专利名称：一种用于检测沃尼妙林的分子印迹聚合物的制备方法
技术领域：
本发明涉及化合物检测领域，具体涉及一种用于检测沃尼妙林的分子印迹聚合物 的制备方法。
背景技术：
沃尼妙林(valnemulin)，是新一代截短侧耳素类(pleuromutilin)半合成动物专 用抗生素，属二萜烯类，主要用于防治猪、牛、羊、家禽的霉形体和革兰阳性菌感染。沃尼妙 林，化学名为((2- ((R) -2-氨基-3-甲基丁酰氨基)-1，1- 二甲基乙基)巯基)乙酸，(3aS, 4R，5S，6S，8R，9R，9aR，IOR)-八氢-5,8- 二羟基-4,6,9,10-四甲基-6-乙烯基-3a,9-丙 烷-3aH-环戊环辛烯-1 (4H)-酮-8-酯，其化学结构式为=C31H52N2O5S ；相对分子量；564. 8性 状白色结晶粉末，极微溶于水(160mg/L)，溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿，其盐酸盐溶于水， 熔点 174-177°C。由于沃尼妙林具有安全、高效、低毒、不易产生耐药性等特点，目前许多国家已广 泛使用。但是由于沃尼妙林的最大吸收在近紫外区，而近紫外区各种杂质的干扰又比较大， 这无疑增大了其残留检测的难度，因此，至今仍没有一种公开发表，公认稳定可靠的残留检 测方法。建立一种稳定可靠的残留检测方法就成了当前亟待解决的问题。目前报到的方法 在样品处理过程中，不仅繁琐而且运用传统的SPE填料主要为键合材料，如C8、C18及离子交 换树脂等，选择性不强，在富集分析物的同时，大量基体和干扰物质也被富集，导致洗脱液 中仍含有基体和杂质，干扰最后的色谱分析。基于类似抗原_抗体反应的分子印迹固相萃取技术具有高选择性和特异性，是一 种具有广泛应用前景的固相萃取材料。如果能像抗体一样，合成某些类似抗体的对沃尼妙 林具有高选择性的分离基质则可大大提高沃尼妙林检测的灵敏度和准确性。分子印迹(molecular imprinting)是近年来基于分子识别理论而迅速发展起来 的一个新的研究领域，分子印迹技术也被称为制造“塑料抗体”的技术。分子印迹聚合物(molecular imprinting polymers, MIPs)是一类内部具有固定 大小和形状的孔穴并具有确定排列功能基团的交联高聚物。因为MIPs是根据印迹分子定 做的，因此它具有特殊的分子结构和官能团，能选择性地识别印迹分子。分子印迹聚合物的制备一般要通过如下三个步骤1、功能单体通过与模板分子相互作用(共价或非共价键)，聚集在模板分子周围 形成可逆的复合物；2、功能单体与过量交联剂在致孔剂存在下发生共聚生成高聚物；3、将模板分子从高聚物中解离出来，在聚合物中就形成了能够识别模板分子的结 合位点。这种印迹聚合物可作为液相色谱的固定相、选择性催化剂、化学传感器的传感元 件和固相萃取剂等，在临床药物分析中也有广泛的应用。合适的模板是能制备得到对沃尼妙林具有高特异性的分子印迹聚合物的关键。沃尼妙林易溶于有机溶剂，以沃尼妙林本身为模板制备检测沃尼妙林前处理用分子印迹聚合 物，存在模板泄漏问题，对沃尼妙林具有高特异性的分子印迹聚合物难以获得。因此，寻找 一种与沃尼妙林分子结构类似的模板分子非常重要。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术中沃尼妙林的检测中存在的模板泄露、分子印迹 聚合物难以获得等问题，提供一种具有高度选择性、防止模板泄露的用于检测沃尼妙林的 分子印迹聚合物的制备方法。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现本发明选择沃尼妙林前体作为模板，采用溶液聚合法、原位聚合法、沉淀聚合法或 悬浮聚合法等本领域制备分子印迹聚合物常用的方法，都可以实现本发明，制备得到对沃 尼妙林具有高特异性的分子印迹聚合物。为了进一步提高本发明分子印迹聚合物对沃尼妙林的特异性，本发明人对其制备 方法进行了研究和优化。一种制备本发明分子印迹聚合物的方法，该方法是将模板(沃尼妙林前体)、功能 单体、交联剂、致孔剂和引发剂在50 80°C聚合24 48h，粉碎后除去模板，制备得到分子 印迹聚合物。上述模板、功能单体、交联剂、致孔剂和引发剂的用量比可选择 mmol mmol mmol mL mg = 1 (3 8) (15 40) (3 200) (10 60)。上述功能单体为甲基丙烯酸、丙烯酰胺、2-乙烯吡啶或4-乙烯吡啶等。上述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯或二乙烯苯寸。上述致孔剂为极性有机溶剂，如甲醇、乙醇、乙腈、丙酮或其相应溶液等。致孔剂一方面要保证模板的充分溶解，另一方面致孔剂用量对制备的分子印迹聚 合物强度、表面特性具有重要影响，同时致孔剂对印迹聚合物在使用介质体系中沃尼妙林 的识别也非常相关。因此本发明人对致孔剂进行了优化，结果发现当致孔剂选择乙腈时，能 够制备出对沃尼妙林具有高度特异性识别的分子印迹聚合物。上述引发剂可选择本领域常用的任何引发剂，水溶性引发剂或油溶性引发剂都可 以实现本发明，如偶氮二异丁腈、过硫酸铵等。上述粉碎后除去模板，可采用10%乙酸甲醇、甲醇去除模板。本发明制备方法的优选方案为先将模板、致孔剂和功能单体混合制备形成预聚 合物，再加入交联剂和引发剂在50 80°C聚合24 48h，粉碎后除去模板，制备得到分子 印迹聚合物。上述方法中，预聚合物的具体制备步骤为将沃尼妙林前体和致孔剂溶解混合后， 加入功能单体，混合后4°C 8°C静置过夜，形成预聚合物。本发明的制备方法的更进一步优选方案为先将模板、致孔剂和功能单体混合制 备形成预聚合物，向预聚合物中加入交联剂和引发剂，先低温(如4°C )下预聚合，再50 80°C聚合24 48h，粉碎后除去模板，制备得到分子印迹聚合物。上述预聚合为4 8 °C，热聚合24 48h。
本发明的分子印迹聚合物，经试验检测发现将该聚合物用于固相萃取净化 (150mg/柱)，聚合物结合沃尼妙林的吸附量约为1000 μ g/g聚合物；对饲料添加沃尼妙 林回收率试验表明回收率试验表明，在1-50 μ g/mL添加水平范围内，沃尼妙林回收率大于 90%。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果1.本发明的分子印迹聚合物是采用与沃尼妙林结构类似的沃尼妙林前体为模拟 模板制备，因沃尼妙林与沃尼妙林前体具有相似的分子结构，合成的聚合物能够选择性地 识别沃尼妙林，对沃尼妙林具有高特异性；2.本发明的分子印迹聚合物采用沃尼妙林前体作为模板，一方面，沃尼妙林前体 吸水性较强，有利于致孔剂的选择，另一方面，可以防止“模板泄漏”；3.本发明制备分子印迹聚合物时，采用的致孔剂为乙腈溶剂，有利于模板的溶解， 同时合成聚合物的硬度好；4.本发明的制备方法可以直接将预聚合物中加入交联剂和引发剂然后进行60°C 聚合固化，还可以先进行低温光聚合后再进行50 80°C聚合固化，这样可以进一步提高分 子印迹聚合物的特异性；5.本发明的分子印迹聚合物在水及含乙腈的溶液中对沃尼妙林呈现高的亲和性 和选择性，回收率大于90% ；6.本发明采用模拟模板法制备MIPs，克服了用目标物本身(沃尼妙林)为模板制 备的MIPs用于固相萃取填料时由于模板泄漏而导致的结果不准确问题，本发明以沃尼妙 林前体为模板制得的MIPs对沃尼妙林的高度交叉反应和显著选择性，作为分析饲料、组织 等基质中的沃尼妙林的样品前处理材料有着广泛的应用前景。
图1为沃尼妙林乙腈溶液经MIP与NIP处理比较色谱图，其中，a为NIP处理，b为 MIP处理；图2为沃尼妙林饲料提取基质乙腈溶液经MIP与NIP处理比较色谱图，其中，a为 NIP处理，b为MIP处理。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任 何限定。实施例1用于检测沃尼妙林的分子印迹聚合物本实施例的分子印迹聚合物，其合成制备步骤如下(1)预聚合物的制备称取0. 464g (Immol)沃尼妙林前体模拟模板于试管中，加入6. Oml乙腈，超声溶解 后，加入功能单体甲基丙烯酸0. 342mL(Smmol)，超声5min，4°C静置过夜，形成预聚合物。(2)热聚合向上述预聚合物中加入乙二醇二甲基丙烯酸酯4.0mL(20mmol)和偶氮二异丁腈 30mg,超声5min，通氮气5min，密封，在60°C，水浴振荡聚合24h ；
热聚合24h后，得到块状聚合物，该块状聚合物即为本实施例的用于沃尼妙林检 测的分子印迹聚合物。将上述块状聚合物磨碎、过200目筛，用甲醇反复沉降除去细小颗粒，装入 15X200mm具塞玻璃层析柱中，先用10%乙酸甲醇溶液200mL洗涤除去模拟模板沃尼妙林 前体，流速控制在lmL/min以下，再用IOOmL甲醇洗涤除去乙酸，颗粒置60°C真空干燥箱 中干燥24h，置干燥器中保存备用。制备好的颗粒填料与合成的块状聚合物相比，收率达 70%。非印迹聚合物(NIPs)的制备除不加模板分子外，均按上述方法制备和处理。实施例2用于检测沃尼妙林的分子印迹聚合物的性能测定本实施例选择实施例1制备的分子印迹聚合物(粒度为38. 5 μ m 75 μ m)装填 于3mL固相萃取空小柱(150mg/柱)中，依次用3mL甲醇、3mL水平衡活化。本实施例的样品为1、5、10及50μ g/mL系列浓度的沃尼妙林乙腈溶液，取2 5mL 的样品上样，用3mL水、3mL乙腈洗涤，压干，5%氨化甲醇5mL洗脱。氮气小心吹干，用流动 相溶解，过针头滤膜，用HPLC-UV检测。检测结果如图1所示，图中纵坐标的AU是吸光度单 位，横坐标代表时间，以分钟(min)为单位。图1中给出两条色谱曲线，其中a为沃尼妙林 乙腈溶液经NIP固相萃取小柱处理色谱曲线，b为沃尼妙林乙腈溶液经MIP固相萃取小柱 处理色谱曲线。实验结果表明，系列浓度的沃尼妙林乙腈溶液在分子印迹聚合物(MIPs)固 相萃取小柱上回收率大于95%，在非印迹聚合物(NIPs)固相萃取小柱上回收率小于25%。实施例3制备的分子印迹聚合物固相萃取柱用于饲料中沃尼妙林的测定本实施例选择实施例1制备的分子印迹聚合物(粒度为38. 5 μ m 75 μ m)装填 于3mL固相萃取空小柱(150mg/柱)中，依次用3mL甲醇、3mL水平衡活化。本实施例的样品为饲料用有机溶剂提取后，吹干，用乙腈溶解，配制10和50 μ g/ mL浓度的沃尼妙林饲料基质乙腈溶液。取2mL上样，用3mL水、3mL乙腈洗涤，压干，5%氨 化甲醇5mL洗脱。氮气小心吹干，用流动相溶解，过针头滤膜，供HPLC-UV检测。检测结果 如图2所示，图中纵坐标的AU是吸光度单位，横坐标代表时间，以分钟(min)为单位。图2 中给出两条色谱曲线，其中a为沃尼妙林饲料基质乙腈溶液经NIP固相萃取小柱处理色谱 曲线，b为沃尼妙林饲料基质乙腈溶液经MIP固相萃取小柱处理色谱曲线。实验结果表明， 沃尼妙林饲料基质乙腈溶液，在MIPs固相萃取小柱上回收率大于85%，NIPs固相萃取小柱 上回收率小于20%。
权利要求
一种用于检测沃尼妙林的分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于所述方法是以沃尼妙林前体为模板，通过本体聚合法、沉淀聚合法、原位聚合法或悬浮聚合法制备得到分子聚合物。
2.根据权利要求1所述的用于检测沃尼妙林的分子印迹聚合物的制备方法，其特征在 于所述方法是将模板、功能单体、交联剂、致孔剂和引发剂在50 80°C聚合24 48h，粉碎 后除去模板，制备得到分子印迹聚合物。
3.根据权利要求2所述的用于检测沃尼妙林的分子印迹聚合物的制备方法，其特征在 于所述方法是是先将模板、致孔剂和功能单体混合形成预聚合物，然后向预聚合物中加入 交联剂和引发剂后，最后50 80V聚合24 48h，粉碎后除去模板，制备得到分子印迹聚 合物。
4.根据权利要求3所述的用于检测沃尼妙林的分子印迹聚合物的制备方法，其特征在 于所述预聚合物的制备方法为将沃尼妙林前体和致孔剂溶解混合后，加入功能单体，混合 后在4 8°C静置过夜，形成预聚合物。
5.根据权利要求4所述的用于检测沃尼妙林的分子印迹聚合物的制备方法，其特征 在于所述模板、功能单体、交联剂、致孔剂和引发剂的比例为1 3 8 15 40 3 200 10 60 (mmol mmol mmol mL mg)。
6.根据权利要求1 4中任意一条权利要求所述的用于检测沃尼妙林的分子印迹聚合 物的制备方法，其特征在于所述功能单体为甲基丙烯酸、丙烯酰胺、2-乙烯吡啶或4-乙烯 吡啶。
7.根据权利要求1 4中任意一条权利要求所述的用于检测沃尼妙林的分子印迹聚合 物的制备方法，其特征在于所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、三甲氧基丙烷三甲基丙 烯酸酯或二乙烯苯。
8.根据权利要求1 4中任意一条权利要求所述的用于检测沃尼妙林的分子印迹聚合 物的制备方法，其特征在于所述致孔剂为乙腈、甲醇、乙醇、丙酮或其溶液。
9.根据权利要求8中任意一条权利要求所述的用于检测沃尼妙林的分子印迹聚合物 的制备方法，其特征在于所述致孔剂为体积比为20 1 4的乙腈溶液。
全文摘要
本发明涉及化合物检测领域，具体涉及一种用于检测沃尼妙林的分子印迹聚合物的制备方法。本发明用于检测沃尼妙林的分子印迹聚合物是以沃尼妙林前体为模板，通过本体聚合法、沉淀聚合法、原位聚合法或悬浮聚合法制备而得，制得的分子印迹聚合物在水溶液体系对沃尼妙林具有高度的选择性，可以高特异性识别沃尼妙林，作为分析饲料、组织等基质中的沃尼妙林的样品前处理材料有着广泛的应用前景。
文档编号C08J9/26GK101921370SQ20101025036
公开日2010年12月22日 申请日期2010年8月10日 优先权日2010年8月10日
发明者刘戎, 刘雅红, 张嘉慧, 方炳虎, 贺利民, 郭宏斌, 陈良柱 申请人:华南农业大学