtcagccaaagtatg_3’
[0065]SEQ ID N0.6:5’ _atgcactagtattacctgcctgtcg_3’
[0066]合成了能扩增产氨棒杆菌来源的pcj7启动子并具有5’端SpeI限制位点和3’端NdeI限制位点的引物(以下的SEQ ID N0.7和8)，并使用产氨棒杆菌菌株的染色体DNA作为模板来PCR扩增约300bp的启动子区。此时，在以下条件下进行PCR:包括94°C变性5分钟，30个循环的94°C变性30秒、56 °C退火30秒、72 °C聚合30秒，随后72°C聚合7分钟。
[0067]SEQ ID N0.7:5’ _atgcactagtatagggagcgttgac_3’
[0068]SEQ ID N0.8:5’ _atgccatatgtgtttcctttcg_3’
[0069]此外，合成了能扩增谷氨酸棒杆菌来源的IysCPl启动子并具有5’端SpeI限制位点和3’端NdeI限制位点的引物(以下的SEQ ID N0.9和10)，并使用谷氨酸棒杆菌菌株的染色体DNA作为模板来PCR扩增约300bp的启动子区。此时，使用与上述的实施例3相同的方式进行PCR。
[0070]SEQ ID N0.9:5’ _ttcatatgtgtgcacctttcgatcta_3’
[0071]SEQ ID N0.10:5’-ttactagtgattgttaatgccgatgcta-3’
[0072]用SpeI和NdeI限制酶处理扩增的果糖激酶基因的多核苷酸和启动子区的多核苷酸来获得每种DNA片段。使用DNA连接酶，将启动子和cscK基因的DNA片段连接到通过用限制酶SpeI处理pDZTn得到的DNA片段上，以构建pDZTn-pc j7_cscK载体和pDZTn_lysCPl_cscK载体。
[0073]实施例4 =CSdi基因表达改良的菌株的赖氨酸生产力的比较
[0074]使用电脉冲法，用实施例3中制备的两种表达载体——pDZTn-pcj7_cscK和PDZTn-lysCPl_cscK中的每种载体转化L-赖氨酸生产菌株——谷氨酸棒杆菌KFCC10881。挑选在染色体的转座子区具有果糖激酶基因启动子替换的菌株，并以与实施例2中相同的方法进行培养。测定从中收集的L-赖氨酸的平均浓度(表2)。
[0075]表2
[0076]依据引入的启动子的L-赖氨酸浓度的比较(单位:g/L)
[0077]
【权利要求】
1.用于生产L-氨基酸的棒杆菌(Corynebacteriumsp.),其包含可操作地连接至基因表达单元的埃希氏菌(Escherichia sp.)来源的果糖激酶基因。
2.如权利要求1所述的用于生产L-氨基酸的棒杆菌(Corynebacteriumsp.),其中所述果糖激酶基因为cscK或mak。
3.如权利要求1所述的用于生产L-氨基酸的棒杆菌(Corynebacteriumsp.),其中所述果糖激酶基因具有SEQ ID N0.17或SEQ ID N0.18的核苷酸序列。
4.如权利要求1所述的用于生产L-氨基酸的棒杆菌(Corynebacteriumsp.),其中所述基因表达单元被可操作地连接至载体，并通过转化被包含在棒杆菌内，或通过插入棒杆菌的染色体中被包含在棒杆菌内。
5.如权利要求1所述的用于生产L-氨基酸的棒杆菌(Corynebacteriumsp.),其中所述基因通过基因表达调控区的修饰而过表达。
6.如权利要求5所述的用于生产L-氨基酸的棒杆菌(Corynebacteriumsp.),其中所述调控区为选自以下的启动子:cscK启动子、mak启动子、pcj7启动子、IysCPl启动子、EF-Tu启动子、groEL启动子和aceAB启动子。
7.如权利要求1所述的用于生产L-氨基酸的棒杆菌(Corynebacteriumsp.),其中所述L-氨基酸为L-赖氨酸、L-苏氨酸或L-谷氨酸。
8.如权利要求1所述的用于生产L-氨基酸的棒杆菌(Corynebacteriumsp.),其中所述棒杆菌被用包含苏氨酸生物合成相关基因和输出相关基因的载体进一步转化。
9.如权利要求8所述 的用于生产L-氨基酸的棒杆菌(Corynebacteriumsp.),其中所述苏氨酸生物合成相关基因为hom-thrB或hom_thrC,且所述苏氨酸输出相关基因为hom-thrE。
10.如权利要求1所述的用于生产L-氨基酸的棒杆菌(Corynebacteriumsp.),其中所述棒杆菌选自:谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、黄色短杆菌(Brevibacterium fIavum)和发酵短杆菌(Brevibacterium fermentum)。
11.如权利要求10所述的用于生产L-氨基酸的棒杆菌(Corynebacteriumsp.),其中所述棒杆菌为L-赖氨酸生产菌株-谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)KFCC10881。
12.如权利要求10所述的用于生产L-氨基酸的棒杆菌(Corynebacteriumsp.),其中所述棒杆菌为谷氨酸生产菌株-谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)KTCC10774。
13.如权利要求1所述的用于生产L-氨基酸的棒杆菌(Corynebacteriumsp.),其中所述转化的菌株具有登录号KCCMl1183P。
14.生产L-氨基酸的方法，包括以下步骤: (i)培养权利要求1至13中任一项所述的棒杆菌(Corynebacterium sp.);和 (?)从培养物中收集L-氨基酸。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述L-氨基酸为L-赖氨酸、L-苏氨酸或L-谷氨酸。
16.生产L-氨基酸的方法，包括以下步骤:(i)在包含鹿糖作为碳源的培养基中培养权利要求1至13中任一项所述的棒杆菌(Corynebacterium sp.);和 (?)从培养物中收集L-氨 基酸。
【文档编号】C12N1/21GK103476922SQ201280016303
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2012年4月2日 优先权日:2011年4月1日
【发明者】裵贤原, 金亨俊, 文准玉, 张在佑, 金锺哲, 金泰韩, 成珍锡, 李庚翰, 金大哲, 金孝珍, 裵贤爱, 林相曹 申请人:Cj 第一制糖株式会社