人血管内皮细胞生长因子受体3结合肽及其筛选方法

专利名称：人血管内皮细胞生长因子受体3结合肽及其筛选方法
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域，涉及噬菌体随机呈现肽库的筛选、被筛选噬菌体的 亲和性检测和测序、多肽的合成、动物体内分布实验、融合蛋白的表达、纯化和体外活 性检测等技术，具体涉及人血管内皮细胞生长因子受体3结合肽的筛选方法。
背景技术：
l.多肽导向技术1. 1多肽导向技术的概念和由来生物技术的快速发展大大促进了新药发现与设计的速度，但体内用药时，如何使药 物特异性地到达病灶部位仍然是限制许多药物由实验室走向临床的一大难题。药物在其 它组织或器官的非特异性分布，不仅增大了体内用药的剂量，使得药物成本提高；而且 有可能损伤正常的组织或器官，引发毒副作用，这种毒副作用有时甚至是致死的。为了 克服这一难题，人们提出了导向性的治疗策略，该策略的理论基础是相对于正常的组织， 病灶部位(特别是肿瘤)具有自己独特的表面分子，这些分子不仅是相对特异的而且常 常是高表达的，所以若给药物连接上这些分子的配体或抗体，则借助于这些配体或抗体 和它们相应分子的结合，药物便可特异性的被带到病灶部位。该策略被认为是提高药物 特异性的有效方法，目前导向性药物的开发在药物开发领域发展处于领先地位，仅以美 国为例，其导向性药物的开发以13.2%的年增长率位居全美药物市场的首位。已有文献证明，最初作为导向性分子的为抗体，如转铁蛋白抗体，抗HER2抗体等与 药物连接后都大大提高了药物在病灶组织的富集。但是抗体由于分子量大作为导向性分 子有一些缺点，如易引发机体的免疫反应，渗透性差等，由此人们更倾向于利用小分子 肽作为导向性分子。可以作为导向性分子的肽包括两大类， 一类是天然存在的肽，如生 长激素释放抑制因子(somatostatin)、血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP) 等，它们分别在神经内分泌肿瘤、消化道癌等的特异性诊断和治疗方面发挥了良好的导 向性作用。另一类则是非天然存在的肽，与天然肽相比，该类肽的种类更多，鉴定更方 便，而且有可能比天然肽与其相应受体的亲和力更高，故该类肽成为近年来人们关注的 热点。噬菌体呈现技术则被认为是用于筛选该类肽的快速而有效的方法。1. 2噬菌体呈现随机肽库的构建及应用噬菌体呈现技术起源于Smith在1985年报道的辨外源多肽在单链噬菌体表面呈现 的结果，其原理是将编码外源多肽或蛋白的基因片断插入噬菌体衣壳蛋白的基因中，从 而将外源多肽或蛋白呈现于噬菌体表面。由于构成外源基因片段的脱氧核苷酸可以随机 地排列组合，所以可以构建呈现不同外源多肽或蛋白的噬菌体表面呈现多肽或蛋白库， 进而应用于酶底物、抗体和配体的筛选，蛋白间相互作用的研究以及疾病的诊断等方面。 近几年来，该技术迅速发展，已成为生物学研究和应用领域中重要而有效的工具。可用于噬菌体表面呈现的载体很多，如T4噬菌体、A噬菌体及丝状噬菌体等。其 中丝状噬菌体呈现系统是目前最常用，发展最快的呈现系统。丝状噬菌体是一类具有丝 杆状形态的噬菌体，在分类中属于丝杆噬菌体科(Inoviride)，丝状噬菌体属(Inovirus)。 用于表面呈现的噬菌体为一类特异性感染大肠杆菌的噬菌体，包括M13、 fd、 fl、 Ifl 和Ike等。它们具有相似的结构。以M13噬菌体为例，它的核心为6000bp的环状单链 DNA,含IO个基因，分别编码10种不同的蛋白。其中基因VIII编码主要衣壳蛋白pVm， 基因m。 VI， VII， IX分别编码次要衣壳蛋白pIII、 pVI、 pVII、 pIX。 M13噬菌体以其 次要衣壳蛋白pIII仅感染具F纤毛的大肠杆菌。丝状噬菌体自身有许多适于构建多肽库的特点。如它能够接受在衣壳蛋白中插入外 源多肽，并将外源蛋白表达后呈现于病毒颗粒表面，便于被相应的受体或抗体识别。即 使外源序列干扰病毒的生活周期，也能通过双基因或噬菌粒系统将多肽表达于表面，产 生携带野生型和重组衣壳蛋白的嵌合噬菌体。易于扩增，重组后的噬菌体能够通过感染 大肠杆菌得到扩增。对于筛选到的能够特异性结合某一靶分子的多肽噬菌体也能够再感 染大肠杆菌，扩增后测序分析其核苷酸序列。噬菌体在各种洗脱条件(如低pH)下仍然 很稳定，可以感染形成很高的滴度(一般达到1012),这样高的滴度足以代表库中所有的 克隆。1. 3导向肽的筛选筛选是指用一些方法从噬菌体文库中挑选出呈现了人们所需要的肽的噬菌体克隆。 一般情况下，第一轮筛选要投入一个库容较大的库，通过感染宿主菌，阳性噬菌体得到 扩增，然后进入下一轮筛选，从而使阳性噬菌体得到进一步富集。严谨性和产率 (stingency和yield)是两个评定筛选效率的主要参数。 一般而言增加前者往往会导致 后者的降低。目前常用的筛选方法可分为两类， 一类是体外筛选， 一类是体内筛选。当纯化的耙蛋白易于获得或高表达靶蛋白的细胞易于获得时，人们常常选用体外筛选法来对噬菌体文库进行筛选。该方法的基本流程为首先将筛选配基固定在固相载体 上，然后加入噬菌体文库。其中呈现了与配基结合肽的噬菌体被捕获于固相载体上，而 不与配基结合的噬菌体则被洗去。再用洗脱液洗脱结合的噬菌体并感染大肠杆菌得以扩 增，扩增后的噬菌体进入下一轮循环。亲和配基的固定可采用许多种固相支持物，如表 面吸附的聚丙乙烯皿或管，硝酸纤维膜和磁性珠，可渗透的珠状琼脂糖凝胶等。洗脱的 方法也有多种，常用的有低pH的缓冲液洗脱法和用配基的已知配体与噬菌体竞争的竞 争洗脱法。在有些情况下，某些抗原及标志物不易确定，获得纯化就更加困难。此时体 内筛选是比较合适的选择。体内筛选的优点是其是在体内进行的，所以肽结合的蛋白完 全保持了它们的活性状态，但是筛选出的肽究竟是与何种分子结合还有待于进一步确 定。它的基本过程是将噬菌体肽库经尾静脉注射入小鼠，待噬菌体在体内循环适宜时 间后，通过心脏对小鼠进行全身灌注，然后收集靶器官中的噬菌体，经体外扩增纯化后 再注射给小鼠，进行下一轮淘筛， 一般为3-4轮，直到噬菌体得到富集，挑取单克隆，对噬菌体表面呈现片段进行测序，推导其序列的同源性。利用体内筛选法，人们发现了 许多器官和组织特异性结合的肽。1. 4导向肽的应用由于导向肽可以特异性的识别靶向分子或靶向组织，所以，无论是在疾病的诊断还 是在疾病的治疗中都有着广阔的应用前景。在疾病诊断中方面，由于肿瘤表面分布的标志性分子可以有效的将肿瘤和其它器官 和组织区分开来，而导向多肽具有和这些标志性分子特异性结合，因此，将这些短肽与 造影剂、放射性元素等相连后用于肿瘤诊断，可使得诊断更加的方便、快捷和灵敏。目 前许多实验室和公司正在积极的开发这样的短肽。如Campa等以内皮生长因子受体的变 种III (epidermal growth factor receptor, EGFR)为靶分子从噬菌体呈现肽库中筛选出与 之结合的肽用于肿瘤的诊断，实验表明，阳性肽在低剂量GOnmol/l)时仍然可以特异 而高亲和力的与EGFR变种III结合，是十分理想的诊断分子。我们利用人转铁蛋白受 体对噬菌体呈现12肽库进行筛选，动物体内分布实验表明，筛选出的肽在肿瘤组织的富 集率是正常组织的5倍，在肿瘤的诊断中有一定的应用前景。在疾病的治疗方面，许多导向性的药物已进入临床试验阶段或正在试验室研究中。1)导向性化疗药物化疗药物如阿霉素、道诺霉素等在肿瘤的治疗中一直具有很好的作用，但是，由于 它们对正常的细胞往往也有很强的杀伤力，故在临床应用中常常受到限制。如果将这些 化学药物与肿瘤表面特异性分子的结合肽相连构建成导向性的药物，则可以大大降低已有化疗药物用药剂量，减少的其毒副作用，并且可以使得一些具有潜在肿瘤治疗价值但受其毒副作用限制而未能走向临床的化疗药物走向应用。如Wadih等将肿瘤血管内皮细 胞特异性结合肽RGD-4C与阿霉素相连构建导向性的药物RGD-4C-阿霉素，以乳腺癌小 鼠为动物模型，动物实验显示与单一的阿霉素相比，RGD-4C-阿霉素的用药量显著降低， 用药量在单一阿霉素用量的1/40时便可以使肿瘤细胞发生坏死，而在这一药物剂量下， 单一阿霉素对肿瘤是没有作用的。2)导向性蛋白药物基因工程的发展使得许多蛋白分子如细胞因子等在肿瘤的治疗中发挥着越来越重要 的作用。干扰素、肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor， TNF)等在相关肿瘤的治疗中都 显示出了良好的应用前景，但是有些生物分子在体内可能诱发严重的毒副反应，如何降 低它们的毒复作用已成为医药工作者共同关心的问题。多肽导向技术是解决这一问题的 有效策略之一。Flavio等将肿瘤血管内皮细胞特异性结合肽NGR与TNF相连构建融合 蛋白NGR-nSfF，在临床实验中NGR-TNF相对于天然TNF，对肿瘤的杀伤力显著提高， 而用药量仅为天然TNF的1/30。 Meng等利用基因工程的方法构建了导向性干扰素 IFN-a2a-NGR，体内分布实验表明相对于普通干扰素，导向性干扰素可以特异性的富集 于肿瘤组织。并且导向性干扰素的剂量在普通干扰素剂量的1/3时，即可达到与普通干 扰素同样的治疗效果。此外，急性毒性实验表明导向性干扰素在动物体内不会引起明显 的毒副作用；导向性干扰素的药代动力学行为与普通干扰素一致。目前IFN-a2a-NGR己 授权获得专利批准号。Tumstatin (胶原IVa3链的非胶原区域1)是一种内源性血管生长 抑制因子，Tum-5是由Tumstatin接近N端的54-132位氨基酸组成的，它是Tumstatin 抗血管形成的功能结构域。Ma等用基因工程的方法构建了 Tum5-NGR。在昆明种小鼠 体内接种瘤细胞S180，建立肿瘤模型，结果表明当剂量为lmg/kg时，Tum-5-NGR 的抑瘤效果优于Tum-5，抑瘤率分别为37.78%和26.83%，与对照组相比，均有明显差 异(尸<0.01)。免疫组化结果显示，与Tum-5相比，Tum-5-NGR能更好的在肿瘤新生血 管处富集。3)导向性基因治疗药物近年来，基因治疗成为继蛋白类药物之后又一个治疗肿瘤的有效方法。基因治疗的 成功依赖于基因传递载体的有效性，该载体必须可以特异的将目的基因转入足量的肿瘤 细胞内以发挥治疗作用。但是目前基因治疗所常用的大部分病毒载体的特异性都不是十 分让人满意，而导向性的基因传递系统则是解决之一问题的可能方法。如Stuart等以人 脐静脉细胞为靶细胞，从噬菌体呈现肽库种筛选到与之特异性结合的肽SIGYPLP，当该 肽与基因传递载体腺病毒相连后，与单一的腺病毒相比，SIGYPLP-腺病毒的基因转染效 率提高了 15.5倍。White等则从噬菌体肽库中筛选到与凝集素样氧化低密度脂蛋白受体 (thelectinlikeoxidizedLDLreceptor, LOX-l)特异性结合的肽LSIPPKA、 FQTPPQL和 LTPATAI。 LOX-l是一个在高血压患者的血管内皮细胞上上调的分子，实验表明当将筛 选获得的肽与腺病毒相连后可以大大提高腺病毒转染的效率和特异性，这些肽有可能用 于以LOX-l为靶点的心血管疾病的基因治疗中。 2.血管内皮生长因子受体3的研究进展 2. l血管内皮生长因子受体3及其配体血管内皮生长因子受体3 (vascular endothelia growth factor receptor 3， VEGFR-3， 又称FLT4)是血管内皮生长因子受体家族的新成员，该家族是一类与血管发生密切相 关的蛋白，均属于m型受体酪氨酸激酶(RTKs)亚家族。目前已发现的血管内皮生长 因子受体(VEGFR)有VEGFR-1(又称Flt-1) 、VEGFR-2 (又称Flt-1/ KDR)和VEGFR-3 (又称Flt-4)。VEGFR-3是迄今为止该家族最新的一个成员，其基因是1992年由Galland 等从人白血病细胞及胎盘cDNA文库中克隆得到的一种新基因，该基因位于染色体 5q34-q35，共含有31个外显子，分别编码三个不同的区域，其中1 1 5号外显子编码 胞外区，16号外显子编码跨膜区，17 31号外显子编码胞内区。除去24氨基酸残基 的信号肽，成熟的VEGFR-3含有1274个氨基酸残基,包括膜外域(751aa)，跨膜域(22aa) 和胞内域(482aa)，胞内域是两个酪氨酸激酶结构区，中间被一长肽隔开。目前己经发现的VEGFR-3的两个配体为血管内皮生长因子C和D (vascular endothelia growth factor receptor C/D， VEGF-C和VEGF-D)。人类VEGF-C基因位于染色体4q34， 其全长的cDNA序列是从前列腺癌细胞系PC-3细胞cDNA文库内筛选克隆得到。VEGF-C 的cDNA的开放阅读框架编码一种含有419个氨基酸残基的蛋白，其分子量约46.9kD。 VEGF-C也具有刺激内皮细胞迁移、提高血管的通透性以及刺激内皮细胞增殖的能力， 但是相对于VEGF, VEGF-C需要更高的浓度才能发挥这些作用。在胚胎期的小鼠体内可以观察到VEGF-C出现在新生淋巴管出芽的位置，提示VEGF-C参与了淋巴管的形成；不 仅如此许多研究表明VEGF-C在淋巴管形成前就己存在了，并且在血管的形成中也发挥 着重要作用。此外在活化的巨噬细胞上也可以检测到VEGF-C的表达。VEGF-D (也被称为c-fos诱导的生长因子或FIGF)是最新发现的VEGF家族的成 员。VEGF-D基因定位在染色体21Xp22.31上，其基因序列与VEGF-C、 VEGF165、 VEGF167以及PIGF分别有48%、 31°/。、 28%和32%的同源性。人VEGF-D的cDNA序 列含有419bp，其开放阅读框架编码含有354个氨基酸的蛋白。VEGF-D与VEGF-C有 61%的同源性，并且同VEGF-C—样，VEGF-D在人体内既可以和VEGFR-2结合也可以 和VEGFR-3结合。在研究中发现VEGF-D也具有刺激内皮细胞增殖的能力、刺激血管 新生和淋巴管新生的能力。但是目前关于生理条件下VEGF-D的表达还未得到很好的阐 明，仅发现其mRNA存在于发育中的成纤维细胞和黑色素细胞，肺的间质及成年人的血 :管壁。2. 2 VEGFR-3与肿瘤随着研究的深入，发现VEGFR-3在许多肿瘤中也是高表达的，如Kaposi's肉瘤、 血管皮肤肿瘤、乳腺癌、鼠肝癌和转移性腺癌、鼻咽癌、结肠癌和卵巢癌等。在肿瘤中 高表达的VEGFR-3对肿瘤的生长有何意义呢？这是一个引起了许多研究者浓厚兴趣的 问题，大部分的实验一致认为VEGFR-3促进了肿瘤的生长和转移。Yonemum等用RT-PCR和免疫组化的方法对85例胃癌患者体内VEGF-C和 VEGFR-3的表达进行了研究，结果发现VEGF-C和VEGFR-3的表达和淋巴结状况、淋 巴的浸润、静脉的侵袭、肿瘤浸润之间存在强烈的正相关性。这些结果显示癌细胞产生 的VEGF-C通过和VEGFR-3的相互作用诱导了淋巴管的增殖和扩张，导致了癌细胞入 侵淋巴管并发生淋巴结的转移。Huang等利用原位杂交的方法对29例淋巴管瘤患者肿瘤 组织中VEGF和VEGFRmRNA的表达进行了检测，研究结果表明VEGF-C和它的受体 VEGFR-3， VEGFR-2在淋巴管瘤邻近相连组织中发现。相反，在血管瘤、血管肉瘤或小 肠/大肠的正常淋巴管的内皮细胞中，很少或没有VEGF-C， VEGFR-3和VEGFR-2 mRNA 的表达。这些结果提示，VEGF-C和其受体可以经自分泌或旁分泌的调控在淋巴管瘤的 形成中发挥作用。在动物模型中对VEGFR-3及其介导的信号转导和肿瘤生成以及转移的关系进行了 更为深入研究。目前，研究方法主要有两种，其一是将VEGFR-3的配体VEGF-C或VEGF-D转染肿瘤细胞，然后观察肿瘤细胞形成的实体瘤组织中和肿瘤邻近组织中的淋巴管的形 成情况，并评价肿瘤细胞是否侵入了淋巴结。例如，Skobe等人将VEGF-C转染乳腺癌细 胞，然后将该细胞种入小鼠体内进行研究，他们观察到肿瘤组织内的淋巴管密度增加了， 同时肿瘤细胞向淋巴结和肺部的转移率也提高了。在其它类似的动物模型中，不仅同样 观察到了肿瘤中新生淋巴管的密度增加，而且观察到了在这些新生的淋巴管中有肿瘤细 胞的浸润，并且这些浸润的肿瘤细胞通过新生淋巴管转移到了远处淋巴结。Mandriota等 建立了一种胰腺癌的转基因小鼠，肿瘤中高表达的VEGF-C导致了肿瘤的淋巴管新生和 远处转移。而若用抗VEGF-C/D的抗体阻断VEGFR-3和配体的结合则可以阻断肿瘤中淋 巴管的生成和肿瘤的淋巴结转移。另外一种用于评价VEGFR-3介导的信号转导通路与肿瘤转移关系的动物模型也已 经被很好的建立起来了。与第一种方法不同的是，在这种动物模型中不用那些转染了 VEGF-C/D的肿瘤细胞，而是直接选择那些具有高度转移能力的肿瘤细胞来构建荷瘤动 物模型，然后研究对VEGFR-3及其信号转导通路的阻断对肿瘤转移的影响。如人肺癌 细胞NCI-H460-LNM35是一种具有高度转移能力的肿瘤细胞，将表达可溶性VEGFR-3 的基因转染入该细胞中，结果发现该转染细胞的淋巴结浸润能力和远端转移能力远远低 于未转染的对照细胞。而且，即使对于未转染的NCI-H460-LNM35细胞构建的肿瘤动物 模型，如果给予表达VEGFR-3的腺病毒进行治疗的话，其转移能力也被有效的抑制了。 同样，Krishnan等将表达可溶性VEGFR-3的基因转染具有高度转移能力的乳腺癌细胞 MT-450细胞，然后构建荷瘤大鼠模型进行研究，其结果与He等的结果是一致的。最近， Lin等用RNA干扰技术抑制黑色素瘤细胞中VEGFR-3的配体之一 VEGF-C的表达，结 果发现这种RNA介导的基因沉默技术可以抑制肿瘤淋巴管的形成和肿瘤向肺部的转移。 Hajime等制备了一种大鼠抗小鼠VEGFR-3的特异性抗体AFL4，然后将大鼠C6胶 质瘤细胞种植于裸鼠皮下构建荷瘤小鼠模型，分别用大鼠抗小鼠VEGFR-2的特异性抗 体Avasl2、 AFL4和PBS对照给予治疗，研究结果发现与当Avasl2的剂量在600ng/只 时,肿瘤的体积为1027mn^,而同等剂量AFL4治疗的小鼠体内肿瘤的体积仅为296mm3， 甚至当AFL4的治疗剂量仅为200ng/只时，小鼠体内肿瘤的体积仅为488mm3，远远小 于Avasl2治疗组，这表明抗VEGFR-3的单克隆抗体具有更好的抑制肿瘤生长的能力。 在另外一种由人的前列腺癌细胞PC-3构建的荷瘤裸鼠模型中，抗VEGFR-3单克隆抗体 治疗的小鼠肿瘤生长完全被抑制。为了进一歩阐明AFL4抑制肿瘤生长的机理，Hajime还在实验中比较了对照组和AFL4治疗组小鼠体内肿瘤的血管密度以及血管内皮的形 态，研究发现AFL4治疗组中肿瘤的血管密度小于对照组，并且，相对于对照组，AFL4 治疗组中肿瘤新生血管的内皮细胞缺乏很好的连接，从而提示VEGFR-3可能参与了对 肿瘤新生血管完整性的维持，从而在肿瘤的生长中发挥着重要的作用，而AFL4正是通 过破坏这种作用而实现了对肿瘤生长的抑制。Bronislaw等的实验也得到了相似的结果， 而且他们还在实验中发现抗VEGFR-3的单克隆抗体并不影响正常的血管和淋巴管。以上实验强烈提示VEGFR-3及其配体在肿瘤的生长和转移中发挥了重要的作用， 阻断VEGFR-3和其配体的结合有可能是肿瘤治疗新的有效策略。目前已有许多公司正 在这方面进行积极的尝试，如Pytowski等制备了抗人VEGFR-3的抗体并观察到该抗体 具有阻断成人淋巴管再生的功能。除了抗体之外，针对VEGFR-3信号转导通路设计的 小分子激酶抑制剂的研究也在进行之中，比如BAY43-卯06 ， CEP-7055 ， PTK787/ZK222584等正在进行临床实验，这些药物的成功研制有望为肿瘤的治疗带来新 的希望。发明内容本发明的目的在于，利用已商品化的VEGFR-3为靶分子从噬菌体呈现环7肽库中筛 选出与VEGFR-3结合的肽，化学合成该肽，通过体内体外试验对肽的性质进行研究。从 而为以VEGFR-3为靶点的抗肿瘤导向性药物的开发和设计提供新的策略。为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是人血管内皮细胞生长因子受体3结合肽，以商品化的hVEGFR-3为靶分子，在噬菌 体呈现环7肽库中筛选得到与其高亲和力的三种环7肽，其特征在于，包括下列三种环 7肽之一，其氨基酸序列分别如下Cys Ser Asp His Trp His Tyr Trp Cys;Cys Ser Asp Tyr Asn His His Trp Cys;Cys Ser Asp Trp Gin His Pro Trp Cys<>上述的三种多肽与hVEGFR-3的天然配体VEGF-C和VEGF-D的蛋白序列及基因序 列无任何同源性，与hVEGFR-3具有特异的亲和性。实现上述多肽的筛选方法，其特征在于，按以下步骤完成 a)噬菌体呈现环7肽库的筛选以O.lmol/L的NaHC03， pH8.6， 100pg/mL配制的VEGFR-3和IgGlFc溶液包被 ELISA板孔置于湿盒中轻轻摇动，4。C孵育。过夜后，将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻扣除尽残余液体；然后用1。/。牛血清白蛋白的TBS， 50mMTris—HCl， pH7.5， 4。C孵 育，封闭2h,再采用0."/。Tween20的TBST洗涤6次，每次均要将96孔板倒扣在洁净的 纸巾上，轻扣除尽残余液体。将200 nl用TBST稀释的含2xlO"pfo噬菌体溶液加入IgGlFc 包被孔，室温孵育lh。轻轻吸出未与IgGlFc包被孔结合的噬菌体，加入到已封闭好的 VEGFR-3包被孔，室温孵育lh。倾去液体，去除未结合的噬菌体，再用TBS+0.1%Tween 20洗涤10次，每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻扣除尽残余液体；用10(HiL 洗脱液洗脱结合的噬菌体，其洗脱液配方为0.2mol/LGlycine-HCl， pH2.2, 10g/LBSA， 并迅速加入配方为lmol/LTris-HCI， pH9.1的中和液中和；取lpL测滴度，剩余液体加 入20 mL处于对数生长早期的ER2738培养物(大肠杆菌ER2738; 20mg/L四环素的5mL LB培养基胰蛋白胨10g/L酵母提取物5g/L NaCl 10g/L)中，于37'C剧烈振荡培 养4,5h，得到扩增的噬菌体；将扩增好的噬菌体和大肠杆菌的混合液倒入离心管，于4'C， 10000rpm离心10min; 上清转入新的离心管，再离心，取80%的离心上清转入新的离心管，加入l/6体积的 PEG8000/NaCl，其配方为PEG-8000200mg/mL， NaC12.5M， 4。C静置过夜；次日， 4°C， 10000rpm离心15min，倾去离心上清；再同法快速离心一 下，吸尽残留上清；1 mLTBS 重悬沉淀，于4°C 10000rpm离心5min，将残留的细胞沉淀下来；上清加入l/6体积的 PEG/NaCl，冰浴lh， 4°C， 10000rpm离心15min，倾去上清，用200 pL含0.01 %NaN3 的TBS重悬沉淀，10000rpm离心lmin;上清即为扩增好的洗脱液，lpL用于测滴度， 余下的液体于4。C存放；200nLVEGFR-3和IgGlFc溶液各新包被一孔，用于下一轮筛选，为了提高筛选肽 的严谨性，第二轮和第三轮筛选中，VEGFR-3的浓度分别降至50mg/L和20mg/L;重 复以上筛选步骤，第二轮和第三轮的筛选中，加入的第一轮和第二轮筛出的噬菌体应根 据滴度计算相当于2xl()UpfU噬菌体的液体体积；将TBST中Tween的浓度提高至0.5%; 第三轮的洗脱产物不需进行扩增，取lpL进行滴度测定，剩余存放于4。C;从滴度测定中，菌斑数〈100的平板上随机挑取60个分隔良好噬菌斑进行扩增和纯 化，既用无菌牙签蘸取的50个分隔良好的蓝色噬菌斑分别放入对数中期培养的ER2738 中，37'C剧烈振荡培养4.5h后，瞬间离心30s。新的离心管，同法再离心一次，取80% 的上清，即得扩增的噬菌体液体；b)特异性噬菌体筛选以100mg/L的NaHC03 (pH8.6)稀释的VEGFR-3包被96孔酶联板，同时对每个 孔设立1% BSA对照孔，同型的IgGl对照孔，4'C孵育过夜;倾去包被液,加入5mg/L BSA，0.1mol/LNaHCO3， pH8.6的封闭液，4'C封闭2h，以步骤l)中的TBST洗6次，每次 均要除尽残余液体；将60个纯化的lX10"孔噬菌体分别加入NaHCO3 (pH8.6)稀释的 VEGFR-3、 IgGlFc和BSA包被孔中室温孵育2h。 TBST洗6次，每孔加入HRP标记的 小鼠抗M13噬菌体mAblOOixL，其比例1:5000，室温孵育lh; TBST洗6次，邻苯二 胺显色并用2mol/L硫酸终止反应后测定A490nm处的吸光值； c)噬菌体呈现肽的序列测定根据ELISA结果，筛选出29个与VEGFR-3有较高亲和力而与其他对照亲和力低的 克隆进行序列测定；噬菌体克隆的扩增同前，取噬菌体培养上清；常规提取噬菌体单链 DNA，以单链DNA为模板，采用噬菌体随机肽库试剂盒中所提供的测序引物，引物序 列为5'—CCCTCATAGTTAGCGTAACG"3'，在ABI310 DNA自动测序仪上进行自动测 序，根据DNA测序结果，推导出噬菌体所呈现随机肽的氨基酸序列，比较不同克隆之 间氨基酸序列的同源性，即可得到筛选的三种多肽。选择其中表现最好的噬菌体及其呈现的肽(CSDSWHYWC)为代表进行进一步的研 究，研究表明本发明的肽可以在特异性的与VEGFR-3分子、VEGFR-3阳性的细胞结合， 并且动物试验表明该肽可以特异性的富集于VEGFR-3阳性的肿瘤组织中。本发明制备的肽可以特性的与VEGFR-3结合，将其他药物与该肽连接后，可以提 高药物在VEGFR-3药物在病灶组织中的汇集度，从而降低药物的用量，减轻其毒副作用， 提高药物的疗效。


图1是筛选出29个与VEGFR-3有较高亲和力而与其他对照(同型IgGl对照，BSA 对照)亲和力低的噬菌体克隆的ELISA结果黑色框为阳性噬菌体与VEGFR-3的结合结 果；灰色框为与同型IgGl的结合结果；白色框为与封闭液牛血清白蛋白BSA的结合结 果。图2是选择表现最好的噬菌体Phagel进行研究的结果。ELISA结果表明Phagel可 以特异性地与VEGFR-3结合，而不与VEGFR-2或VEGFR-1结合。黑色框代表Phagel与 不同受体的结合，白色框代表对照噬菌体与不同受体的结合。图3是Phagel在荷瘤小鼠体内的分布试验。实验结果显示归巢于肿瘤组织(VEGFR-3 高表达)中的Phagel是对照噬菌体的2. 38倍，这一比值高于归巢于其它组织的Phagel 与对照噬菌体的比值，说明Phagel在VEGFR-3高表达的肿瘤组织。图4是对表现最好的噬菌体Phagel呈现的多肽PI (CSDSWHYWC)化学合成后进 行研究的结果。ELISA结果表明PI可以特异性地与VEGFR-3结合，而不与VEGFR-2或VEGFR-1结合。黑色框代表P1与不同受体的结合，白色框代表对照多肽与不同受体的结合。图5是化学合成FTIC-P1与VEGFR-3高表达细胞的结合结果。实验表明FTIC-P1可 以特异性的与VEGFR-3高表达细胞HT29结合，并且结合与细胞的细胞膜上；而不与 VEGFR-3阴性的细胞结合。A-C，对照多肽P5不与对照细胞EVC304反应；D-F，阳性 多肽Pl不与对照细胞EVC304反应；G-I，对照多肽P5不与阳性细胞HT29细胞反应； J-K，阳性多肽P1特异性识别阳性细胞HT29细胞。左列，单独FTIC荧光成像，中列， 单独PI成像，右列，二者重叠。图6是FTIC-P1在荷瘤小鼠体内的分布试验图片。实验结果显示与对照多肽相比 FTIC-Pl可以特异性的汇聚于肿瘤组织(VEGFR-3高表达)中，而在其他组织中，FTIC-P1 与对照多肽的分布行为没有明显差别。左列，单独FTIC荧光成像，中列，单独PI成像， 右歹!j， 二者merge 0以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。
具体实施方式
依照本发明的技术方案制备的人VEGFR-3结合肽，应用亲和筛选的方法利用 VEGFR-3为耙分子，在噬菌体随机呈现环7肽库(BioLabs , New England)中筛选得 到高亲和力的7肽Cys Ser Asp His Trp His Tyr Trp Cys (半胱氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-色氨酸-组氨酸-酪氨酸-色氨酸-半胱氨酸)。实现本发明的肽库筛选和检定工作，按以下步骤完成 3. 1.噬菌体随机呈现环7肽库的筛选噬菌体随机环7肽库(Ph. D. —7 Phage display p印tide library):购自美国New England Biolabs公司，其滴度为1. 5X 1013噬斑形成单位(pfu) /mL;多样性2.7X109 transformants。宿主菌为大肠杆菌E. coli ER2738,携带有可被噬菌体感染的F'因子， 具有四环素抗性，可与呈现了 12肽的噬菌体形成a互补。测序引物(-96glIIsequencirig primer)序歹U为ccctcatagttagcgtaacg。 3. 1. l噬菌体滴度的测定(1) E,coliER2738的培养以无菌操作技术从ER2738大肠杆菌的甘油冻存物中 挑取一接种环，接种于四环素抗性的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L， 琼脂15g/L， NaCl: 10g/L)上，37'C培养24h,待平板上可见白色透亮的菌落形成后， 将基本培养平板置于4°C保存。(2) 平板上挑取E. coli ER2738单菌落接种于含20mg/L四环素的5mL LB (胰蛋白 胨10 g/L酵母提取物5 g/L NaCllO g/L)培养液中，37'C振荡培养至对数生长中期(0D600 约为0.5)。(3) 将噬菌体用LB进行10倍连续梯度稀释。对于扩增后的噬菌体培养上清，稀 释108-10"倍；对于未扩增的筛选洗脱液，稀释10'-104倍。(4) 每份稀释的噬菌体样品各取1(^1，分别加入步骤(2)培养好的细菌中(20(^1)， 快速混匀，室温孵育lmin 5min。(5) 各感染的细菌分别移入45'C预温、含有顶层琼脂3—5ml (胰蛋白胨10g/L， 酵母提取物5 g/L， NaCllO g/L， MgCl2 6H201 g/L,琼脂糖7 g/L)的培养管中，加 入40 pi 20 mg/mL的X-gal和16 pi 50mg/mL的IPTG,充分混匀，然后迅速倒入预温 的LB平板，倾斜使顶层琼脂均匀分布。(6) 将平板放置5min，使温度降低，然后反转平板，37'C孵育过夜。 观察平板，计数蓝色噬斑并乘以该平板中噬菌体样品的稀释倍数，得到每10nl噬菌体的滴度，以蓝色噬斑形成单位表示(plaque forming units, pfu)。 3. 1. 2.生物淘洗(1) 在96孔板中加入200|li1用O.lmol/1的NaHC03(pH8.6)稀释的VEGFR-3和 IgGlFc溶液(100ng/ml)。置于湿盒中轻轻摇动，4'C孵育过夜。(2) 预先接种ER2738于10 ml (测滴度用)和含四环素的20 ml (扩增噬菌体用) 的LB中，37。C培养。(3) 将2.1中的96孔板取出，倾去液体，将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻扣 除尽残余液体。(4) 加入200|xl封闭液(含1%BSA的TBS)， 4°C孵育2h。(5) TBST (TBS+0.1%Tween)洗涤6次，每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸 巾上，轻扣除尽残余液体。(6) 将200 nl用TBST稀释的含2xl()Upfix噬菌体溶液加入IgGlFc才包被孔，室 温孵育lh。(7) 轻轻吸出未与IgGlFc包被孔结合的噬菌体，加入到已封闭好的VEGFR-3 包被孔，室温孵育lh。(8) 倾去液体去除未结合的噬菌体，TBST洗涤10次，每次均要将96孔板倒扣 在洁净的纸巾上，轻扣除尽残余液体。(9)用100^1洗脱液(0.2mol/LGlycine-HCl， pH2.2， 10g/LBSA)洗脱结合的 噬菌体，并迅速加入中和液(lmol/lTris-HClpH9.1)中和；取liul测滴度，剩余液体加 入20ml处于对数生长早期的R2738培养物中，于37'C剧烈振荡培养4.5h，进行扩增。(10) 将扩增好的噬菌体和大肠杆菌的混合液倒入离心管，于4'C， lOOOOrpm离 心lOmin。将离心上清转入新的离心管，同法再离心一次，取80%的离心上清入新的离 心管。(11) 在离心管中加入1/6体积的PEG8000/NaCl，于4。C静置过夜。(12) 次日取出PEG8000/NaCl沉淀好的液体，于4。C， 10000rpm离心15min，小 心的倾去离心上清；再同法快速离心一下，用微量移液器吸尽残留上清。(13) 用lml TBS重悬离心沉淀，将重悬液转入小离心管中，于4'C10000rpm离 心5min以将残留的细胞沉淀下来。(14) 将离心上清移入新的小离心管中，加入l/6体积的PEG/NaCl冰浴lh。 4'C， 10000rpm离心15min，小心的倾去离心上清；再同法快速离心一下，用微量移液器吸尽 残留上清。(15) 用200nl含0.01。/。NaN3的TBS重悬沉淀，10000rpm离心lmin以沉淀 那些不能溶解的物质。将上清移入新的离心管，即为扩增好的洗脱液，lpl用于测滴度， 余下的液体于4'C存放。(16) 用200pl目的蛋白溶液新包被96孔板一孔，用于下一轮筛选，为了提高筛 选肽的严谨性，第二轮和第三轮筛选中，目的蛋白的浓度分别降至50mg/l和20mgA。(17) 观察步骤2.15中测滴度的结果，计数蓝斑的数量以确定噬菌体的滴度。根 据该滴度计算相当于2xl0Upfii噬菌体的液体体积。(18) 进行第二轮筛选，重复步骤2.16，并将TBST中Tween的浓度提高至0.5%。(19) 用200pl VEGFR-3和IgGl Fc溶液新包被96孔板一孔，用于第三轮筛选。 重复步骤2.9， TBST中Tween20的浓度为0.5%,第三轮的洗脱产物不需进行扩增，取 lpl进行滴度测定，剩余存放于4。C。从滴度测定中，菌斑数小于IOO的平板上随机挑 取50个分隔良好噬菌斑按下列方法进行扩增和纯化，此时应注意挑取的噬菌斑培养的 时间不能超过18h。经过三轮筛选，特异性噬菌体进一步被富集，得到的噬菌体滴度逐步升高。第一轮The average: 1.0x106 pfu第二轮The average: l.lxio8 pfu第三轮The average:6.0x108 pfu3. 1. 3.噬菌体特异性筛选(噬菌体ELISA)在这挑选出的50个克隆中利用噬菌体ELISA进一步挑选与VEGFR-3高亲和力的克隆。(1) 以lOOmg/L VEGFR-3 (Na线PH8.6)包被96孔酶联板，每孔200叱，同时 对每个VEGFR-3孔设立1% BSA的包被孔对照，并对每个孔再包被一个同型的IgGl为阴 性对照，4t孵育过夜。(2) 倾去包被液，加入封闭液(5mg/L BSA， 0. lmol/L NaHC03， pH 8.6)， 4。C封 闭2h。(3) 倾去封闭液，TBST洗6次，每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻扣除 尽残余液体。(4) 将50个纯化的噬菌体(1X107孔)分别加入Rituximab， BSA和IgGl包被孔 中室温孵育2h。(5) TBST洗6次，每孔加入服P标记的小鼠抗M13噬菌体raAb (1:5000) 100uL， 室温孵育lh.(6) TBST洗6次，OPD (邻苯二胺)显色并用2mol/L硫酸终止反应后测定A4卯nm 处的吸光值显色后测定A410nm处的吸光值。3. 1. 4.噬菌体呈现肽的序列测定根据50个克隆的ELISA结果，筛选出29个与VEGFR-3有较高亲和力而与其他对照 亲和力低的克隆(结果见图1)进行序列测定。(1) 噬菌体单链DNA的提取噬菌体克隆的扩增同前，取噬菌体培养上清。用华舜公司生产的单链DNA提取试剂 盒进行噬菌体单链DNA的提取，按操作说明书进行操作在含有单个噬菌体克隆的LB 培养液中加入沉淀液,高速离心后得到噬菌体颗粒沉淀，加入裂解液裂解噬菌体外壳蛋 白，经过树脂纯化，洗脱得到噬菌体单链DNA，紫外定量其浓度大于100ng/uL。(2) Sanger双脱氧链终止法测定DNA序列以单链DNA为模板，采用噬菌体随机肽库试剂盒中所提供的测序引物，引物序列为 5'—CCCTCATAGTTAGCGTAACG—3'，在ABI 310 DNA自动测序仪上进行自动测序。(3) 呈现随机肽氨基酸序列的推导及氨基酸同源性分析根据DNA测序结果，推导出噬菌体所呈现随机肽的氨基酸序列，得出三种序列(P1， P2， P3)如下。比较不同克隆之间氨基酸序列的同源性。Pl:Cys Ser Asp His Trp His Tyr Trp Cys;P2'. Cys Ser Asp Tyr Asn His His Trp Cys;P3: Cys Ser Asp Trp Gin His Pro Trp Cys。 3. 2.噬菌体Phagel的鉴定 3. 2. 1. Phagel与VEGFR-3的特异性结合(1) 以VEGFR-1 、 VEGFR-2和VEGFR-3分别包被ELISA孔(100ug/孔)，封闭、 洗涤的过程同上。(2) 将纯化的噬菌体Phagel (噬菌体Phagel为ELISA中表现最好的阳性噬菌体， 下同)和对照噬菌体(第一轮淘洗中未结合的噬菌体，下同)，分别加入VEGFR-l、 VEGFR-2和VEGFR-3包被孔中，100^1/孔(其滴度为1.9x108pfii/l00^1)，室温孵育2h。(3) 洗涤过程同上，每孔加入HRP标记的小鼠抗M13噬菌体单克隆抗体(1:5000) IOOW，室温孵育lh。(4) TBST洗6次，OPD显色后测定A490nm处的吸光值(结果见图2)。 3. 2. 2. Phagel在荷瘤小鼠体内的分布试验(1) 构建荷瘤裸鼠模型在裸鼠右腹股沟皮下接种5xl()S个/只的HT-29细胞，两 周后观察，肿瘤成长约lxO.lcm，可用于实验。(2) 将含10"pfo噬菌体Phagel及无关噬菌体的10(^1 TBS，尾静脉注入小鼠体内。(3) 噬菌体在小鼠体内循环2-5min后，戊巴比妥钠150mg/kg腹腔注射麻醉。然 后横隔水平切开皮肤，暴露全部胸壁，剪断胸骨，注意避免损伤心脏和大血管。(4) 充分暴露心脏后，通过左心室用静脉针穿刺入主动脉，针管内有回吸的血液 后缓慢推入已预温37°C的50 ml生理盐水，同时在右心耳处剪开一小口，可见血液流出， 直至流出的血液变成淡红色为止。(5) 取出鼠皮下的瘤块及对照组织，称重，加入存放于4"C的1 mlPBS-PMSF， 用组织匀浆器小心研磨。(6) 把匀浆移入50ml离心管，加入5 ml在0。C预冷的PBS-PMSF (含1XBSA)洗 3次涡旋10s以充分混合组织和洗涤液，3000-4000 rpm离心4-5 min,小心吸出上清，注意每次加洗涤液前要振荡，以充分洗涤匀浆沉淀。操作时使样品保存于冰块上。(7) 把组织和宿主菌(OD6oo约为0.5) 1 ml混合，室温下静止60 min， LB培养 液预温至37'C。(8) 加入预温的LB培养液10ml，室温孵育30min。(9) 分别取2 pl， 20 pl， 200 nl组织/宿主菌LB混合物加至45'C的3 ml顶层琼 脂中，充分混匀后将其铺于含IPTG/X-Gal的LB平板上。余混合物200 )nl/份铺于LB平 板上。待顶层琼脂凝固后将LB平板置于37'C孵箱中培养12h。 12h后平板上长出蓝色 噬斑，对蓝色噬斑进行计数，然后推算噬菌体的数量(结果见图3)。3. 3.化学合成多肽的鉴定3. 3. l合成Phagel呈现的多肽Pl及对照多肽P5并进行FITC标记采用固相合成法合成Phagel呈现的多肽Pl及对照多肽P5，并进行FITC标记，合 成工作和标记均由西安华辰生物科技公司完成，纯度为98%以上。 3. 3. 2 Pl与VEGFR-3分子的特异性结合(1) 以2mg/lPl或P5包被96孔酶联板，每孔100nl， 4。C孵育过夜。(2) 倾去包被液，于每孔中加入封闭液(5mg/lBSA， 0.1mol/l NaHC03， pH8.6)， 4'C封闭2h。(3) 倾去封闭液，TBST洗6次。每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻扣 除尽残余液体。(4 )将VEGFR-3 、 VEGFR-2和VEGFR-1蛋白分别加入对应的孔中 (100ng/,l/well),室温反应lh。(5) TBST洗6次，每孔加入小鼠抗人IgG抗体(1:1000)，室温反应lh。(6) TBST洗6次，每孔加入HRP标记的山羊抗小鼠抗体(1: 5000)，温孵育lh。(7) TBST洗6次，OPD显色后测A490nm处的吸光值(结果见图4)。 3. 3. 3 Pl与VEGFR-3阳性细胞HT29的特异性结合(1) 用胰酶和EDTA消化贴壁的VEGFR-3阴性的细胞EVC304和VEGFR-3阳性 的细胞HT29，镜下观察待细胞呈悬浮圆形时，完全培养基终止反应。(2) 将细胞悬液滴于洁净的载玻片上，孵箱(37°C, 5%C02)中培养4h，使之贴 壁。然后在盛放载玻片的培养皿中加入完全培养基，继续培养。(3) 镜下观察当细胞伸展了 50-70%时，取出细胞爬片，PBS洗涤2次。(4) 于冷的丙酮中固定10min，自然风干。(5) PBST洗涤3次，5%正常山羊血清封闭，室温30min。(6) 在相应样品上滴加PBS稀释的FITC-P1或FTIC-P5 (80ng/份)。室温避光孵育 30min。(7) PBST洗涤3次后用PI (20pg/ml)染色5min。(8) PBST洗涤3次，中性甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察并采集图像(结 果见图5)。3. 3. 4 Pl在荷瘤小鼠体内分部试验(1) 构建荷瘤裸鼠模型在裸鼠右腹股沟皮下接种2"06个/只的肿瘤细胞，两周 后观察，肿瘤成长约lxO.lcm,可用于实验。(2) 将含FITC-P1和FITC-P5分别尾静脉注入小鼠体内100|^1/只(lmg/ml)。(3) 待5min后，戊巴比妥钠150mg/kg腹腔注射麻醉。然后横隔水平切开皮肤， 暴露全部胸壁，剪断胸骨，注意避免损伤心脏和大血管。(4) 充分暴露心脏后，通过左心室用静脉针穿刺入主动脉，针管内有回吸的血液后 缓慢推入已预温37。C的20ml生理盐水，同时在右心耳处剪开一小口，可见血液流出， 直至流出的血液变成淡红色为止。(5) 换用50rnllOc/。甲醛灌注小鼠，取小鼠皮下的瘤块及对照组织，在10%甲醛溶 液中后固定4h。(6) 在25%蔗糖溶液中置换出各组织的水分。(7) OTC包埋后制备冰冻切片(lO)am)。(8) 用PI (20ng/ml)染色5min， PBS洗涤3次。(9) 中性甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察并采集图像(结果见图6)。 3. 4实验证实效果经实验证实本发明的效果如下1) 利用商品化的VEGFR-3为配体在噬菌体随机呈现环7肽库成功筛选了出了特异 性与VEGFR-3结合的多肽Cys Ser Asp His Trp His Tyr Trp Cys; Cys Ser Asp Tyr Asn His His Trp Cys; Cys Ser Asp Trp Gin His Pro Trp Cys (见图1)。经序列比对，与任何已知蛋 白分子不具有同源性。2) 选择表现最好的噬菌体Phagel进行研究。ELISA结果表明Phagel可以特异性地 与VEGFR-3结合，而不与VEGFR-2或VEGFR-1结合。黑色框代表Phagel与不同受体的结合，白色框代表对照噬菌体与不同受体的结合(见图2)。并且Phagel在荷瘤小鼠体 内的分布试验结果显示归巢于肿瘤组织(VEGFR-3高表达)中的Phagel是对照噬菌体的 2.38倍，这一比值高于归巢于其它组织的Phagel与对照噬菌体的比值，说明Phagel 在VEGFR-3高表达的肿瘤组织(见图3)。3)对Phagel呈现的多肽P1 (CSDSWHYWC)化学合成后进行研究，ELISA结果表 明PI可以特异性地与VEGFR-3结合，而不与VEGFR-2或VEGFR-1结合(见图4)。细胞 学是验结果表明PI可以特异性与VEGFR-3高表达细胞的结合结果(见图5)。进一步的 动物实验表明可以特异性的汇聚于肿瘤组织(VEGFR-3高表达)中(见图6)。综上所述，该多肽的得到能够应用于以VEGFR-3为靶点的导向性药物的设计和开发 中，从而为提高药物在VEGFR-3高表达组织的汇聚，提高药物的疗效，降低药物用量和 毒副作用奠定基础。人血管内皮细胞生长因子受体3结合肽的氨基酸序列 PI:Cys Ser Asp His Trp His Tyr Trp Cys; P2: Cys Ser Asp Tyr Asn His His Trp Cys; P3.. Cys Ser Asp Trp Gin His Pro Trp Cys。
权利要求
1.人血管内皮细胞生长因子受体3结合肽，其特征在于，包括下列三种环7肽之一，其氨基酸序列分别如下Cys Ser Asp His Trp His Tyr Trp Cys；Cys Ser Asp Tyr Asn His His Trp Cys；Cys Ser Asp Trp Gln His Pro Trp Cys。
2. 权利要求1所述的人血管内皮细胞生长因子受体3结合肽筛选方法，其特征在 于，按以下步骤完成1)噬菌体随机呈现环7肽库的筛选以200W用0.1mol/l的NaHC03稀释的VEGFR-3和IgGlFc溶液包被ELISA板孔， 过夜后，将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻扣除尽残余液体；然后用1%牛血清白蛋白 的TBS， 50mMTris—HCl， pH7.5， 4'C孵育，封闭2h,再采用0.1%Tween20的TBST 洗涤6次，每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻扣除尽残余液体；将200 ^用TBST稀释的含2xl0"pfu噬菌体溶液加入IgGlFc才包被孔，室温孵 育；轻轻吸出未与IgGlFe包被孔结合的噬菌体，加入到已封闭好的VEGFR-3包被孔， 室温孵育lh;倾去液体，去除未结合的噬菌体，再用TBS40.1。/。Tween20洗漆10次，每 次均要将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻扣除尽残余液体；用100nL洗脱液洗脱结合 的噬菌体，其洗脱液配方为0.2mol/LGlycine-HCl， pH2.2， 10g/LBSA,并迅速加入配 方为lmol/LTris-HCl， pH9.1的中和液中和；取lpL测滴度，剩余液体加入20mL处于 对数生长早期的R2738培养物中，于37°C剧烈振荡培养4.5h,得到扩增的噬菌体，所 述的R2738培养物为大肠杆菌ER2738; 20mg/L四环素的5mL LB培养基胰蛋白胨 10 g/L酵母提取物5 g/L NaCllO g/L;将扩增好的噬菌体和大肠杆菌的混合液倒入离心管，于4'C， 10000rpm离心10min; 上清转入新的离心管，再离心，取80%的离心上清转入新的离心管，加入l/6体积的 PEG8000/NaCl，其配方为PEG-8000200mg/mL， NaC12.5M， 4。C静置过夜；次日，4 'C10000rpm离心15min，倾去离心上清；再同法快速离心一下，吸尽残留上清；1 mLTBS 重悬沉淀，于4'C10000rpm离心5min，将残留的细胞沉淀下来；上清加入1/6体积的 PEG/NaCl，冰浴1 h, 4°C, 10000rpm离心15min，倾去上清，用200 pL含0.01%NaN3 的TBS重悬沉淀，10000rpm离心lmin;上清即为扩增好的洗脱液，lpL用于测滴度， 余下的液体于4'C存放；200pl用0.1mol/l的NaHC03稀释的VEGFR-3和IgGlFc分别包被新孔，用于下一 轮筛选，在第二轮和第三轮筛选中，VEGFR-3浓度分别降至50mg/L和20mg/L;重复 以上筛选步骤，第二轮和第三轮的筛选中，加入的第一轮和第二轮筛出的噬菌体根据滴 度计算相当于2xl0"pfii噬菌体的液体体积；将TBST中Tween20的浓度提高至0.5%; 第三轮的洗脱产物不需进行扩增，取lpL进行滴度测定，剩余存放于4'C;从滴度测定中，菌斑数〈100的平板上随机挑取50个分隔良好噬菌斑进行扩增和纯 化，既用无菌牙签蘸取的50个分隔良好的蓝色噬菌斑分别放入对数中期培养的ER2738 中，37'C剧烈振荡培养4.5h后，瞬间离心30s。新的离心管，同法再离心一次，取80% 的上清，即得扩增的噬菌体液体；2)特异性噬菌体筛选以100mg/L的NaHC03(pH8.6)稀释的VEGFR-3包被96孔酶联板，同时对每个孔设 立1。/。BSA对照孔，同型的IgGl对照孔，4X:孵育过夜；倾去包被液，加入5mg/LBSA， 0.1mol/LNaHCO3， pH8.6的封闭液，4'C封闭2h，以步骤l)中的TBST洗6次，每次 均要除尽残余液体；将50个纯化的1 X 109/孔噬菌体分别加入NaHC03 pH8.6中，BSA 和同型抗体IgGl包被孔中室温孵育2h; TBST洗6次，每孔加入HRP标记的小鼠抗 M13噬菌体mAbl00uL，其比例1:5000,室温孵育lh; TBST洗6次，邻苯二胺显色并 用2mol/L硫酸终止反应后测定A490nm处的吸光值显色后测定A410nm处的吸光值； 3)噬菌体呈现肽的序列测定根据ELISA结果，筛选出29个与VEGFR-3有较高亲和力而与其他对照亲和力低的 克隆进行序列测定；噬菌体克隆的扩增同前，取噬菌体培养上清；常规提取噬菌体单链 DNA，以单链DNA为模板，采用噬菌体随机肽库试剂盒中所提供的测序引物，引物序 列为5'~CCCTCATAGTTAGCGTAACG~3'，在ABI310 DNA自动测序仪上进行自动测 序，根据DNA测序结果，推导出噬菌体所呈现随机肽的氨基酸序列，比较不同克隆之 间氨基酸序列的同源性，即可得到筛选的三种模拟表位，其氨基酸序列分别为Cys Ser Asp His Trp His Tyr Trp Cys;Cys Ser Asp Tyr Asn His His Trp Cys;Cys Ser Asp Trp Gin His Pro Trp Cys。
全文摘要
本发明公开了一种人血管内皮细胞生长因子受体3结合肽及其筛选方法，包括下列三种环7肽之一，其氨基酸序列分别如下Cys Ser Asp His Trp His Tyr Trp Cys；Cys Ser Asp Tyr Asn His His Trp Cys；Cys Ser AspTrp Gln His Pro Trp Cys。上述环7肽能够特异性的与VEGFR-3分子以及VEGFR-3阳性的细胞结合，并且在荷瘤小鼠体内可以特异性的汇聚于VEGFR-3阳性的肿瘤组织中。
文档编号C07K7/64GK101225108SQ20071030774
公开日2008年7月23日 申请日期2007年12月21日 优先权日2007年12月21日
发明者包春杰, 张英起, 萌 李, 鑫 秦, 薛晓畅, 苇 韩 申请人:中国人民解放军第四军医大学