Mir-124的合成模拟物的制作方法

Mir-124的合成模拟物的制作方法
【专利摘要】实施方案关注牵涉miR-124模拟物的方法和组合物。在一些实施方案中，提供了具有经修饰的核苷酸的双链RNA分子，其具有含miR-124序列的活性链和互补的过客链。
【专利说明】MIR-124的合成模拟物
[0001]发明背景
[0002]本申请要求2011年2月3日提交的美国临时专利申请61/439，272的优先权，其在此通过提交完整收录。
[0003]1.发明领域
[0004]本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体而言，提供了用于治疗疾病和/或状况的牵涉RNA分子的方法和组合物，所述RNA分子至少具有miR-124的功能特性，和在一些实施方案中增强的与miR-124相关的特征。
[0005]I1.背景
[0006]在2001年，几个小组使用克隆方法从秀丽隐杆线虫(C.elegans)、果蝇(Drosophila)、和人分离并鉴定一大类“微小 RNA，，(miRNA) (Lau 等，2001; Lee 和Ambros, 2001;Lagos-Quintana 等，2003)。
[0007]发表的人成熟微小RNA序列(其记载于数据库miRBasel5.0 (Griffths-Jones等，2006))大小范围为长度16-27个核苷酸，并且源自较长的前体。前体形成的结构在自身互补区中自身折回，并且受到核酸酶Dicer(在动物中)或DCLl(在植物中)加工以生成短的双链成熟miRNA。成熟的miRNA链之一掺入蛋白质和miRNA的复合物中，所述复合物称作RNA诱导的沉默复合物(RISC)。miRNA引导RISC复合物靶向mRNA，然后，该mRNA受到切割或翻译沉默，这取决于miRNA 与其靶mRNA的序列互补性程度。目前，认为完全或几乎完全互补性导致mRNA降解，如在植物中最常观察到的。比较而言，不完全碱基配对(如主要在动物中找到的)导致翻译沉默。然而，目前的数据提示额外的复杂性(Bagga等，2005;Lim等，2005)，而且miRNA实现的基因沉默的机制仍然在紧张的研究下。
[0008]研究已经显示了众多miRNA的表达水平变化与各种癌症有关(综述见Calin和Croce, 2006;Esquela-Kerscher 和 Slack, 2006 ;ffiemer, 2007)。miRNA还已经牵涉调节细胞生长及细胞和组织分化，即与癌症形成有关的细胞过程。
[0009]多种miRNA的活性已经得到鉴定和分析。虽然先前在美国专利申请公开文本20080050744 (其在此通过提及收录)中已经鉴定有效的miRNA模拟物，但是需要大大改善天然存在的miRNA的一种或多种特性的别的miRNA模拟物，特别在这些分子从实验室移向临床时。
[0010]发明概述
[0011]治疗性微小RNA应当是稳定的、有活性的、且与正确的mRNA靶物特异性杂交。实施方案关注miR-124模拟物，其具有维持的和/或增强的对核酸酶消化的抗性、与正确的靶mRNA的杂交能力、和/或功能性。
[0012]实施方案关注含有成熟miR-124序列的不同RNA分子。RNA分子可以是双链的和/或平端的，这意味着该分子整个是双链的和/或在两个末端是平端的。此外，实施方案关注对所述RNA分子的化学修饰以产生具有改善的或增强的特性的miR-124模拟物。双链RNA分子的活性链含有成熟miR-124序列。在某些实施方案中，双链RNA分子的一条链的序列由成熟miR-124序列组成。[0013]在一些实施方案中，提供了双链的RNA分子，这意味着该分子由两条可以彼此分开的多核苷酸或链组成。双链分子不包含发夹分子，其是一条链或多核苷酸。在一些实施方案中，RNA分子在一个或两个末端是平端的。在双链RNA分子中，一条或两条链的长度可以是18、19、20、21、22、23、24、或25个核苷酸，或者其中可导出的任何范围。在某些实施方案中，双链平端分子的长度是20、21、或22个碱基对(bp)。
[0014]在一些实施方案中涵盖的是，双链RNA分子含有两条彼此完全互补的链，这生成必然平端的分子。
[0015]在某些实施方案中，RNA分子具有包含成熟人miR-124序列(5，-UAAGGCACGCGGUGAAUGCC-3，) (SEQ ID NO:1) (20 聚体)的活性链。在某些实施方案中，成熟miR-124序列具有SEQ ID NO:1及5’端额外的U和3’端额外的A的序列(5，-UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA-3’)(SEQ ID NO: 2) (22 聚体)。如此，在某些实施方案中，RNA分子具有的活性链具有SEQ ID NO: 2的核苷酸2到21的序列。在别的实施方案中，RNA分子具有的活性链具有SEQ ID NO: 2的核苷酸2到21的序列，但是其长度是21或22个核苷酸，这是因为I)在5’端有额外的选自下组的核苷酸4、(:、6、和1和/或2)在3’端有额外的选自下组的核苷酸:A、C、G、U。如此，在前一句中讨论的实施方案中明确涵盖有具有SEQ ID N0:2的序列的活性链的RNA分子。在一些实施方案中，活性链在一个或多个内部位置处具有经修饰的核苷酸。
[0016]按照惯例，本文中讨论的序列以5’至3’列出，除非另有规定。此外，含有SEQ IDNO序列的链具有从5’至3’的所述序列，除非另有规定。
[0017]术语“内部位置”指在链中既不是第一个也不是最后一个位置的位置。术语“经修饰的核苷酸”意指与未修饰的核苷酸相比具有别的模块(moiety)或替换模块的核苷酸或核苷(若指5’位置处的核碱基的话)。在含有一个或多个经修饰的核苷酸的活性链的情况下，涵盖的是，有不少于，或者有不超过2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个经修饰的核苷酸，或其中可导出的任何范围。明确涵盖的是，在一些实施方案中，活性链中少于每个的核苷酸是经修饰的，并且在某些实施方案中，活性链中少于半数的核苷酸是经修饰的。此外，在一些实施方案中，明确涵盖的是，具有多个经修饰的核苷酸的活性链没有使该活性链中的每个或每隔一个核苷酸被修饰。本文中公开的miRNA模拟物是序列和/或位置特异性的。
[0018]在一些实施方案中，活性链包含至少两个经修饰的核苷酸。在别的实施方案中，活性链在任一末端的前两个位置中没有经修饰的核苷酸。在其它实施方案中，活性链在距5’端的前四个位置中不包含经修饰的核苷酸。
[0019]在一些实施方案中，活性链可以包含SEQ ID NO:1的成熟miR-124序列(5，-UAAGGCACGCGGUGAAUGCC-3’ )或者包含 SEQ ID NO: 2 (5，-UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA-3’)的核苷酸2到21的序列。SEQ ID N0:2具有SEQ ID NO:1的成熟miR-124序列以及5’端额外的U和3’额外的A。在这些中的任一实施方案中，活性链包含相同序列。在别的实施方案中，活性链具有包含SEQ ID N0:2或由SEQ ID N0:2组成的序列。在一些实施方案中，活性链可以具有经修饰的核苷酸，其中相对于SEQ ID NO:提及那些经修饰的核苷酸的身份。
[0020]在具体的实施方案中，活性链中的经修饰的核苷酸是相对于SEQ ID NO:2位于位置 5 (G)、6 (G)、7 (C)、8 (A)、11 (C)、12 (G)、17 (A)、18 (U)、19 (G)、和 / 或 20 (C)的核苷酸。这意味着它们是与所列SEQ ID NO中所列位置中的那些核苷酸对应的核苷酸。此外，这些所列的核苷酸分别位于 SEQ ID NO:1 ψ 的位置 4 (G)、5 (G)、6 (C)、7 (A)、10 (C)、11 (G)、16 (A)、17 (U)、18 (G)、和/或19 (C)。在其它实施方案中，活性链具有位于活性链中下列位置处的经修饰的核苷酸:4、5、6、7、8、10、11、12、16、17、18、19、和 / 或 20。
[0021]包含SEQ ID NO:2的核苷酸2到21的序列且相对于SEQ ID NO:2在位置5处具有经修饰的核苷酸的活性链意味着SEQ ID NO: 2的2-21的序列中的第一个G是经修饰的。换言之，除非另有规定，SEQ ID NO背景中的经修饰的核苷酸是核苷酸特异性的。在包含SEQID NO: 2 (长度为22个残基)的22个碱基的活性链的情况下，相对于SEQ ID NO: 2的经修饰的核苷酸的位置在22个碱基的活性链中构成相同的所列位置，因为22个碱基的活性链与SEQ ID N0:2具有相同序列。在这些情况下，活性链中的经修饰的核苷酸是位于SEQ IDNO: 2 ψ 的位置 5 (G),6 (G)、7 (C)、8 (A)、11 (C)、12 (G)、17 (A)、18 (U)、19 (G)、和 / 或 20 (C)处的核苷酸。
[0022]如此，在某些实施方案中，RNA分子具有活性链，该活性链具有SEQ ID NO: 2的核苷酸2到21的序列。在一些实施方案中，活性链在一个或多个内部位置处具有经修饰的核苷酸。在别的实施方案中，活性链包含至少两个相对于SEQ ID NO: 2位于位置5(G)、6 (G)、7(0,8 (A)、11 (C)、12 (G)、17 (A)、18⑶、19 (G)、和/或 20 (C)的经修饰的核苷酸。在其它实施方案中，有至少3、4、5、6、7、8、9、或10个相对于SEQ ID NO: 2位于位置5 (G)、6 (G)、7 (C)、8 (A)、11 (C)、12 (G)、17 (A)、18⑶、19 (G)、和/或20 (C)的经修饰的核苷酸(或其中可导出的任何范围)。
[0023]在特定核苷酸碱基命名(为“A”、“C”、“G”、或“U”)并描述为“相对”于序列(诸如SEQ ID NO:2)中的位置时，这意味着在链中涵盖所述特定命名的核苷酸的修饰，即使其位置变化I或2个位置(±1或±2个位置)(由于相对于参照序列的缺失或插入)。在其它实施方案中，经修饰的核苷酸相对于链中的位置描述，而不描述为相对于特定的SEQ IDNO:2 ;在所述情况中，位置指链中的位置，其中链的5’端以位置I开始，并且继续到2、3、4，等等，直到达到3’端的核苷酸位置。
[0024]在某些实施方案中，活性链包含不超过六个经修饰的核苷酸。
[0025]在其它实施方案中，活性链具有相对于SEQ ID NO:2在下列一个或多个位置处的经修饰的核苷酸:I (U)、2 (U)、3 (A)、4 (A)、9 (C)、10 (G)、11 (C)、12 (G)、13 (G)、14 (U)、15 (G)、16(A)、21 (C)、和/或22(A)。在其它实施方案中，活性链具有在活性链中的位置1、2、3、4、
8、9、10、12、13、14、15、16、20、21、和/或22处的经修饰的核苷酸。这些可以代替本文中讨论的其它位置处的修饰或者在本文中讨论的其它位置处的修饰外。
[0026]在一些实施方案中，活性链包含相对于SEQ ID NO: 2在位置7 (C)和8 (A)处的经修饰的核苷酸。在别的实施方案中，活性链进一步包含相对于SEQ ID N0:2在位置17(A)和18 (U)处的经修饰的核苷酸或相对于SEQ ID NO: 2在位置9 (C)、10 (G)、11 (C)、和12 (G)处的经修饰的核苷酸。在其它实施方案中，活性链具有活性链中位置8、9、10、12、16、17、和/或18处的经修饰的核苷酸。这些可以代替本文中讨论的其它位置处的修饰或者在本文中讨论的其它位置处的修饰外。
[0027]在一些实施方案中，双链的RNA分子含有包含整个或部分的成熟miRNA序列的活性链和与活性链完全或部分互补的过客链两者。在一些实施方案中，过客链与活性链是，至少是，或者至多是 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、或100%互补的，或其中可导出的任何范围。在某些实施方案中，活性和过客链彼此完全互补。
[0028]在含有一个或多个经修饰的核苷酸的过客链的情况下，涵盖的是，有不少于，或有不超过2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个经修饰的核苷酸，或其中可导出的任何范围。明确涵盖的是，在一些实施方案中，过客链中少于每个的核苷酸是经修饰的，并且过客链中少于半数的核苷酸在某些实施方案中是经修饰的。此外，在一些实施方案中，明确涵盖的是，具有多个经修饰的核苷酸的过客链没有使该过客链中的每隔一个核苷酸被修饰。
[0029]在此类实施方案中，过客链包含5’端的核苷酸修饰，其可以称为5’端修饰。此类末端修饰可以就5’端的核苷酸(或核苷，若其缺乏磷酸根基团的话)而言。此末端修饰在一些实施方案中明确为不是糖分子(sugar molecule)修饰的修饰。明确涵盖的是,此修饰可以是下列一项:NH2、生物素、胺基团、低级烷基胺基团、NHCOCH3、乙酰基基团、2 ’ O-Me、DMTO、荧光素、硫醇、吖啶、间隔物18(PEG)酰胺酯(amidite) (DMT-六(乙二醇))，或具有此类官能性的任何其它基团。在具体的实施方案中，过客链上的5’端修饰是C6胺接头。在其它实施方案中，过客链5’端的核苷酸可以具有非糖修饰(non-sugar modification)和糖修饰(sugar modification)两者。
[0030]在一些实施方案中，过客链在相对于过客链的5’端的前6个核苷酸和/或后6个核苷酸中含有至少一个经修饰的核苷酸。在其它实施方案中，过客链具有，具有至少，或者具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个经修饰的核苷酸，或其中可导出的任何范围。
[0031 ] 在某些实施方案中，过客链包含相对于SEQ ID NO: 4 (5 ’ -UGGCAUUCACCGCGUGCCUUAA-3，)位于位置 I (U)、2 (G)、3 (G)、4 (C)、5 (A)、6 (U)、13 (C)、14(G)、15 (U)、16(G)、17(C)、18(C)、19(U)、20(U)、21(A)、和 / 或 22 ⑷处的经修饰的核苷酸。SEQ ID NO: 4 ^有与SEQ ID N0:2完全互补的序列。与miRBasel6.0数据库中的人miR-124序列互补物(Griffths-Jones 等，2006)(成熟 miR-124 序列是 SEQ ID NO: 1，而其互补物是 SEQID NO:3)相比，SEQ ID N0:4具有5’端额外的U和3’端额外的A。在一些实施方案中，过客链由SEQ ID NO: 3组成或包含SEQ ID NO: 3，但是不由SEQ ID NO:4组成或者不包含SEQ ID N0:4。相对于SEQ ID NO:4的经修饰的核苷酸(上文列出)在SEQ IDNO: 3 (5，-GGCAUUCACCGCGUGCCUUA-3’ )中对应于那些在位置 I (G) ,2(G) ,3(C)、4 ⑷、5 (U)、12 (C)、13 (G)、14 ⑶、15 (G)、16 (C)、17 (C)、18 ⑶、19 ⑶、和 / 或 20 (A)处的核苷酸。
[0032]在一些实施方案中，过客链包含相对于SEQ ID NO: 4在位置I (U)和22 (A)处的经修饰的核苷酸。在其它实施方案中，过客链包含相对于SEQ ID N0:4在位置2(G)和21 (A)处的经修饰的核苷酸，其可以在位置I(U)和22(A)处的修饰外或代替位置I(U)和22(A)处的修饰。在某些实施方案中，过客链包含相对于SEQ ID勵:4在位置1卬)、2(6)、3(6)、20 (U)、21 (A)、和22 (A)处的经修饰的核苷酸。进一步涵盖的是，过客链可以包含或进一步包含相对于SEQ ID NO:4在位置4(C)处的经修饰的核苷酸。在其它实施方案中，在相对于SEQ ID NO:4的位置i) I (U)和22(A)和/或ii)4(C)处的经修饰的核苷酸外，过客链进一步包含相对于SEQ ID NO: 4在位置5(A)和6 (U)处的经修饰的核苷酸。
[0033]在某些实施方案中，过客链没有相对于SEQ ID NO: 4位于位置7 (U)、8 (C)、9 (A)、10(C)、11 (C)、或12(G)处的经修饰的核苷酸，而在其它实施方案中，涵盖相对于SEQ IDNO:4的一个或多个位置。
[0034]涵盖特定活性链和特定过客链的组合。涵盖的是，本文中所描述的任何活性链可以与本文中所描述的任何过客链组合以形成双链RNA分子。在一些实施方案中，提供了包含相对于SEQ ID NO:4在位置2(G)和21 (A)处的经修饰的核苷酸的过客链和包含相对于SEQ ID NO:2在位置7(C)和8(A)处的经修饰的核苷酸的活性链。在其它实施方案中，过客链进一步包含SEQ ID NO:4中位置I⑶和22(A)处的经修饰的核苷酸，其可以代替相对于SEQ ID NO: 4在位置3 (G)和20 (U)处的修饰或者在相对于SEQ ID NO: 4在位置3 (G)和20 (U)处的修饰外。在别的实施方案中，活性链可以进一步包含相对于SEQ ID N0:2在位置17(A)和18⑶处的经修饰的核苷酸。
[0035]在一些实施方案中，提供了具有I)活性链和2)过客链的双链平端RNA分子，所述活性链具有SEQ ID NO: 2的序列和相对于SEQ ID NO: 2在位置7(C)和8 (A)处，且任选地还在位置9 (C) UO(G)Ul (C)、和12 (G)和或位置17 (A)和18⑶处的经修饰的核苷酸，所述过客链具有相对于SEQ ID N0:4的5’端修饰及前和后三个核苷酸中的核苷酸修饰，和任选地还在位置4(0、5(八)、和/或6出)处的核苷酸修饰。在某些实施方案中，活性和过客链的此组合具有过客链的5’端修饰，其中末端修饰是烷基胺诸如C6胺接头，并且核苷酸修饰在糖上在2’位置处。在具体的实施方案中，糖修饰是2’ OMe0
[0036]在一些实施方案中，提供了长度为20-22个碱基对的双链平端RNA分子，其包含:a)活性链，该活性链包含i) SEQ ID NO: 2的核苷酸2到21的序列和ii)在一个或多个内部位置处的经修饰的核苷酸，其中所述链在其5’端没有经修饰的核苷酸，且提供了不超过10个经修饰的核苷酸jPb)分开的过客链，其与活性链完全互补，并且包含5’端核苷酸修饰和更多的至少一个经修饰的核苷酸，其中相对于SEQ ID NO: 2位于位置7-19处的核苷酸不是修饰的。在具体的实施方案中，活性链包含SEQ ID N0:2的序列。
[0037]在其它实施方案中，提供了长度为20-22个碱基对的双链RNA分子，其中所述RNA分子在两个末端都是平端的，包含具有SEQ ID N0:2的核苷酸2到21的序列的活性链和分开的且完全互补的在5’端具有经修饰的核苷酸的过客链，其中所述活性链包含至少一个经修饰的内部核苷酸，且其中与缺乏内部核苷酸的任何修饰的双链平端RNA分子相比，所述双链RNA分子在存在核酸酶的情况下更稳定。
[0038]在一些实施方案中，RNA分子具有用糖修饰进行修饰的核苷酸。在具体的实施方案中，糖修饰是2’ -OMe。
[0039]具体的实施方案包括含有一种或多种能够起miRNA模拟物作用的不同RNA分子的药物组合物；差异可以涉及序列和/或修饰的类型或位置。在某些实施方案中，RNA分子包含在脂质配制剂中。在其它实施方案中，可以用脂质体、基于聚合物的纳米颗粒、胆固醇偶联偶联物、环糊精(cyclodextran)复合物、聚乙烯亚胺聚合物和/或蛋白质复合物配制RNA分子。
[0040]实施方案中还列出用于对细胞提供miR-124活性的方法。在一些实施方案中，提供了用于对细胞提供miR-124活性的方法，包括对细胞施用有效量的具有miR-124活性的RNA分子。在一些实施方案中,所述细胞是癌细胞。此类RNA分子遍及此公开内容讨论。
[0041]其它方法包括用于降低细胞增殖的方法，包括对细胞施用有效量的miR_124RNA分子，诸如本文中讨论的双链RNA分子。其它实施方案包括用于在细胞中诱导凋亡的方法，包括对细胞施用有效量的RNA分子。其它实施方案关注用于治疗患者中的癌症的方法，包括对患者施用包含一种或多种具有miRNA功能的RNA分子的药物组合物。其它实施方案关注抑制行进通过细胞周期的方法，其通过施用有效量的本文中讨论的一种或多种miR-124模拟物进行。在一些实施方案中，方法进一步包括对患者施用别的癌症疗法。在一些实施方案中，已经对患者测试癌症和/或诊断为癌症。
[0042]其它实施方案关注RNA分子用于处理癌细胞的用途，或其在降低细胞增殖、诱导凋亡或对细胞提供miR-124功能中的用途。明确涵盖与人细胞和人患者一起使用。
[0043]组合物及其使用方法可以“包含”遍及整个说明书公开的任何分子或步骤，“基本上由”或“由”遍及整个说明书公开的任何分子或步骤“组成”。就过渡相“基本上由…组成”而言，且在一个非限制性方面，本说明书中公开的组合物和方法的基本和新颖特征包括miRNA模拟物活性。
[0044]在权利要求书和/或说明书中与术语“包含/包括” 一起使用时使用词语“一个”或“一种”可以意指“一个 /种”，但是它也与“一或多个/种”、“至少一个/种”、和“一或超过一个/种”的意义一致。
[0045]涵盖的是，本文中讨论的任何实施方案可以就本发明的任何方法或组合物而言进行执行，且反之亦然。此外，可以使用本发明的组合物和试剂盒来实现本发明的方法。
[0046]贯穿本说明书，术语“约”用于指数值包括用于测定该数值的装置或方法的误差的标准差。
[0047]在权利要求书中使用术语“或”用于指“和/或”，除非明确指示指仅备选或者备选是相互排他的，尽管公开内容支持指仅备选及“和/或”的定义。还涵盖的是，也可以明确排除使用术语“或”列出的任何内容。
[0048]本发明的其它目的、特征和优点通过以下详细描述会变得显而易见。然而，应当理解虽然详细描述和具体例子指示本发明的具体实施方案，但是其仅作为例示给出，因为本发明精神和范围内的各种变化和修改从本详细描述看对于本领域技术人员会是显而易见的。
[0049]发明详述
[0050]实施方案涉及与miRNA相关的组合物和方法、以及miRNA模拟物的用途。方法包括制备此类模拟物，并使用此类模拟物来对细胞提供miRNA活性或功能。在某些实施方案中，miRNA模拟物用于治疗、预后、和诊断应用，特别是那些涉及牵涉miRNA活性或功能的状况或疾病的治疗性应用的方法和组合物。
[0051]1.核酸
[0052]核酸包括作为与成熟微小RNA( “miRNA”或“miR”)分子相同或互补的序列的序列或序列区段。一般地，成熟miRNA分子的长度是21至22个核苷酸，尽管已经报告了 16和多至27个核苷酸的长度。miRNA各自从较长的前体RNA分子(“前体miRNA”)加工。前体miRNA自非蛋白质编码基因转录。前体miRNA具有两个使得它们能够形成茎-环或折回样结构的互补性区，其在动物中受到称作Dicer的核糖核酸酶III样核酸酶酶切割。经加工的miRNA通常是茎的一部分。
[0053]经加工的miRNA(又称为“成熟miRNA”)变为较大的复合物的一部分以下调特定的靶基因。动物miRNA的例子包括那些与靶物不完全碱基配对的miRNA，其使翻译停止(Olsen等，1999; Seggerson等，2002)。siRNA分子也受到Dicer加工,但是从较长的双链RNA分子加工。siRNA不天然存在于动物细胞中，但是它们可以经由RNA诱导的沉默复合物(RISC)指导对mRNA靶物的序列特异性切割(Denli等，2003)。
[0054]A.miR-124
[0055]先前证明了 hsa-miR-124涉及调节众多细胞活性，其代表用于癌症疗法和用于其它疾病和病症的疗法的干预点(2005年5月31日提交的美国专利申请流水号11/141，707和2005年11月14日提交的流水号11/273，640，每篇通过提及完整并入本文)。例如，细胞增殖、细胞分裂、和细胞存活在人癌症中经常改变。用合成的hsa-miR-124转染人肺癌细胞(A549)和人宫颈癌细胞(HeLa)降低活细胞数目。另外，发明人显示了 miR-124显著提高两种治疗性化合物(TRAIL，即一种在癌细胞中的凋亡途径激活剂，和依托泊苷(etoposide)，即一种在癌细胞和正常细胞中激活凋亡途径的拓扑异构酶II抑制剂)在A549或HeLa细胞中诱导细胞死亡的能力。在多种细胞系中过表达合成的miR-124降低细胞增殖。在那些研究中，发明人观察到人乳腺癌细胞(BT549)、正常的人乳腺上皮细胞(MCF12A)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人前列腺癌细胞(22RV1)、人基底细胞癌细胞(TE354.T)、正常的人皮肤细胞(TE353.5k)、和人肺癌细胞(A549、CRL-5826、HTB-57)的增殖降低。在与用阴性对照miRNA转染的细胞相比时，在HeLa细胞中过表达miR-124显著减少细胞周期的G2/M期的细胞数目。发明人先前证明了 hsa-miR-124调节响应有丝分裂或凋亡刺激物在胞内信号转导中发挥功能的许多基因的表达(2008年12月I日提交的美国专利申请流水号12/325，971，其通过提交完整并入本文)。还有，其他人最近已经观察到癌细胞中miR-124的外遗传沉默调控癌基因⑶K6和肿瘤阻抑物基因Rb的活性(Lujambio等，2007)。
[0056]Hsa-miR-124在各种水平上影响胞内信号传导，并且控制分泌蛋白、跨膜生长因子受体、和胞质信号传导信号的表达。分泌蛋白包括成纤维细胞生长因子2 (FGF2)、胰岛素生长因子结合蛋白I和3(IGFBP1、IGFBP3)、转化生长因子β _2 (TGFB2)、和炎性趋化因子白介素8(2008年12月I日提交的美 国专利申请流水号12/325,971)。FGF-2是一种具有有力的促有丝分裂和血管生成活性的分泌蛋白，该分泌蛋白经由由2-3个胞外免疫球蛋白样域和胞内酪氨酸激酶域组成的跨膜受体(FGFR)将其信号传送到细胞中(Chandler等，1999)。FGF-2mRNA水平在肾、口腔和非小细胞肺癌细胞中升高(Chandler等，1999)。类似地，IL-8在多种癌症中经常是上调的，并且与肿瘤血管化、转移和不良预后相关联(Rosenkilde andSchwartz, 2004; Sparmann and Bar-Sagi, 2004)。TGFB2 是 TGF-.beta.受体(TGFBR)( 一类可以发挥肿瘤阻抑物功能的受体)的相应配体(Massague等，2000)。
[0057]受到hsa-miR-124调节的膜结合蛋白是血小板衍生的生长因子受体样G3DGFRL ；又称为I3DGF受体β样肿瘤阻抑物PRLTS)和Ras结合域家族蛋白2 (RASSF2)。(2008年12月I日提交的美国专利申请流水号12/325，971)。RASSF2是一种在肺肿瘤细胞系中经常下调的肿瘤阻抑物候选物(Vos等，2003)。RASSF2与K-Ras相互作用，并且促进细胞周期停滞和凋亡。TOGFRL也发挥肿瘤阻抑物功能，其通过杂合性丧失(LOH)或错义和移码突变而在极其多种癌症中显示功能丧失(Fujiwara等，1995;Komiya等，1997)。由于用hsa-miR-124处理癌细胞导致FGF2、IL8和IGFBP的表达水平降低，而且导致TGFB2、RASSF2和I3DGFRL表达水平升高，hsa-miR-124有可能在显示这些生长刺激或抑制蛋白的异常表达或功能的癌症患者中诱导治疗性响应(2008年12月I日提交的美国专利申请流水号12/325，971)。
[0058]受到hsa-miR-124调节的胞内信号传导分子包括I κ B激酶a (IKK α，CHUK)、c-Src (SRC)、IA类磷酸肌醇3-激酶pi 10.α.(PIK3CA)和磷脂酶C β -1 (PLCBl)的催化亚基。PLC β -1催化从磷脂酰肌醇-二 -磷酸(ΡΙΡ2)生成肌醇-1，4，5-三磷酸(ΙΡ3)和二酰甘油(DAG)，调节细胞周期的检查点和增殖信号(Lo Vasco等，2004)。(2008年12月I日提交的美国专利申请流水号12/325,971)。IKKa是胞内信号传导级联和功能的一种正调节物，用以激活转录因子核因子K B (NF K B) (Karin等，2002)。NF κ B在几种癌症类型中组成性激活，并且促进抗凋亡和存活途径。原癌蛋白c-Src是禽v-Src的人同源物，其已经以劳氏肉瘤病毒(RSV)的致瘤性组分分离(Rous, 1911;Stehelin等，1976;Yeatman, 2004)。c-Src是一种膜结合酪氨酸激酶，其响应胞内信号传导或者通过结合活化的受体酪氨酸激酶(包括EGFR、ERBB2、PDGFR和FGFR)间接响应胞外刺激物而活化。Src是相互作用蛋白的复杂网络中的一种至关重要的分子，其调节细胞粘着、运动性、侵入和增殖。c-Src在多种癌症类型中经常过表达或超活化(Yeatman，2004)。PIK3CA的基因产物响应大多数上游受体酪氨酸激酶而激活Akt信号传导途径(Vanhaesebroeck等，1997)。PIK3CA在大多数人癌症中经常获得功能获得，其或是通过扩增或过表达(诸如在卵巢和宫颈癌中)，或是通过激活体细胞突变实现(Bader and Vogt, 2004; Bader等，2005)。PIK3CA已经变为制药业中的一种新颖的药物靶物，并且也是hsa-miR-124的预测靶物。基于发明人先前的数据(2008年12月I日提交的美国专利申请流水号12/325，971，在此通过提及将其收录)，118&-11?-124负调节这些蛋白质，因此有可能发挥肿瘤阻抑物miRNA的功能。
[0059]受到hsa-miR-124调节的另一类基因及其相应的蛋白质在细胞周期的行进中发挥功能(2008年12月I日提交的美国专利申请流水号12/325,971)。这些中的一些蛋白质在转变到Gl和S期中是至关重要的，诸如细胞周期蛋白A2和E2(CCNA2，CCNE2)、细胞周期蛋白依赖性激酶2、4和6(CDK2、⑶K4、⑶K6)和细胞分裂周期6 (⑶C6)。其它蛋白质是行进到G2/M纺锤体检查点及有丝分裂期间姐妹染色单体的正确分离以维持染色体稳定性需要的。这些包括极光激酶A和B(AURKA，又称为STK6 ;AURKB，又称为STK12)、乳腺癌 I 和 2(BRCA1;BRCA2)、不受苯并咪唑抑制出芽 l(budding uninhibited bybenzimidazolesl, BUBI)、不受苯并咪唑抑制出芽I β (BUBlB)、polo样激酶I (PLKl)、细胞周期蛋白依赖性激酶I (⑶Kl，又称为⑶C2)、细胞周期蛋白BI和B2(CCNB1、CCNB2)、和细胞分裂周期20和23 (⑶C20、⑶C23，又称为后期促进复合物亚基8)。大多数这些转录物以提示hsa-miR-124阻断细胞周期行进的方式调节。
[0060]受到hsa-miR-124调节且间接控制细胞周期行进的其它分子是SKP2、MDM2和AKAP12 (2008年12月I日提交的美国专利申请流水号12/325，971)。AKAP12，又称为gravin或SSeCKS (Src抑制的C激酶底物)，发挥拴系酶-底物相互作用的激酶支架蛋白功能(Nauert等，1997)。AKAP12的表达在体外干扰由Src或Jun癌蛋白诱导的致癌细胞转化，并且在许多癌症，诸如白血病和直肠、肺和胃癌中丧失或降低(Lin and Gelman, 1997;Cohen等,2001;Xia 等,2001;Wikman 等,2002;Boultwood 等,2004;Choi 等,2004;Mori等，2006)。前列腺和胃癌中AKAP12的明显抗致癌活性将此蛋白质标记为推定的肿瘤阻抑物(Xia等，2001; Choi等，2004)。Skp2是多亚基E3泛素连接酶复合物的一种组分，其标记蛋白质用于蛋白酶体降解。一种充分表征的靶物是CDK抑制剂p27，其为Skp2的细胞周期促进活性提供解释(Carrano等，1999)。Skp2本质是致癌的，并且在多种癌症类型中显不升高的水平(Gstaiger 等，2001; Kamata 等，2005; Saigusa 等，2005; Einama 等，2006)。
[0061]hsa-miR-124也控制FAS、Bim(BCL2Lll)和MCLl (它们都与凋亡途径在功能上相关联)的表达(2008年12月I日提交的美国专利申请流水号12/325,971)。
[0062]已经显示了 miR-124在对细胞提供时具有下列活性:降低细胞存活力、抑制细胞增殖、降低细胞增殖、以及抑制行进通过细胞周期。已经在患病细胞，诸如癌细胞中显示这些活性。
[0063]B.寡聚化合物
[0064]实施方案关注miRNA模拟物，其含有能够模拟RNA分子活性的分子。RNA分子含有核苷，其是碱基-糖组合。核苷的碱基部分通常是杂环碱基模块。最常见的两类所述杂环碱基是嘌呤和嘧啶。核苷酸是进一步包含与核苷的糖部分共价连接的磷酸根的核苷。对于那些包含戊呋喃糖基糖的核苷，磷酸基团可以与糖的2’、3’或5’羟基模块连接。涵盖的是，RNA链会由核苷酸(核糖核苷酸)组成，并且5’端可以是核苷酸或核苷。换言之，可以有与核苷的糖部分连接的磷酸基团或者可以仅有替代磷酸基团的羟基基团。如本文中讨论的，在一些实施方案中，有末端核苷或核苷酸的修饰，其中化学模块或基团经由目前是或先前是羟基或磷酸基团的结构而附接于所述糖。
[0065]在形成寡核苷酸中，磷酸基团将相邻的核苷彼此共价连接以形成线性聚合化合物。可以通过杂交或通过形成共价键连接此线性聚合结构的相应末端以形成环形结构。另外，线性化合物可以具有内部核碱基互补性，并且因此可以以如下的方式折叠，使得生成完全或部分双链的结构。在寡核苷酸结构内，磷酸基团通常称为形成寡核苷酸的核苷间连接。RNA和DNA的正常核苷间连接是3’至5’磷酸二酯连接。
[0066]在一些实施方案中，提供了具有介于17和130个残基之间的长度的RNA、RNA分子、或RNA类似物。实施方 案关注合成的miRNA分子，其长度是，至少是，或者至多是15、16、
17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或 40 或
更多个残基，包括其中可导出的任何整数或任何范围。双链RNA分子中的每条链或RNA分子可以是如上文所述的此类长度。在一些实施方案中，RNA分子在一个或两个末端上具有平端。在某些实施方案中，RNA分子在具有活性链5’端的一侧具有平端。在其它实施方案中，RNA分子在具有过客链5’端的一侧具有平端。
[0067]本文中所描述的RNA分子可以具有一条或两条链。在具有两条链的分子中，两条链可以彼此杂交，但是它们不通过核苷间连接彼此连接。
[0068]在某些实施方案中，包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2或者由SEQ ID NO:1或SEQID NO: 2组成(或者由与所述SEQ ID NO之一具有至少90%同一性的序列组成)的此类RNA分子具有位于活性链中位置 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、和/或21处的经修饰的核苷酸或核苷(位置I是5’端)。在其它实施方案中，经修饰的核苷酸或核苷位于过客链中的位置 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、和/或21 (位置I是5’端)，所述过客链包含SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4或者由SEQ IDN0:3或SEQ ID N0:4组成(或者由与所述SEQ ID NO之一具有至少90%同一性的序列组成)。对修饰的核苷酸的命名是位置特异性的，而不是核苷酸特异性的。因而，讨论核苷酸特异性修饰的实施方案，例如，“包含相对于SEQ ID NO: 4在位置2 (G)和21 (A)处的经修饰的核苷酸的过客链”可以在其它实施方案中针对位置而执行；因此，在其它实施方案中，RNA分子可以包括例如在位置2和21处有修饰的核苷酸的过客链。
[0069]在一些实施方案中，miRNA模拟物或RNA分子在两侧都是平端的。涵盖的是，在双链RNA模拟物或分子的过客或活性链的3’或5’端可以有1、2、3、4、5、或6个碱基的突出物。
[0070]在一些实施方案中，过客链和活性链不是完全互补的。涵盖的是，两条链间可以有不互补的1、2、3、4、5、6或更多个核苷酸。在一些实施方案中,这些核苷酸在过客链5’端的前10个核苷酸内。
[0071]涵盖的是，RNA模拟物具有经过或未经修饰的RNA碱基。因而，RNA模拟物是RNA或RNA分子。此外，理解的是，核酸(包括RNA)可以具有超过一条链。如本文中讨论的，在一些实施方案中，miRNA模拟物或RNA分子是双链的。除非另有规定，双链RNA分子或miRNA模拟物会理解为具有两条可以彼此分开并且不仅仅是通过发夹接头彼此连接的链。发夹分子具有一条能够分子内杂交的链。在一些实施方案中，miRNA模拟物是发夹分子。在其它实施方案中，miRNA模拟物是双链RNA分子。
[0072]在某些实施方案中，治疗性双链核酸具有第一活性链和第二过客链，所述第一活性链具有(a) “miRNA区”，其从5’至3’的序列与成熟miRNA序列的整个或区段相同，所述第二过客链具有(b) “互补区”，其从5’至3’的序列与miRNA序列是60%-100%互补的。在某些实施方案中，如下文限定的，还将这些合成的miRNA分离，或者纯化。术语“miRNA区”指合成的miRNA上与成 熟的天然存在的miRNA序列的整个序列至少75、80、85、90、95、或100%相同(包括其间的所有整数)的区域。在某些实施方案中，miRNA区与天然存在的miRNA序列，诸如人 miRNA 序列是或至少是 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1,99.2,99.3、99.4,99.5,99.6,99.7,99.8,99.9或100%相同的。或者，如通过本领域中公知的序列比对算法和方法比较的，miRNA区可以包含与天然存在的miRNA共同的18、19、20、21、22，、23、24或更多个核苷酸位置。
[0073]术语“互补区”指合成的miRNA中与成熟天然miRNA序列是相同或至少是60%互补的区域。互补区是或至少是 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1,99.2、99.3,99.4,99.5,99.6,99.7,99.8、99.9或100%互补的，或其中可导出的任何范围。在单一
多核苷酸序列的情况中，由于miRNA区和互补区之间的化学键合而可以有发夹环结构。在其它实施方案中，互补区在与所述miRNA区不同的另一核酸链上，在该情况中互补区在过客链上，而miRNA区在活性链上。
[0074]术语“寡核苷酸”在本领域中理解为指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)的寡聚物或聚合物，通常长度为不超过100个碱基或碱基对的。涵盖的是，寡核苷酸可以在5’端具有核苷。此术语包括寡核苷酸，其由天然存在的核碱基、糖和共价的核苷间连接组成。术语“寡核苷酸类似物”指具有一个或多个以与寡核苷酸类似的方式发挥功能的非天然存在的部分的寡核苷酸。与天然存在的寡核苷酸相比，此类非天然存在的寡核苷酸可以具有期望的特性，诸如例如本文中公开的那些特性，包括但不限于升高的生理学活性、在存在核酸酶的情况下的稳定性升高、和/或升高的药动学特性。
[0075]术语“寡核苷”指经由没有磷原子的核苷间连接而化学连接的核苷。核苷间连接包括短链烷基、环烷基、混合的杂原子烷基、混合的杂原子环烷基、一个或多个短链杂原子的和一个或多个短链杂环的。这些核苷间连接包括但不限于硅氧烷、硫化物、亚砜、砜、乙酰基、formacetyl、硫代 formacetyl、亚甲基 formacetyl、硫代 formacetyl、烯基(alkeneyl)、氨基磺酸盐；亚甲基亚氨基、亚甲基肼基、磺酸盐、磺酰胺、酰胺和其它具有混合的N、O、S和CH2组分部分的连接。在上文所描述的修饰外，本发明的寡聚化合物的核苷可以具有多种其它修饰。适合于具有经修饰的碱基模块和或经修饰的糖模块的实施方案的其它核苷披露于美国专利N0.6，383，808和PCT申请PCT/US89/02323，两篇在此通过提及而收录。
[0076]改变的碱基模块或改变的糖模块还包括与miRNA模拟物的目的一致的其它修饰。此类寡聚化合物最佳地记载为与天然存在的或合成的未修饰的寡核苷酸在结构上可区别，但在功能上可互换。本发明包括所有此类寡聚化合物，只要它们有效发挥功能以模拟期望的RNA或DNA寡核苷酸链的结构或功能。
[0077]在一些实施方案中，RNA模拟物包括碱基修饰或取代。RNA中的天然的或未修饰的碱基是腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，及嘧啶碱基胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U) (DNA具有胸腺嘧啶(T))。比较而言，经修饰的碱基，又称为杂环碱基模块，包括其它合成的和天然的核碱基诸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶和嘧啶碱基的其它炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、
4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代(包括5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶)、7_甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
[0078]可以使用一种或多种碱基或糖修饰来诱导3’ -内糖构象。核苷可以掺入杂环碱基、糖模块或两者的合成修饰以诱导期望的3’ -内糖构象。使用这些经修饰的核苷来模拟RNA样核苷，从而可以在维持期望的3’ -内构象几何学的情况下增强寡聚化合物的特定特性(参见美国专利申请公开 文本2005/0261218的方案I，在此通过提及而将其收录)。
[0079]在一些实施方案中，RNA模拟物尤其在一条链上具有5’端残基的修饰，所述链特别是指具有与成熟miRNA互补的序列的那条链。此链在本文中称为“过客”链。不限于理论，互补链的5’端存在与磷酸根或羟基不同的稳定模块似乎损害或消除miRNA途径复合物对过客链的摄取，随后促进miRNA蛋白质复合物对活性链的摄取。5’修饰包括但不限于NH2、生物素、胺基团、低级烷基胺基团、低级烷基基团、NHCOCH3、乙酰基基团、2’氧-甲基(2’ O-Me)、DMT0、荧光素、硫醇、或吖啶或任何其它具有此类官能性的基团。在其它实施方案中，提供了间隔物IS(PEG)酰胺酯(DMT-六(乙二醇))。在其它实施方案中，提供了 40个或更少个碳的烷基胺或烷基基团。在牵涉“低级”烷基胺或烷基基团的实施方案中，“低级”会理解为指具有20或更少个碳的分子。
[0080]在具体的实施方案中，在过客链的5’端上有C4-C12胺接头。在具体的实施方案中，在过客链的第一个核苷酸的末端磷酸根上有C6胺:
[0081]
【权利要求】
1.一种长度为20-22个碱基对的双链平端RNA分子，其包含: a)活性链,该活性链包含 i)SEQ ID NO:2的核苷酸2到21的序列，和 ?)在一个或多个内部位置处的经修饰的核苷酸，其中有不超过10个经修饰的核苷酸；和， b)过客链，该过客链与所述活性链完全互补，且包含5’端核苷酸修饰和相对于所述过客链5’端而言的前六个核苷酸和/或后六个核苷酸中至少一个另外的经修饰的核苷酸。
2.权利要求1的RNA分子，其中所述活性链包含SEQID NO:2的序列。
3.权利要求1或2中任一项的RNA分子，其中所述活性链包含至少两个经修饰的核苷酸。
4.权利要求3的RNA分子，其中所述活性链在任一端的前两个位置中没有经修饰的核苷酸。
5.权利要求1-4中任一项的RNA分子，其中所述活性链在5’端的前四个位置中不包含经修饰的核苷酸。
6.权利要求1-5中任一项的RNA分子，其中所述活性链中的所述经修饰的核苷酸选自下组:相对于 SEQ ID NO: 2 位于位置 5 (G),6 (G)、7 (C)、8 (A)、11 (C)、12 (G)、17 (A)、和 18 (U)处的核苷酸。
7.权利要求6的RNA分子，其中所述活性链包含至少两个选自所述组的经修饰的核苷酸。
8.权利要求7的RNA分子，其中所述活性链包含至少三个选自所述组的经修饰的核苷酸。
9.权利要求1-8中任一项的RNA分子，其中所述活性链包含不超过六个经修饰的核苷酸。
10.权利要求1-9中任一项的RNA分子，其中所述活性链包含相对于SEQID NO: 2在位置7 (C)和8 (A)处的经修饰的核苷酸。
11.权利要求10的RNA分子，其中所述活性链进一步包含相对于SEQID NO:2在位置17(A)和18⑶处的经修饰的核苷酸。
12.权利要求10的RNA分子，其中所述活性链进一步包含相对于SEQID NO:2在位置9(C)、10(G)、11 (C)、和12(G)处的经修饰的核苷酸。
13.权利要求1-12中任一项的RNA分子，其中所述过客链包含相对于SEQID NO:4位于位置 I ⑶、2 (G) ,3(G)、4 (C)、5 ⑷、6 ⑶、13 (C)、14 (G)、15 ⑶、16 (G)、17 (C)、18 (C)、19 ⑶、20 (U)、21 (A)、或22 (A)处的经修饰的核苷酸。
14.权利要求13的RNA分子，其中所述过客链包含相对于SEQID勵:4在位置1出)、2 (G) ,3(G)、20 (U)、21 (A)、和/或22 (A)处的经修饰的核苷酸。
15.权利要求1-14中任一项的RNA分子，其中所述过客链不含相对于SEQID NO:4位于位置7 (U)、8 (C)、9 (A)、10 (C)、11 (C)、或12 (G)处的经修饰的核苷酸。
16.权利要求1-15中任一项的RNA分子，其中所述过客链具有至少两个经修饰的核苷酸。
17.权利要求1-16中任一项的RNA分子，其中所述过客链具有至少三个经修饰的核苷酸。
18.权利要求1-17中任一项的RNA分子，其中所述过客链具有至少四个经修饰的核苷酸。
19.权利要求1-18中任一项的RNA分子，其中所述过客链具有至少五个经修饰的核苷酸。
20.权利要求1-19中任一项的RNA分子，其中所述过客链具有至少六个经修饰的核苷酸。
21.权利要求1-20中任一项的RNA分子，其中所述过客链包含相对于SEQID NO:4在位置I(U)和22(A)处的经修饰的核苷酸。
22.权利要求1-21中任一项的RNA分子，其中所述过客链包含相对于SEQID N0:4在位置2(G)和21(A)处的经修饰的核苷酸。
23.权利要求1-22中任一项的RNA分子，其中所述过客链包含相对于SEQID N0:4在位置I (U) ,2(G) ,3(G)、20 (U)、21 (A)、和22 (A)处的经修饰的核苷酸。
24.权利要求1-23中任一项的RNA分子，其中所述过客链进一步包含相对于SEQIDNO:4在位置4(C)处的经修饰的核苷酸。
25.权利要求22-24中任一项的RNA分子，其中所述过客链进一步包含相对于SEQIDNO: 4在位置5 (A)和6 (U)处的经修`饰的核苷酸。
26.权利要求22-24中任一项的RNA分子，其中所述活性链包含相对于SEQID NO: 2在位置7(C)和8(A)处的经修饰的核苷酸。
27.权利要求22-24中任一项的RNA分子，其中所述活性链进一步包含相对于SEQIDNO: 2在位置17(A)和18 (U)处的经修饰的核苷酸。
28.权利要求22-24中任一项的RNA分子，其中所述活性链进一步包含相对于SEQIDNO: 2在位置9 (C)、10(G)、11 (C)、和12(G)处的经修饰的核苷酸。
29.权利要求1-24中任一项的RNA分子，其中所述活性链包含相对于SEQID NO: 2在位置7 (C)和8 (A)处的经修饰的核苷酸。
30.权利要求1-24中任一项的RNA分子，其中所述活性链进一步包含相对于SEQIDNO: 2在位置17(A)和18 (U)处的经修饰的核苷酸。
31.权利要求1-24中任一项的RNA分子，其中所述活性链进一步包含相对于SEQIDNO: 2在位置9 (C)、10(G)、11 (C)、和12(G)处的经修饰的核苷酸。
32.权利要求1-25中任一项的RNA分子，其中所述活性链包含相对于SEQID NO: 2在位置7(C)和8(A)处的经修饰的核苷酸。
33.权利要求1-25中任一项的RNA分子，其中所述活性链进一步包含相对于SEQIDNO: 2在位置17(A)和18 (U)处的经修饰的核苷酸。
34.权利要求1-25中任一项的RNA分子，其中所述活性链进一步包含相对于SEQIDNO: 2在位置9 (C)、10(G)、11 (C)、和12(G)处的经修饰的核苷酸。
35.权利要求1-34中任一项的RNA分子，其中所述过客链的5’端修饰包含低级烷基胺基团。
36.权利要求1-35中任一项的RNA分子，其中所述经修饰的核苷酸用糖修饰来进行修饰。
37.权利要求36的RNA分子，其中所述糖修饰是2’-OMe0
38.一种长度为20-22个碱基对的双链平端RNA分子，其包含: a)活性链,该活性链包含 i)SEQ ID NO:2的核苷酸2到21的序列，和 ?)在一个或多个内部位置处的经修饰的核苷酸，其中所述链在其5’端不含经修饰的核苷酸，且有不超过10个经修饰的核苷酸；和， b)分开的过客链，该过客链与所述活性链完全互补，且包含5’端核苷酸修饰和至少一个另外的经修饰的核苷酸，其中相对于SEQ ID N0:4的序列位于位置7-19的核苷酸未被修饰。
39.一种长度为20-22个碱基对的双链RNA分子，其中所述RNA分子在两个末端是平端的，包含具有SEQ ID NO:2的核苷酸2到21的序列的活性链和分开的且完全互补的5’端具有经修饰的核苷酸的过客链，其中所述活性链包含至少一个经修饰的内部核苷酸，且所述双链RNA分子与缺 乏内部核苷酸的任何修饰的双链平端RNA分子相比，更为稳定。
40.一种药物组合物，其包含权利要求1-39中任一项的RNA分子。
41.一种用于对细胞提供miR-124活性的方法，包括对所述细胞施用权利要求1_39中任一项的RNA分子。
42.一种用于降低细胞增殖的方法，包括对所述细胞施用有效量的权利要求1-39中任一项的RNA分子。
43.一种用于在细胞中诱导凋亡的方法，包括对所述细胞施用有效量的权利要求1-39中任一项的RNA分子。
44.一种用于治疗患者中的癌症的方法，包括对所述患者施用包含权利要求1-39中任一项的RNA分子的药物组合物。
45.权利要求45的方法，进一步包括对所述患者施用额外的癌症疗法。
46.权利要求44的方法，其中所述患者已经诊断为患有癌症。
【文档编号】C12N15/113GK103459598SQ201280016445
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年2月3日 优先权日:2011年2月3日
【发明者】K.凯尔纳, D.布朗 申请人:米尔纳医疗股份有限公司