专利名称：：中和血管内皮生长因子受体的人单克隆抗体及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及中和血管内皮生长因子受体的人单克隆抗体及其用途，尤其涉及中和血管内皮生长因子受体的人ScFv分子、以及含有该人ScFv分子的抑制血管生成的组合物和治疗癌症的组合物。
背景技术：
：血管生成是指通过内皮细胞的生长、分化和移动由先存在的血管形成新血管，这不发生在健康成人中，除非因为某些特殊的原因，包括伤口愈合，月经等。然而，已经报道了在疾病(如肿瘤生长和转移、老年性黄斑退化、风湿性关节炎、糖尿病视网膜病变、银屑病和慢性炎症)中过度形成新血管(CamelietandJain,Nature，407249，2000)。因此，在采用血管生成抑制剂治疗疾病尤其是肿瘤上进行了许多努力。参与血管生长的因子包括血管内皮生长因子(VEGF)、上皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子-b(TGFb)、成纤维细胞生长因子(FGF)等。其中，血管内皮生长因子是直接参与内皮细胞生长、分化和移动的内皮细胞特异性因子，存在四种不同亚型(VEGF165、VEGF121、VEGF189和VEGF206)。四种亚型之中，VEGF165是除了胎盘外所有人组织中最丰富的亚型(Tisheretal.，J.Biol.Chem.，266=11947,1991)血管内皮生长因子(VEGF)调控由内皮前体(成血管细胞)原位分化而引起的新血管形成，VEGF在伤口愈合期间在胚胎组织(Breieretal.，Development(Camb),114521，1992)、巨噬细胞以及增生的上皮角蛋白细胞中表达(Brownetal.，J.Exp.Med.，1761375，1992)，并且VEGF可能是形成炎症相关的组织水肿的原因(Ferraraetal.,Endocr.Rev.,13:18，1992)。原位杂交研究已证实，包括多形性成胶质细胞瘤、成血管细胞瘤、中枢神经系统肿瘤和AIDS相关的卡波希肉瘤在内的大量人肿瘤系中存在VEGF的高表达(Plateetal.,Nature,359845,1992；Plateetal.,CancerRes.,53:5822,1993；Berkmanetal.,J.Clin.Invest.,91:153,1993；Nakamuraetal.，AIDSWeekly，13(1)，1992)。在缺氧诱导的血管生成中也观察到高水平的VEGF(Shweikietal.，Nature,359:843，192)。VEGF的生物功能是通过高亲和力的VEGF受体介导的，所述VEGF受体在胚胎形成(Millaueretal.,Cell,72=835,1993)和肿瘤形成期间在内皮细胞中进行选择性表达。VEGF受体(VEGFR)通常是III级受体型酪氨酸激酶，其特征在于在受体的氨基末端细胞外配体结合域具有几个(通常是5或7个)免疫球蛋白样环(Kaipainenetal.,J.Exp.Med.，178:2027，1993)。其他两个区域包括一个跨膜区和一个通过插入可变长度的亲水性内激酶序列而阻断的羧基末端细胞内催化域，该羧基末端细胞内催化域称为激酶插入域(Termanetal.，Oncogene,6:1677，1991)。VEGF受体包括fms-样酪氨酸激酶受体(Flt-1),或VEGFR-1(Shibuyaetal.,Oncogene,5519,1990；W092/14248；Termanetal.，Oncogene，6:1677，1991)，含激酶插入域的受体/胎儿肝激酶(KDR/Flk-1)，或VEGFR-2(Matthewsetal.，PNAS,889026,1991)，尽管其他受体如神经纤毛蛋白(neuropilin)-l和神经纤毛蛋白_2也可结合VEGF。其他酪氨酸激酶受体VEGFR-3(Flt_4)结合VEGF同系物VEGF-C和VEGF-D，且在淋巴管的生长中是很重要的。渗入神经胶质瘤的内皮细胞表达高水平的Flk-1(Plateetal.,Nature,359845，1992)。由人成胶质细胞瘤产生的VEGF特异性地正调节Flk-1水平(Plateetal.,CancerRes.，53:5822，1993)。与内皮细胞相关的成胶质细胞瘤(GAEC)中高水平的Flk-1表达表明了在肿瘤形成期间可能诱导受体活性，因为在正常脑内皮细胞中几乎检测不到Flk-1转录物。这种正调节限于最接近肿瘤的血管内皮细胞。在裸鼠中封闭VEGF活性和中和抗VEGF单克隆抗体(mAbs)可抑制人肿瘤异种移植物的生长(Kim,K.etal.，Nature,362:841_844，1993)，这表明了VEGF在肿瘤相关的血管生成中的直接作用。尽管在肿瘤细胞中VEGF配体被正调节，并且其受体在肿瘤渗入血管内皮细胞中被正调节，但在与血管生成无关的正常细胞中VEGF配体和其受体的表达水平是很低的。因此，这种正常细胞会封闭VEGF和其受体之间的相互作用以抑制血管生成，从而抑制肿瘤生长。由渗入神经胶质瘤的内皮细胞表达高水平VEGFR-2，并由人成神经胶质瘤产生的VEGF对其进行特异性正调节(Plateetal.,Nature,359:845，1992；Plateetal.,CancerRes.,53=5822,1993)。在成神经胶质瘤相关的内皮细胞(GAEC)中VEGR-2的高水平表达表明了在肿瘤形成期间诱导了受体活性，因为在正常脑内皮细胞中几乎检测不到VEGFR-2转录物。因此，正积极地开展研究，关注于抑制在肿瘤生长位点表达的VEGF的活性，以抑制血管生成，从而抑制肿瘤生长。通常地，已经发展了抑制癌细胞膜上的VEGF受体以阻止VEGF进入细胞的方法。产生VEGFR抗体的细胞系实例包括产生大鼠抗小鼠VEGFR-2单克隆抗体的杂交瘤细胞系(DC101；ATCCHB11534)、产生小鼠抗小鼠VEGFR-2单克隆抗体mAb25的杂交瘤细胞系(M25,18A1；ATCCHB12152)、和产生小鼠抗小鼠VEGFR-2单克隆抗体mAb73的杂交瘤细胞系[(M73，24;ATCCHB12153)、KM1730(FERMBP-5697;W098/22616；WO99/59636)、KM1731(FERMBP-5718)、KM1732(FERMBP-5698)、KM1748(FERMBP-5699)、KM1750(FERMBP-5700)]。已持续研发了针对VEGF受体的人源化抗体。迄今为止，这些针对VEGF受体的人源化抗体在体外表现出与VEGF的高度竞争性，但存在一个问题即它们中和细胞中VEGF受体的能力下降了且抗体在小鼠或大鼠中未表现出交叉反应性，以致未能进行动物试验。因此，本发明人构建了非免疫完全人抗体文库，筛选了针对VEGF受体(KDR)的单链可变区片段(ScFv)抗体，并发现了抗体不仅在体外，而且在细胞内和体内也显示出优异的KDR中和效应，甚至在小鼠和大鼠中表现出交叉反应性，因此完成了本发明。
发明内容本发明的一个目的是提供完全的人单链可变区片段(singlechainvariablefragment,ScFv)抗体6A6_ScFv和6A6_IgG，其具有优异的在细胞和体内中和VEGF受体的能力。本发明的另一目的是提供完全的人单链可变区片段(ScFv)，其是6A6的轻链变体，该轻链变体相对于6A6-ScFv表现出更为优异的中和VEGF受体的能力。本发明的另一目的是提供抑制血管生成的组合物，其含有具有中和VEGF受体能力的完全人ScFv或IgG。本发明的另一目的是提供治疗癌症的组合物，其含有具有中和VEGF受体能力的完全人ScFv或IgG。为实现上述目的，在一方面，本发明提供了一种单链可变区片段(ScFv)分子，其含有由SEQIDN0S:1-19的任一氨基酸序列所表示的轻链可变区并具有中和血管内皮生长因子受体的功能。在本发明中，ScFv(单链可变区片段)分子和其构建体优选具有由SEQIDNO20的氨基酸序列所表示的重链可变区。在另一方面，本发明提供了编码所述ScFv(单链可变区片段)分子的DNA，含有所述DNA的载体，和转化有所述载体的重组细胞。在本发明中，所述细胞优选是细菌或动物细胞。在另一方面，本发明提供了抑制血管生成的组合物，其含有所述ScFv分子，并且本发明提供了治疗癌症的组合物，其含有所述ScFv分子。在另一方面，本发明提供了IgG，其含有由SEQIDN0S:1_19的任一氨基酸序列所表示的轻链可变区并具有中和血管内皮生长因子受体的功能。在本发明中，所述IgG优选具有由SEQIDNO20的氨基酸序列所表示的重链可变区。在另一方面，本发明提供了抑制血管生成的组合物，其含有所述IgG，并且本发明提供了治疗癌症的组合物，其含有所述IgG。将由以下具体描述和所附权利要求阐明本发明的其他特点和方面。图1显示了插入p⑶NA3-KDRD123tFcm载体的基因的氨基酸序列和功能。图2显示了本发明中用于表位定位(印Hopemapping)的KDR(ECD1_2)和KDR(ECD2-3)-Fc的示意图。图3显示了本发明中纯化的KDR(ECDl-3)-Fc的SDS-PAGE结果。图4显示了本发明中抗KDR噬菌体和抗KDR-SvFc的VEGF竞争试验结果。图5显示了本发明中6A6ScFv噬菌体的核酸序列、氨基酸序列和⑶R序列。图6显示了纯化的6A6ScFv的SDS-PAGE结果。图7显示了采用抗KDR-SvFc的VEGF竞争试验结果。图8显示了本发明中抗KDR-SvFc的表位定位结果。图9显示了含有非可变区和6A6IgG重链区的载体pIGHD_6A6Hvy的酶切图。图10显示了含有恒定区和IgG轻链区的载体pIgGLD_6A6Lgt的酶切图。图11显示了纯化的6A6IgG的SDS-PAGE结果。图12显示了采用抗KDR6A6IgG的VEGF竞争试验结果。图13显示了抗KDR6A6IgG和VEGF族的竞争试验结果。图14显示了本发明抗KDRIgG抗体与HUVEC细胞的结合亲和力的FACS分析结果。图15显示了在HUVEC细胞中本发明抗KDRIgG抗体与VEGF165的竞争的FACS分析结果。图16显示了在K562细胞系(ATCCCCL-243)中KDR表达的蛋白印迹分析结果。图17显示了本发明抗KDRIgG抗体与K562细胞系的结合亲和力。图18显示了在K562细胞系中本发明抗KDRIgG抗体与VEGF的竞争的FACS试验结果。图19显示了本发明抗KDR抗体与Gleevec抗性细胞系的结合亲和力的FACS分析结果。图20显示了本发明的抗KDRIgG抗体抑制细胞增殖的分析结果。图21显示了本发明抗KDR抗体对由VEGF诱导的KDR磷酸化和ERK磷酸化的抑制能力的蛋白印迹分析结果。图22显示了IgG型KDR抗体抑制VEGF移动内皮细胞的能力。图23显示了IgG型KDR抗体抑制由VEGF诱导的内皮细胞血管形成的能力。图24显示了通过IgG型KDR抗体和细胞表面KDR之间的结合抑制VEGF-KDR内化。图25显示了IgG型KDR抗体对由VEGF诱导的大鼠主动脉环化的抑制效应。图26显示了IgG型KDR抗体对由VEGF诱导的血管生成的抑制效应分析结果。图27显示了在结肠癌小鼠异种移植物模型中6A6抗体对HCT116细胞系中肿瘤生长的抑制效应分析结果。图28显示了在结肠癌小鼠异种移植物模型中以6A6抗体治疗后的肿瘤切片图像。图29显示了在肺癌小鼠异种移植物模型中6A6抗体对A549细胞系中肿瘤生长的抑制效应分析结果。图30显示了以碘放射性同位素对IgG型6A6抗体的标记结果。图31显示了在慢性髓性白血病小鼠肿瘤模型中以碘123标记的IgG型6A6抗体的彩图。图32是显示轻链改组(lightchainshuffling)制备的示意图。图33显示了通过轻链改组获得的抗KDR抗体的VEGF竞争试验结果。图34显示了通过轻链改组获得的抗KDR抗体的VEGF竞争试验结果。图35显示了通过轻链改组获得的抗KDR抗体的VEGF竞争试验结果。具体实施例方式在一方面，本发明涉及完全人ScFv(单链可变区片段)抗体A6A(TTAC-0001)-ScFv，其中和血管内皮生长因子。按以下方式筛选6A6_ScFv。首先，构建完全人抗体文库，并构建表达融合到Fc上的由KDR(VEGFR-2)胞外域1_3中的每个组成的融合蛋白的细胞系。采用纯化的重组KDRD1-D3-FC融合蛋白从细胞系中的完全人抗体文库中筛选中和KDR的抗KDR-ScFv抗体。以V5标签在细菌中表达并纯化经筛选的ScFv抗体，并在ScFv噬菌体颗粒状态中进行人KDRD1-D3-FC结合试验和VEGF竞争试验。此外，进行BIAcore分析以测量ScFv抗体亲和力，并获得具有恒定维持亲和力的6A6-ScFv且将其转化成IgG形式。而且，在本发明中通过蛋白印迹法确认了在初级培养的HUVEC细胞中6A6_ScFv抑制了血管生成信号因子ERK的磷酸化且这种抑制依赖于6A6-ScFv的浓度。在另一方面，本发明涉及中和血管内皮生长因子受体的完全人抗体6A6_IgG。FACS分析揭示了与商业可供的IMC-1C11IgG嵌合抗体(Imclone,USA)相比，6A6-IgG牢固地结合到由活体HUVEC细胞(ATCC，USA)在表面表达的内源人KDR上，甚至还在以竞争性结合人VEGF165处理细胞的时候，与商业可供的IMC-1C11IgG嵌合抗体相比，6A6-IgG能更有效地中和HUVEC细胞表面表达的KDR。这表明了ELISA中的VEGF竞争试验结果不同于在相似水平下6A6_IgG和IMC-1C11IgG嵌合抗体中和KDR获得的结果。即，体外试验结果和体内试验结果会互有区别，且根据体外试验结果筛选高度有效的抗体是有局限性的。此外，在本发明中，可以观察到与IMC-1C11IgG相比，6A6_IgG抗体更牢固地结合到由人急性粒细胞白血病细胞系K562(ATCC，USA)表达的KDR上。而且，在本发明中，通过蛋白印迹法确认了在初级培养的HUVEC细胞中6A6_IgG抑制了血管生成信号因子ERK的磷酸化且这种抑制以6A6-IgG浓度依赖方式而增强。此外，在本发明中，可以观察到本发明的6A6_IgG抑制了HUVEC细胞的趋化性向存在VEGF的环境的移动且6A6-IgG也抑制了HUVEC细胞的微管形成，其直接作用于血管生成。而且，在本发明中，为了确认6A6_IgG对HUVEC细胞VEGF的抑制效应是因为6A6-IgG阻断了VEGF受体进入HUVEC细胞，在采用以FITC标记的KDR抗体的试验中以共焦显微镜进行观察。结果观察到当以6A6-IgG处理细胞时VEGF受体(KDR)不能进入细胞中。此外，通过在体外大鼠主动脉环试验，发现了以6A6_IgG处理大鼠主动脉环，不会出现血管萌生。而且，通过将基质胶皮下注射到小鼠中的基质胶塞入试验分析了血管生成。结果在以VEGF处理的组中，在塞入物中观察到血管生成，但在以VEGF和6A6_IgG处理的组中，未观察到血管形成，这表明了6A6-IgG在体内具有血管生成抑制效应。在另一方面，本发明涉及通过轻链改组以突变6A6_ScFv轻链序列而获得的变体。通过轻链改组，获得了18个6A6_ScFv轻链变体，且轻链改组通过以下方式进行。(1)为了防止在生物淘筛期间6A6被再次选中，以在6A6的⑶R3上具有识别位点的限制性酶Spel处理6A6轻链改组文库中的DNA。在DNA被转染到ETB细胞中之后，构建亚文库，以ELISA进行KDR亲和力和VEGF竞争试验以选择具有优异KDR中和能力的克隆子。(2)在生物淘筛的洗涤步骤中，使抗体克隆子与可溶性KDR竞争以选择具有优异KDR中和能力的克隆子。(3)在生物淘筛的使噬菌体结合到抗原KDR上的步骤中，还加入IMC-1121BIgG(ImClone,USA)以选择KDR中和能力强于或类似于1121BIgG的克隆子。在另一方面，本发明涉及抑制血管生成的组合物和治疗癌症的组合物，其含有所述的ScFv或IgG。本文所用的术语“血管生成”包括肿瘤生长和转移、老年性黄斑退化、风湿性关节炎、糖尿病视网膜病变、银屑病和慢性炎症中涉及的血管形成，但本发明的范围不限于此。在本发明中，所述癌症包括但不限于结肠癌，胰腺癌，直肠癌，结直肠癌，前列腺癌，肾癌，黑色素瘤，转移至骨骼的前列腺癌，卵巢癌和血癌。本发明的组合物可通过任何适宜特定分子的途径给药。本发明组合物可通过任何适宜方式直接地(例如，局部地，如通过注射、皮下注射或局部给药至组织部位)或全身地(例如，胃肠外或口服)提供给包括人在内的动物。若通过胃肠外提供本发明组合物，例如通过静脉内、皮下、眼、腹膜内、肌肉内、口腔内、直肠、阴道、眼眶内、大脑内、颅内、脊柱内、心室内、腱鞘内、脑池内、囊内、鼻内给药或通过气溶胶给药，组合物优选含有部分水性或生理相容流体悬浮液或溶液。从而，载体或辅料是生理可接受的以便除将所需药剂递送给受试者之外，溶液不会另外负面影响受试者的电解质和/或容积平衡。用于药剂的水性介质可包括常规生理盐水。为了治疗，可将本发明的ScFv或IgG蛋白以足以预防、抑制或减缓肿瘤发展(例如肿瘤的生长、侵入、转移和/或复发)的量给药至癌症患者。足以实现该效果的量被定义为“药效治疗剂量”。能有效发挥该用途的量将取决于疾病的严重性和患者自身免疫系统的概况。本发明所述蛋白的剂量优选为0.01-100mg/kg，更优选为0.1-lOmg/m2。然而，最佳剂量将取决于要治疗的疾病和副作用的存在，其可通过常规实验进行测定。抗体的给药可通过周期的弹丸注射，或通过从外部源(例如从静脉内袋)或内部源(例如从生物可降解的植入物)持续静脉内或腹膜内给药。而且，本发明的抗体蛋白也可与许多不同生物活性分子一起给药至预期接受者。然而，可通过本领域技术人员熟知的常规实验确定融合蛋白和其他分子的最佳组合，给药模式，剂量。本发明所述的组合物可和其他与相关疾病有关的治疗剂组合使用。当以VEGF受体抗体与放疗、化疗、其他受体拮抗剂或其组合结合来治疗包括人肿瘤在内的肿瘤时，存在协同作用。换言之，在与化疗剂、放疗、或附加受体拮抗剂或其组合结合时通过VEGF受体拮抗剂抑制肿瘤生长可被增强至超过预期。例如相对于以VEGF受体拮抗剂和化疗剂、放疗或附加受体拮抗剂治疗所预期的累加效应，通过组合治疗能更强地抑制肿瘤生长，从而体现出协同作用。优选地，通过癌症的消除证实协同作用，其中该消除是不能由VEGF受体拮抗剂和化疗剂、放疗或附加受体拮抗剂的组合治疗所预期的。在开始化疗或放射治疗的之前、期间或之后给药VEGF受体拮抗剂以及它们的任意组合，即开始化疗和/或放射治疗的之前和期间，之前和之后，期间和之后，或之前、期间和之后。例如，当VEGF受体拮抗剂是抗体时，该抗体通常在开始放射治疗和/或化疗之前的1-30天之间，优选3-20天之间，更优选5-12天之间被给药。VEGF受体抗体在一个实施方式中，VEGF受体抗体特异性地结合到VEGF受体的胞外域的表位上。VEGF受体的胞外域是配体结合域。该配体结合域可在受体的任一端发现，但通常在氨基末端发现。VEGF受体的一些实例包括蛋白酪氨酸激酶受体，其在文献中被称为Flt-1(VEGFR-1)、KDR和Flk_l(VEGFR-2)。除非本文另外指出或另有明确说明，本说明书将遵循VEGF受体的常规文献命名法。KDR将被称为分子量MW为180kD的人形式VEGF受体(Termanetal.，Oncogene,6:1677，1991)。Flk-1(VEGFR-2)将被称为KDR的鼠同系物(Matthewsetal.，PNAS，88:9026，1991)。Flt-1(VEGFR-1)被称为与KDR/Flk-1受体不同但相关的一种形式的VEGF受体(Shibuyaetal.，Oncogene,5:519，1990)。其他VEGF受体包括可与标记VEGF交联的VEGF受体，或可与KDR共免疫沉淀的VEGF受体。这些VEGF受体的一些已知形式具有大约170kD、150kD、130_135kD、120_125kD和85kD的分子重量(Quinnetal.，PNAS,90:7533，1993；Scheretal.，J.Biol.Chem.，2715761,1996)。VEGF受体通常与细胞结合，例如内皮细胞。VEGF受体也可与非内皮细胞结合，例如肿瘤细胞。可选地，VEGF受体可游离于细胞，优选以可溶形式。本发明的拮抗剂中和VEGF受体。在本说明书中，中和(neutralizing)受体是指钝化受体固有的激酶活性以转导信号。VEGF受体中和的可信试验是受体磷酸化的抑制。本发明不受VEGF受体中和的任何特定机制限制。由一种拮抗剂引发的机制不一定与另一拮抗剂引发的相同。一些可能的机制包括防止VEGF配体与VEGF受体胞外结合域的结合，和防止受体的二聚化或低聚化。但不排除其他机制。在本发明的上下文中，VEGF受体(或VEGFR)抗体抑制受体VEGFR亚族的活化。抑制受体VEGFR亚族的活化是指VEGFR活化的任何下降。即，防止活化不需要完全终止VEGFR的活化。而且，在本发明中定义的VEGFR活化的抑制是指通过VEGFR抗体和VEGFR的相互作用抑制VEGFR。联合(association)是指VEGFR和能抑制受体酪氨酸激酶活性的VEGFR抗体之间的充分物理或化学作用。本领域技术人员会识别这种化学作用的实例，本领域已知的包括联合或结合，且包括共价结合、离子结合、氢键结合等。因此，本发明的VEGFR拮抗剂抑制受体的酪氨酸激酶活性，其防止受体的自磷酸化和参与VEGFR信号途径的多种其他蛋白的磷酸化。参与调控脉管形成和血管生成的这种途径包括以下任一者磷脂酶Cy(PLCy)途径、或磷脂酰3’激酶(PI3-K)/Akt和分裂素活化蛋白激酶(MAPK)途径(Larriveeetal.，Int.JMed.，5447,2000)。受体的VEGFR亚族的特征在于在胞外域中存在七个免疫球蛋白样环，单个跨膜域，以及在胞内区中的裂解酪氨酸激酶结构域(III级受体酪氨酸激酶)。存在几种已知的受体VEGFR亚族成员，其实例包括VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3。通常认为KDR(VEGFR_2)是引起内皮细胞增殖、移动、分化，引起脉管形成，增加血管渗透性，和保持血管完整性的主要VEGF信号转导蛋白。VEGFR-1拥有弱得多的激酶活性，且在受到VEGF刺激时不能发生有丝分裂反应，尽管其与VEGF的结合的亲和力比KDR(VEGFR-2)高大约10倍。VEGFR-1也参与VEGF和胎盘生长因子(P1GF)诱导的单核细胞和巨噬细胞移动以及组织因子的产生。如上述的VEGFR的情况，增加的VEGFR活化可能起因于更高水平的配体、VEGFR基因扩增、引起正调节受体信号的受体或突变体的转录增加。在本发明的一个实施方式中，VEGFR抗体抑制VEGFR与其配体的结合。配体与VEGH外部胞外域的结合刺激受体的二聚化、VEGFR的自磷酸化、受体内部细胞质酪氨酸激酶结构域的活化、和参与调控脉管形成和血管生成的多信号转导途径的启动。VEGFR的配体包括VEGF及其同系物P1GF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E。例如，P1GF是一种二聚化分泌因子且仅与VEGFR-1结合，其由绒毛细胞滋养层、合体细胞滋养层和绒毛外滋养层大量产生并且与VEGF具有密切的氨基酸同源性。在人类中存在三种亚型P1GF-1、P1GF_2和P1GF-3。对缺乏P1GF的小鼠的研究证实该生长因子本身不参与血管生成，而是在病理状态下特异性地调控VEGF的血管生成和通透性效应。此外，由于存在未在其他VEGF族成员中发现的N和C端延长，VEGF-D与VEGF-C密切相关。在成人组织中，VEGF-DmRNA在心、肺、骨骼肌、结肠和小肠中最丰富。分析VEGF-D受体特异性揭示了VEGF-D是VEGFR-2(Flkl)和VEGFR-3(Flt4)的配体并能活化这些受体；但是，VEGF-D不能结合到VEGFR-1。此外，VEGF-D是内皮细胞的促分裂剂。9在本发明的另一实施方式中，VEGFR抗体特异性地结合VEGFR。应该认识的是，VEGFR抗体可在外部结合到VEGFR的胞外部分，其可以或不可以抑制配体的结合，或进入酪氨酸激酶的结构域。优选地，本发明的VEGFR拮抗剂是VEGFR特异性的抗体或其功能等效物，在以下将更为详细地描述其细节。在一个优选实施方式中，VEGF受体抗体与KDR特异性结合。尤其优选的是抗原结合蛋白，该抗原结合蛋白结合到KDR胞外域并通过其配体VEGF和P1GF中的一个或两个阻断结合、和/或中和VEGF诱导或P1GF诱导的KDR活化。也存在多种产生VEGFR-2抗体的杂交瘤。例如，产生大鼠抗小鼠VEGFR-2单克隆抗体(DC101)的杂交瘤细胞系保藏为ATCCHB11534；产生小鼠抗小鼠VEGFR-2单克隆抗体mAb25的杂交瘤细胞系(M25.18A1)保藏为ATCCHB12152；产生小鼠抗小鼠VEGFR-2单克隆抗体mAb73的杂交瘤细胞系(M73.24)保藏为ATCCHB12153。此外，存在多种产生抗VEGFR-1抗体的杂交瘤，包括但不限于在W098/22616、W099/59636、AU5066698B2和CA2328893中公开的杂交瘤KM1730(保藏为FERMBP-5697)、KM1731(保藏为FERMBP-5718)，KM1732(保藏为FERMBP-5698)、KM1748(保藏为FERMBP-5699)、KM1750(保藏为FERMBP-5700)。本领域中已知多种其他VEGFR拮抗剂。VEGFR拮抗剂的一些实例如US5，185,438、5，621，090、5，283，354、5，270，458、5，367，057、5，548，065、5，747，651、5，912，133、6，677，434,6，960，446,5，840，301,5，861，499,6，365，157,5，955，311,6，365，157,6，811，779、以及W02001/66063所述。US5，861，301、Termanetal.，Oncogene，6:1677，199UW094/10202和WO95/21865公开了VEGFR拮抗剂，特别是抗VEGFR-2抗体。此外，抗VEGFR-2抗体如US.6，177，401和5，712，395所公开的。US5，981，569公开了为有机分子的VEGFR拮抗剂。此外，已知针对KDR(VEGFR-2)和VEGFR-1的双特异性抗体(BsAbs)，其具有两种不同抗原结合特异性或位点。而且，Hennequinetal.，J.Med.Chem.,42=5369,1999公开了特定的喹唑啉、喹啉和噌啉可作为有效的VEGF受体拮抗剂(Annieetal.,J.Acqu.ImmuneDefic.Syn.andHum.Retrovirol.,17:A41,1998)。而且，本领域已知检测VEGFR抗体的试验。本发明的VEGFR抗体抑制VEGFR的酪氨酸激酶活性，其通常涉及磷酸化作用。因此，磷酸化试验可用于检测本发明的VEGFR抗{本o^Paneketal.,J.Pharmacol.Exp.Thera.,2831433,1997andBatleyetal.,LifeSci.,62=143,1998中描述了一些酪氨酸激酶活性的试验。此外，可利用特异性检测VEGFR表达的方法。抗体可通过本领域已知的方法(Kohler和Milstein，Nature,256:495，1975；Campbell,MonoclonalAntibodyTechnology,TheProductionandCharacterizationofRodentandHumanHybridomas；Burdonetal.,Eds.,LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,Vol.13,ElsevierSciencePublishers,Amsterdam,1985；Huseetal.，Science，246:1275，1989)制备本发明的抗体。本发明的抗体可以是单克隆或多克隆抗体或任何其他适宜形式的抗体，例如抗体的片段或衍生物、单链可变区片段(ScFv)或抗体的合成同系物，条件是所述抗体具有与完整抗体相同的结合特性或具有与完整抗体相当的结合特征。除非文中另有指示或明确指出，本文所用的抗体结构域、区域和片段遵循本领域熟知的标准定义(Abbasetal.,CellularandMolecularlmmunology,ff.B.SaundersCompany,Philadelphia,PA,1991)。优选地,本发明的抗体是单克隆抗体。抗体片段可通过裂解完整抗体或通过表达编码片段的DNA而制备。抗体片段可通过公开文献中描述的方法制备(Lamoyietal.,J.Immunol.Methods,56=235,1983；Parham，J.Immunol.，131:2895，1983)。这种片段可包含Fab片段和F(ab')2片段中的一个或两个。这种片段也可包含单链可变区片段抗体(即ScFv)、双抗体或其他抗体片段。在W093/21319，EP239,400,W089/09622，EP338，745和EP332，424中公开了制备这些功能等效物的方法。单链可变区片段(scFv)是与轻链可变区(一种短肽连接物)连接的抗体重链可变区组成的多肽。从而，scFv包含整个抗体结合位点。可在细菌或在真核细胞中制备这些链。本发明的单链抗体的典型实例是6A6-ScFv(TTAC-0001)。6A6_ScFv表现为阻断VEGF-KDR(VEGF-VEGFR-2)相互作用并抑制VEGF刺激的受体磷酸化。这种6A6_ScFv可与HUVEC细胞和K562细胞中的可溶性KDR(VEGFR_2)和细胞表面表达的KDR(VEGFR_2)结合。6A6-ScFv具有SEQIDNO35的轻链序列和SEQIDNO36的重链序列。6A6_ScFv抗体是完全的人抗体并可由Fab',F(ab')2、二价ScFv、二价重组ScFv或人IgG抗体构成。优选地，尽管抗体片段含有整个抗体的所有六个互补决定区(⑶Rs)，但是包含比所有这些区域更少的如三，四或五个⑶Rs的片段也具有功能。如果抗体片段太短而不具备免疫原性，可将其与载体分子偶联。一些适宜的载体分子包括匙孔血蓝蛋白和牛血清白蛋白。可通过本领域已知的方法进行偶联。本发明的抗体也包括通过直接突变、亲和力成熟的方法、噬菌体展示或链改组而改善其结合特性的抗体。通过突变CDRs和筛选具有所需特性的抗原结合位点，可修饰或改善亲和力和特异性(Yangetal.，J.Mol.Biol.，254:392，1995)。以多种方式突变CDRs。一种方法是任意排布单个残基或残基组合以使在一组同一抗原结合位点中在特定位点发现所有二十种氨基酸。可选地，通过错配PCR方法在CDR残基范围内诱导突变(Hawkinsetal.,J.Mol.Biol.,226=889,1992)0含有重链和轻链可变区基因的噬菌体展示载体在E.coli突变株中繁殖(Lowetal.，J.Mol.Biol.，250:359，1996)。这些产生突变的方法是本领域技术人员已知的许多方法的例示。抗体特别是单克隆抗体可由本领域已知的方法制备。制备抗体的实例包括但不限于在杂交瘤中产生和用编码受体拮抗剂的DNA转化哺乳动物细胞。在许多公开文献中描述了这些方法(KohlerandMilstein,Nature,256:495，1975；Campbellin"MonoclonalAntibodyTechnology,TheProductionandChracterizationofRodentandHumanHybridomas"inBurdonetal,Eds.，LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,Vol.13,ElservierSciencePublishers,Amsterdam,1985；Huseetal.，Science,246:1275，1989)。抗体等效物也可通过本领域已知的方法制备。例如，可由完整抗体酶促制备抗体片段。优选地，抗体等效物是由编码这些等效物的DNA制备的。编码抗体片段的DNA可以通过删除除了所需的编码抗体全长的DNA部分之外的所有部分而制备。编码嵌合抗体的DNA可通过重组基本上或专门地来自于相应的人抗体区域的编码人恒定区域的DNA和基本上或专门地来自于除人之外的哺乳动物的可变区序列的编码可变区的DNA而制备。编码人源化抗体的DNA可通过重组基本上或专门地来自于相应的人抗体区域的编码除了互补决定区(CDRs)之外的恒定区和可变区的DNA和基本上或专门地来自于除人之外哺乳动物的编码⑶Rs的DNA而制备。编码抗体片段的DNA分子的适宜来源包括表达全长抗体的细胞，例如杂交细胞瘤。片段可作为抗体等效物而使用，或可如上述重组到等效物之中。在本节描述的DNA删除和重组可通过已知方法进行，例如在本节名为“FunctionalEquivalentsofAntibodies”的公开专利申请中描述的那些和/或例如以下描述的标准重组DNA技术。优选的转化载体和表达本发明抗体的宿主细胞是哺乳动物细胞，例如C0S-7细胞、中国仓鼠卵巢(CH0)细胞和淋巴源的细胞系(例如淋巴瘤、骨髓瘤或杂交瘤细胞)。可选择利用其他真核宿主例如酵母。例如，小鼠胎儿肝基质细胞系2018结合APtag-Flk1和APtag-Flk-2的融合蛋白，即含有VEGFR-2和Flk_2(ATCC,Manassas,VA,CRL10907)的配体，人胎儿脾细胞系Fsp62891含有Flk-2配体(ATCCCRL10935)，人基质胎儿胸腺细胞系F.thy62891含有VEGFR-2配体(ATCCCRL10936)。本文所用的术语“载体”是指任何含有将被引入宿主细胞并且将被重组和整合到宿主细胞组中的合适核酸序列、或含有作为附加体自主复制的合适核酸序列的核酸。这种载体包括线性核酸，质粒，噬菌体，粘粒，RNA载体，病毒载体等等。病毒载体的实例包括但不限于逆转录病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒。本文所用的术语“基因表达”或“靶蛋白表达”应理解成表示DNA序列的转录、mRNA转录物的翻译和Fc融合蛋白产物的分泌。在本发明中，适宜的宿主细胞可以被DNA转化或转染并可用于表达和/或分泌靶蛋白。优选用于本发明的宿主细胞包括永生杂交瘤细胞、NS/0骨髓瘤细胞、293细胞、中国仓鼠卵巢(CH0)细胞、HELA细胞和COS细胞。通过本领域已知的方法在含有可同化碳源(碳水化合物例如葡萄糖或乳糖)、氮源(氨基酸、肽、蛋白或其降解产物，例如酮、铵盐等)和无机盐(钠、钾、镁和钙的硫酸盐、磷酸盐和/或碳酸盐)的液体培养基中培养转化的细胞。培养基额外含有例如促生长物质，例如微量元素，如铁、锌、锰等。若希望在酵母中表达基因构建体，适宜用于酵母的选择基因是存在于酵母质粒YRp7±的trpl(Stinchcombetal.，Nature,28239,1979；Kingsmanetal.，Gene,7:141，1979)。trpl基因为缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变株提供了选择标记，例如ATCC44076或PEP4-1(Jones，Genetics，8512，1977)。trpl在酵母宿主细胞基因组中存在损坏然后提供了在缺乏色氨酸下通过生长来检测转化的有效环境。类似地，通过已知带有Leu2基因的质粒补充Leu2缺陷酵母株。可选地，编码受体拮抗剂的DNA可被克隆到来自病毒(例如腺病毒，腺病毒伴随病毒，疱疹病毒，逆转录病毒或慢病毒)的载体中。基因表达通过可诱导或不可诱导调控序列来控制。简言之，选择了含有表达所需DNA(例如抗体，抗体等效物或VEGF受体的核酸分子)的细胞的适宜来源。通过标准程序由适宜来源制备总RNA。总RNA直接用于cDNA合成。在例如以上所述的那些分子生物学的标准手册中提供了分离RNA和合成cDNA的标准方法。可通过已知方法扩增cDNA。例如，cDNA可作为聚合酶链式反应(PCR)的扩增模版(Saikietal.，Science,239:487，1988；US4，683，195)。用于PCR扩增的低聚核苷酸引物来源于要扩增的已知序列。通过本领域已知的方法合成所述低聚核苷酸(Caruthers，Science,230:281，1985)。将上游和下游低聚核苷酸的混合物用于PCR扩增中。根据标准程序优化每个特定引物对的条件。例如通过电泳具有正确大小的cDNA并对照引物之间的序列来分析PCR产物。可选地，编码区域可扩增两个或多个重叠片段。该重叠片段被设计成包含允许由这些片段装配成完整cDNA的限制性酶切位点。为了分离完整的VEGF受体蛋白编码区域，例如上游PCR低聚单克隆抗体与5’端的序列是互补的，并优选地包含ATG启动密码子和至少5-10个核苷酸的启动密码子上游。下游PCR低聚核苷酸引物与所需DNA序列的3’端序列是互补的。所需DNA序列优选编码VEGF受体的完整的胞外部分，并且任选地编码所有或部分跨膜区域和/或所有或部分细胞内区域，包括终止密码子。要扩增的NDA(例如编码抗体、抗体等效物或VEGF受体的DNA)也可以在多种克隆载体中在多种宿主细胞中进行复制。宿主细胞可以是原核的或真核的。拼接了DNA的载体可含有染色体、非染色体和合成DNA序列片段。一些适宜的原核克隆载体包括来自于E.coli的质粒，例如colEl、pCRI、pBR322、pMB9、pKSM和RP4。原核载体也包括噬菌体DNA的衍生物例如M13和其他丝状单链DNA噬菌体。优选用于克隆编码VEGF受体的核酸的载体是杆状病毒载体。含有要表达DNA的载体被转染到适宜的宿主细胞中。宿主细胞被保持在适宜的培养基中，并置于细胞和载体复制的条件下。可从细胞回收载体。可从载体中回收要表达的DNA。要表达的DNA(如编码抗体、抗体等效物或受体的DNA)可被插入到适宜的表达载体中并在适宜的原核或真核宿主细胞中进行表达。例如，插入宿主细胞的DNA可编码VEGF受体的整个胞外部分，或VEGF受体的胞外部分的可溶性片段。由DNA编码的VEGF受体的胞外部分可任选地在5’和/或3’端添加上附加氨基酸序列。附加氨基酸序列可添加在VEGF受体胞外区(例如前导序列)、VEGF受体的跨膜区和/或胞内区。附加氨基酸序列也可以是天然VEGF受体所未添加的序列。优选的，这种附加氨基酸序列发挥特定作用，以改善表达水平、分泌、可溶性或免疫原性。用于在细菌特别是E.coli中表达蛋白的载体是已知的(DieckmarmandTzagoloff,J.Biol.Chem.，2601513，1985)。这些载体含有编码邻氨基苯甲酸合成酶(TrpE)的DNA序列且之后在其羧基端有聚合接头。其他的表达载体系统是基于β_半乳糖苷酶(ρΕΧ)、λPL、麦芽糖结合蛋白(pMAL)和谷胱甘肽S-转移酶(pGST)(Gene,67:31，1988；PeptideResearch,3:167，1990)。用于在哺乳动物细胞中表达的适宜载体也是已知的。这种载体包括公知的SV-40衍生物、腺病毒、逆转录病毒衍生DNA序列和来自于功能性哺乳动物载体组合的改组载体，例如以上描述的那些，以及功能性质粒和噬菌体DNA。用于真核细胞表达的附加载体是本领域已知的(Southern，P.J.andBerg,P.，J.Mol.App1.Genet.，1327,1982；Subramanietal,Mol.Cell.Biol.，1854,1981；KaufinannandSharp,J.Mol.Biol.,159601,1982；KaufinannandSharp,Mol.Cell.Biol.，1982；Scahilletal.，PNAS，80:4654，1983；UrlaubandChasin,PNAS，77:4216，1980)。本发明可用的表达载体包含至少一个被操作连接到要表达的DNA序列或片段上的表达控制序列。控制序列被插入载体中以控制和调控克隆DNA序列的表达。可用的表达控制序列实例包括=Iac体系，trp体系，tac体系，trc体系，噬菌体λ的主要操纵子和启动子区，和fd包被蛋白的控制区，酵母的糖酵解启动子(例如3-膦酸甘油酸酯激酶的启动子)，酵母酸性磷酸酶的启动子(例如Pho5)，酵母α配对因子的启动子，来自于多瘤、腺病毒、逆转录病毒和猿猴病毒的启动子(例如SV40的早期和晚期启动子)，以及已知控制原核或真细胞及其病毒的基因表达的其他序列。含有控制信号和要表达的DNA(例如编码抗体、抗体等效物或VEGF受体的DNA)的载体被插入到用于表达的宿主细胞中。一些可用的表达宿主细胞包括公知的原核和真核细胞。一些适宜的原核宿主包括例如E.coli，例如，E.coliSG-936、Ε.coliHB101、E.coliW3110、E.coliX1776、Ε.coliX2282、Ε.coliDHI、和E.coliMRCI；假单胞菌(Pseudomonas)；杆菌(Bacillus),如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；禾口链霉菌(Str印tomyces)。适宜的真核细胞包括酵母和其他真菌、昆虫、动物细胞(例如COS细胞和CHO细胞)、以及组织培养的人类细胞和植物细胞。然后维持在适宜培养基的宿主细胞中进行表达，要表达的多肽或肽(例如抗体、抗体等效物或VEGF受体)可通过本领域已知的方法从培养基中分离和纯化。如果多肽或肽未被分泌到培养基中，可在分离纯化之前裂解宿主细胞。此外，本发明的抗体可通过以可溶性受体免疫哺乳动物而制备。可溶性受体本身可作为免疫原，或被附加到载体蛋白或其他目标如微球即琼脂糖微球上。在哺乳动物产生抗体之后，分离产生抗体的细胞的混合物例如脾细胞。通过从混合物中分离单个产生抗体的细胞并将这些细胞与肿瘤细胞例如骨髓瘤细胞融合使其永生来制备单克隆抗体。制得的杂交瘤被保存在培养液中，并表达单克隆抗体，单克隆抗体可从培养基中收集获得。还可由结合到表达特定感兴趣受体的细胞的表面的受体制备抗体。受体结合的细胞可以是天然表达受体的细胞，例如VEGF的血管内皮细胞。可选地，受体结合的细胞可以是被编码受体的DNA所转染的细胞，例如3T3细胞，其被VEGFR所转染。受体可用作免疫原以产生本发明的抗体。受体肽可从天然来源获取，例如从表达受体的细胞中获取。例如，VEGF受体肽可从血管内皮细胞中获取。可选地，采用商业可供机械可制备合成的受体肽。在一个实施方式中，VEGF受体氨基酸序列可由公开文献提供(Shibuyaetal.,Oncogene,5:519,1990；PCT/US92/01300；Termanetal.,Oncogene,61677，1991；Matthewsetal.，PNAS，889026,1991)。可选地，将编码受体的DNA例如cDNA或其片段进行克隆和表达，并回收制得的多肽从而以其作为免疫原以产生本发明的抗体。例如，为了制备抗体所针对的VEGF受体，可采用例如以下所述的那些标准重组DNA技术将编码本发明VEGF受体或其部分特别是其胞外部分的核酸分子插入到用于在宿主细胞表达的已知载体中。这些核酸分子的适宜来源包括表达VEGF受体的细胞，即血管内皮细胞。可在任意哺乳动物中制备抗体；除人之外的适宜哺乳动物包括例如兔，大鼠，小鼠，马，山羊或灵长类。小鼠被频繁用于制备单克隆抗体。抗体可以是以下免疫球蛋白类别中的一种成员IgG、IgM、IgA、IgD或IgE及它们的亚型，并优选是IgGl抗体。本发明的抗体和其功能等效物可以是免疫球蛋白类别的任意成员或其组合。VEGF受体的VEGF活化的中和可在体外或体内在内皮或非内皮细胞的样品例如肿瘤细胞中实施VEGF受体活化的中和。在表达VEGF受体的细胞样品中VEGF受体的VEGF活的化中和包括以本发明的抗体接触细胞。在细胞样品中添加VEGF之前同时或之后，细胞在体外接触抗体。在体内，通过给药至哺乳动物将本发明的抗体与VEGF受体接触。给药至哺乳动物的方法包括例如口服，静脉内，腹膜内，皮下，或肌肉内给药。这种体内中和方法可用于抑制已知哺乳动物的血管生成。血管生成抑制是一种有效的治疗方法，例如用于防止或抑制与病理状态如肿瘤生长相关的血管生成。因此，本发明的抗体是抗血管生成和抗肿瘤的免疫治疗剂。本发明所用的术语“哺乳动物”是指任意哺乳动物。哺乳动物的一些实例包括宠物动物，例如狗和猫；农场动物，例如猪、牛、绵羊和山羊；实验室动物，例如小鼠和大鼠；灵长类，例如猴、猿和黑猩猩；和人。在一些非内皮细胞例如肿瘤细胞中发现VEGF受体，这表明在这些细胞中存在非预期的自分泌和/或旁分泌环。本发明的拮抗剂例如抗体可用于中和这些细胞中的VEGF受体活性，从而阻断自分泌和/或旁分泌环，并抑制肿瘤生长。抑制血管生成和抑制病理状态例如在哺乳动物中的肿瘤生长的方法包括给药有效量的任意本发明拮抗剂(例如抗体，包括任意的功能等效物)至哺乳动物全身或直接至哺乳动物内的肿瘤。所述哺乳动物优选为人。这种方法可有效地治疗患有实体肿瘤(优选高度脉管肿瘤)和非实体肿瘤的受试者。抑制或减少肿瘤生长包括防止或抑制肿瘤的发展，包括癌性和非癌性肿瘤。肿瘤的发展包括侵入，转移，复发和肿瘤大小的增长。抑制或减少肿瘤生长也包括肿瘤的破除。通过本发明的方法可治疗所有类型的肿瘤。肿瘤可以是实体或非实体的。可通过本发明拮抗剂治疗的实体肿瘤的一些实例包括癌，肉瘤，胚细胞瘤或神经胶质瘤。这些肿瘤的一些实例包括表皮样肿瘤，鳞片状肿瘤(例如头颈肿瘤)，结直肠肿瘤，前列腺肿瘤，乳腺肿瘤，肺肿瘤(包括小细胞和非小细胞肺肿瘤)，胰腺肿瘤，甲状腺肿瘤，卵巢肿瘤，和肝肿瘤。其他实例包括=Kapos肉瘤、CNS瘤、成神经细胞瘤、毛细血管成血管细胞瘤、脑膜瘤和脑转移瘤、黑色素瘤、胃肠道和肾的癌和肉瘤、横纹肌肉瘤、成胶质细胞瘤(优选多形性成胶质细胞瘤)和平滑肌细胞瘤。本发明的拮抗剂有效的血管化皮肤癌的实例包括鳞片状细胞癌、基底细胞癌和可通过压制恶性角蛋白形成细胞例如人恶性角蛋白形成细胞生长而治疗的皮肤癌。非实体肿瘤的一些实例包括白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤。白血病的一些实例包括急性粒细胞白血病(AML)，慢性粒细胞白血病(CML)，急性淋巴白血病(ALL)，慢性淋巴白血病(CLL)，红细胞白血病或单核细胞性白血病。淋巴瘤的一些实例包括与霍奇金病和非霍奇金病相关的淋巴瘤。防止或抑制血管生成也可用于治疗特征为过度血管生成的病症，例如新生血管性青光眼，包括增生性糖尿病视网膜病变在内的增殖性视网膜病，关节炎，黄斑变性，血管瘤，面部血管纤维瘤，和银屑病。采用本发明的抗体以分离和纯化VEGF受体采用常规方法例如亲和层析法(Deanetal.，AffinityChromatographyAPracticalApproach,IRLPress，Arlington，VA，1985)，可利用本发明的拮抗剂分离和纯化VEGF受体。本领域公知的其他方法包括以涂有抗体的磁珠进行的磁性分离，以附着在固体基质上的抗体进行的“淘筛”，和流式细胞计数法(FACS)。VEGF受体的来源通常是表达VEGF受体的脉管细胞，特别是脉管内皮细胞。脉管内皮细胞的适宜来源是血管，例如脐带血细胞，特别是人脐带血管内皮细胞(HUVEC)。VEGF受体可用作制备其他物质的起始物质，例如用于制备能识别并结合到VEGF受体上或VEGF表达细胞表面的其他抗原上的附加单克隆和多克隆抗体的抗原。采用本发明的抗体以分离和纯化KDR阳性肿瘤细胞采用常规方法例如亲和层析法(Deanetal.，AffinityChromatographyAPracticalApproach,IRLPress，Arlington，VA，1985)，可利用本发明的抗体分离和纯化Flk-IKDR(VEGFR-2)阳性肿瘤细胞，即表达KDR的肿瘤细胞。本领域公知的其他方法包括以涂有抗体的磁珠进行的磁性分离，偶联在抗体上的细胞毒素剂(例如互补物)，以附着在固体基质上的抗体进行的“淘筛”，和流式细胞计数法(FACS)。监测体外或体内VEGF和VEGF受体水平采用本领域已知的标准试验和方法，利用本发明的抗体可在生物样品中监测体外或体内VEGF或VEGF受体的水平。生物样品的一些实例包括体液，例如血液。标准试验包括例如标记抗体和实施标准免疫试验，例如本领域公知的放射免疫试验。执行本发明的标准重组DNA技术如文献所述(Sambrooketal.，‘‘MolecularCloning,“第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1987；Ausubeletal,(Eds)"CurrentProtocolsinMolecularBiology,"GreenPublishingAssociates/ffiley-Interscience,NewYork,1990)。给药为了治疗，可将本发明受体抗体以足以防止、抑制或减缓肿瘤发展(例如肿瘤的生长、侵入、转移和/或复发)的剂量给药至患有肿瘤的患者。足以实现该目的的剂量被定义为有效治疗剂量。能有效发挥该用途的量将取决于疾病的严重性和患者自身免疫系统的概况。也会依据疾病状态和患者体质改变给药方案，通常从单次丸剂剂量或持续输注至每天多次给药(例如每4-6小时)，或如治疗医生和患者状态所指示的。然而应该注意的是本发明不限于任何特定剂量。本发明可用于治疗任何适宜肿瘤，包括例如乳腺，心，肺，小肠，结肠，脾，肾，膀胱，头颈，卵巢，前列腺，脑，胰腺，皮肤，骨骼，骨髓，血液，胸腺，子宫，睾丸，宫颈或肝的肿瘤。优选地，在肿瘤是结肠肿瘤或肿瘤是非小细胞肺癌(NSCLC)时采用本发明方法。而且，本发明的肿瘤优选具有VEGFR的异常表达或信号。在许多不同人类癌症中观察到增强的VEGFR信号。由渗入神经胶质瘤的内皮细胞表达高水平VEGFR-2(Plateetal.，Nature,359:845，1992)。由人成神经胶质瘤产生的VEGF特异性地正调节VEGFR-2水平(Plateetal.，CancerRes.,53:5822，1993)。与内皮细胞相关的成胶质细胞瘤(GAEC)中高水平的VEGFR-2表达表明了在肿瘤形成期间可能诱导受体活性，因为在正常脑内皮细胞中几乎检测不到VEGFR-2转录物。这种正调节限于最接近肿瘤的血管内皮细胞。本发明可用于抑制或减缓肿瘤生长。抑制或减缓肿瘤生长表示防止、抑制或减缓肿瘤的发展，例如肿瘤的生长、侵入、转移和/或复发。此外，本发明也可用于治疗血管生成病状，例如动脉粥样硬化、关节炎、黄斑变性和银屑病。鉴别具有本发明对症的病症的患者完全在本领域技术人员的能力和知识范围之内。本发明中，任何适宜方法或途径可用于给药VEGFR抗体，例如口服、静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内给药。拮抗剂的给药剂量取决于许多因素，包括例如抗体类型、要治疗肿瘤的类型和严重性、以及抗体给药途径。然而应该强调的是本发明不限于任何特定的给药方法或途径。在一个可选实施方式中，VEGFR拮抗剂可与一种或多种抗肿瘤药组合给药(US6，217，866)。可采用任何适宜的抗肿瘤药例如化疗剂或放疗。化疗剂的实例包括但不限于顺钼，链霉菌(doxorubicin)，紫杉醇，伊立替康(CPT-Il)，托波替康或其组合。当抗肿瘤药是放疗时，放射源可以是在待治疗患者的体外(外放射治疗-EBRT)或体内(近距离放射治疗-BT)。抗肿瘤药的给药剂量取决于许多因素，包括例如药剂类型、要治疗肿瘤的类型和严重性、以及药剂的给药途径。然而应该强调的是本发明不限于任何特定剂量。在一个附加的可选实施方式中，本发明的VEGFR抗体可与一种或多种适宜的佐剂例如细胞因子(例如IL-10和IL-13)或其他免疫刺激剂组合给药。参见例如Larriveeetal.,supra.,然而应该认识到以有效治疗方式仅给药VEGFR拮抗剂就足以防止、抑制或减缓肿瘤的发展。此外，VEGFR抗体可作为配体偶联物给药，其特异性地结合到受体上并递送毒性致命的有效载荷，之后配体_毒素被内化。为了开发过表达EGFR或VEGFR的肿瘤细胞的特异性毒剂并最小化非特异性毒性，设计了毒素和受体之间的偶联物。例如，由EGF和假单胞菌内毒素(PE)组成的偶联物在体外表现出对表达EGFR的HeLa细胞的毒性。包括硫利哒嗪和腺病毒在内的多种药剂可增强细胞对偶联物的吸收，以及增加偶联物的细胞毒性。应理解的是，为预防和治疗目的用在哺乳动物中的本发明的VEGFR抗体可以以额外含有药物可接受载体的组合物形式给药。适宜的药物可接受载体包括例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐溶液、右旋糖、甘油、乙醇等以及它们的组合中的一种或多种。药物可接受载体还可含有少量的辅助物质例如润湿或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增加了储存期或结合蛋白的有效性。如本领域公知，可制剂化成用来注射的组合物以便提供在给药至哺乳动物之后有效成分的快速、持续或延迟释放。本发明的VEGFR抗体可以是多种形式。包括例如固体、半固体和液体剂型，例如片齐、丸剂、粉末、液态溶液、分散液或悬浮液、脂质体、栓剂、可注射溶液和可注入的溶液。优选形式取决于预期的给药模式和治疗用途。可按药物领域公知的方式制备这种抗体。在组合物制备中，活性成分将通常与载体混合、或被载体稀释和/或被吸附在载体内，其可以是例如胶囊、囊剂、纸或其他容器的形式。当载体作为稀释剂时，其可以是固体、半固体或液态物质，其充当有效成分的媒介、赋形剂或介质。从而，组合物的形式可以是片剂，锭剂，囊剂，扁囊剂，酏剂，悬浮液，气雾剂(作为固体或液体介质)，含有例如高达10%重量的活性化合物的软膏，软胶囊和硬胶囊，栓剂，注射液，悬浮液，无菌包装粉末，以及局部贴剂。放射与VEGF受体拮抗剂组合使用的放射源可以在待治疗患者的体外或体内。当放射源在患者体外，该治疗被称为外放射治疗(EBRT)。当放射源在患者体内时，该治疗称为近距离放射治疗(BT)。采用为此制造的标准设备例如AECL远距离钴治疗机(Theratron)和瓦里安医用直线加速器(VarianClinac)，按照公知标准技术给药射线。射线的剂量取决于本领域公知的许多因素。这些因素包括要治疗的器官、在射线途径中可能无意间受到负面影响的健康器官、患者对放射治疗的耐受性、以及需要治疗的机体面积。剂量通常在I-IOOGy之间，更具体在2-80Gy之间。已报道的一些剂量包括对脊髓的35Gy，对肾的15Gy，对肝的20Gy，和对前列腺的65-80Gy。然后应该强调的是本发明不限于任何特定剂量。由治疗医生根据给定情况下的特定因素包括以上提及的因素确定剂量。体外射线源和进入患者的点之间的距离可以是表示杀死靶细胞和最小化副作用之间达到的可接受平衡的任何距离。通常地，体外射线源至进入患者的点之间为70cm-100cmo近距离放射治疗通常将射线源置入患者内。通常地，射线源置于离待治疗组织大约0-3cm。已知的技术包括间质、腔内和表面近距离放射治疗。放射性粒源(radioactiveseed)可被永久地或暂时地植入。已用于永久植入的一些典型放射性原子包括碘-125和氡。已用于暂时植入的一些典型放射性原子包括镭、铯-137和铱-192。已用于近距离放射治疗的一些其他放射性原子包括镅-241和金-198。近距离放射治疗中的射线剂量可同于以上所述外放射治疗的。除了以上述提及的决定外放射治疗剂量的因素之外，还要考虑所用放射性原子的特性以确定近距离放射治疗的剂量。化疗化疗剂包括所有能有效抑制肿瘤生长的化合物。可通过多种方式完成化疗剂的给药，包括通过肠胃外和肠内途径的全身给药。在一个实施方式中，VEGF受体拮抗剂和化疗剂以单独分子被给药。在另一实施方式中，例如通过偶联将VEGF受体拮抗剂附加到化疗剂上。化疗剂的实例包括烷基化剂，例如氮芥、乙烯亚胺化合物和烷基磺酸盐；抗代谢物，例如叶酸、嘌呤或嘧啶拮抗剂；有丝分裂抑制剂，例如长春花生物碱和鬼白毒素衍生物；细胞毒性抗生素；破坏或干扰DNA表达的化合物。此外，化疗剂包括本文所述的抗体、生物分子和小分子。化疗剂或化疗的特定实例包括顺钼、达卡巴嗪(DTIC)、更生霉素、二氯甲基二乙胺(氮芥)、链脲菌素、环磷酰胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNE)、多柔比星(阿霉素)、柔红霉素(daunorubicin)、丙卡巴胼(procarbazine)、丝裂霉素、阿糖胞苷(cytarabine)、依托泊苷(etoposide)、甲氨ifΠφ(methotrexate)>5-M^BtPS(5-fluorouraci1)>(vinblastine)>-lx#ifM(vincristine)、博来霉素(bleomycin)、紫杉醇(泰素)、多西紫杉醇(泰素帝)、阿地白介%(aldesleukin)、^#酉先月安_(asparaginase)、白消安(busulfan)、+白(carboplatin)、克拉屈滨(cladribine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、氟脲苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、羟基脲、异环磷酰胺(ifosfamide)、干扰素α、亮丙瑞林(Ieuprolide)、甲地孕酮(megestrol)、美法仑(melphalan)、巯嘌呤(mercaptopurine)、普利霉素(plicamycin)、米托坦(mitotane)、培门冬酶(pegaspargase)、喷司他丁(pentostatin)、哌泊溴烷(pipobroman)、普利霉素(plicamycin)、链脲菌素、他莫昔芬(tamoxifen)、替尼泊苷(teniposide)、高内酯(testolactone)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、塞替派(thiotepa)、尿嘧啶氮芥(uracilmustard)、长春瑞滨(vinorelbine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、泰素(taxol)、以及它们的组合。本发明还包括用于抑制肿瘤生长的试剂盒，该试剂盒含有有效治疗剂量的EGFR拮抗剂和有效治疗剂量的VEGFR拮抗剂。本发明的试剂盒的EGFR或VEGFR拮抗剂可以是任何适宜的拮抗剂，其实例如上所述。优选地，试剂盒的EGFR拮抗剂含有EGFR特异性的抗体或其功能等效物。可选地，且优选地，试剂盒的EGFR拮抗剂含有EGFR特异性的小分子。试剂盒的VEGFR拮抗剂含有VEGFR特异性的抗体或其功能等效物。可选地，试剂盒的VEGFR拮抗剂优选含有VEGFR特异性的小分子。此外，本发明的试剂盒还可含有抗肿瘤药。本文描述了本发明的合适抗肿瘤药的实例。本发明的试剂盒还可含有佐剂，其实例已如上所述。因此，本发明的受体抗体可在体内和体外用于研究、诊断、预防或治疗方法中，其是本领域公知的。当然，可以理解和预期的是本领域技术人员可对本文公开的发明原理进行改变，这种修改应被包括在本发明范围之内。实施例下文中将更具体地描述本发明。然而，应该理解的是这些实施例的目的仅在于示例性而不应解释成限制本发明的范围。实施例1分泌KDR-Fc的细胞系的构建从人胎盘cDNA文库(Clonetech，USA)中扩增与KDR基因(GenBank的登录号AF063658)的胞外域(ECDs)1_3对应的基因。采用分别具有BamHI和NheI消化位点的引物KDRIF(SEQIDNO21)和KDR3R(SEQIDNO22)进行扩增。SEQIDNO215'-CGCGGATCCATGGAGAGCAA-3‘SEQIDNO225'-CCGCTAGCTTTTTCATGGACCCTGACA-3‘为制备KDR(ECD1-3)-Fc嵌合蛋白，以BamHI和NheI消化由将BACE-Fc蛋白基因插入pcDNA3载体(Invitrogen，USA)中而构成的pcDNA3-BACE_Fc载体(韩国专利公开文本10-2005-0032177)，然后连接到以相同限制性内切酶消化的PCR片段上。采用引物ThFc-F(SEQIDNO23)和MycFc-R(SEQIDNO:24)通过PCR扩增Fc结构域以使其具有凝血酶消化位点和myc标签，采用NheI和XhoI位点将扩增片段与载体连接，从而构建pcDNA3-KDRD123tFcm。SEQIDNO235'-CCGCTAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCGACAAAACTCAC-3‘SEQIDNO245'-GGCTCGAGTCACAGGTCTTCCTCAGAGATCAGCTTCTGCTCTTACCCGGAGAC-3‘pcDNA3-KDRD123tFcm由编码含有人KDR的分泌信号序列和胞外域的氨基酸残基1-327的碱基序列、编码凝血酶识别位点(SSGLVPRGS)的碱基序列、编码对应人免疫球蛋白G(hlgG)的Fc结构域的227个氨基酸的碱基序列和编码myc标签的碱基序列(EQKLISEEDL)构成(图1)。为了抗体的表位定位，制备了KDR(ECDl-2)_Fc(氨基酸残基1-222)和KDR(ECD2-3)-Fc(氨基酸残基1-327(Δ24-116))。为了克隆KDR(ECD1-2)，采用弓|物KDRIF(5，-CGCGGATCCATGGAGAGCAA,SEQIDNO25)和引物KDR12R(5，_CTAGCTAGCCCTATACCCTACAACGACA_3，，SEQIDNO26)通过PCR对制得的序列进行扩增，然后将PCR扩增片段插入到以BamHI和NheI消化的pcDNA3_KDRD123tFcm中，从而制得pcDNA3_KDRD12tFcm。为克隆KDR(ECD2-3)，通过重叠PCR来扩增引物KDRIF和引物KDR23SR(SEQIDNO26)的PCR片段以及引物KDR23SF(SEQIDNO27)和引物KDR23R(SEQIDNO28)的PCR片段。采用BamHI和NheI位点将制得的PCR片段插入pcDNA3_KDRD123tFcm中，从而制得pcDNA3-KDRD23tFcm(图2)。SEQIDNO265'-ACATAACCCACAGAGGCGGCCCGGGTCTCCA-3‘SEQIDNO:27:5'-GACCCGGGCCGCCTCTGTGGGTTATGTTCAAGATTACAGA-3'SEQIDNO285'-CTAGCTAGCTTTTTCATGGACCCTGACA-3‘为制备KDR(ECD)-Fc嵌合蛋白，将以上制得的pcDNA3_KDRD123tFcm载体转染到CH0-DG44细胞中(Aprogen，Korea)，在含有10%dFBS(Gibco,USA)和500μg/mlG418(Geneticin；Sigma,USA)的α-MEM(GibCo，USA)中培养该细胞。为优化KDR(ECD)-Fc嵌合蛋白的表达，在存在MTX(甲氨蝶呤，Sigma)的CH0-SFM2培养基(Gibco)中培养该细胞，同时增加MTX的浓度。结果，确定蛋白在700nMMTX中有最佳表达。采用蛋白A亲和层析(蛋白A-琼脂糖，GEHealthcare)和体积排阻色谱(HiloadSuperdex200，GEHealthcare)对制备的蛋白进行纯化并将其储存在含有150mMNaCl的IOmM磷酸盐缓冲液(pH7.0)。图3显示了按照上述方法纯化的KDR(E⑶1_3)-Fc的SDS-PAGE结果。^MM2MirMm^(魏)单链抗体(ScFv)卩策If体展示采用TRI试剂(Sigma)从五个健康骨髓供者身上获取总RNA，基于总RNA，采用mRNA纯化试剂盒(OligotexmRNA制备试剂盒，Qiagen，USA)纯化mRNA。采用RT-PCR体系(ThermoScriptRT-PCR体系，Gibco_BRL，USA)处理mRNA以获取cDNA。为获得VH基因，采用表1所示的引物扩增V基因片段和DJ片段，采用在5’端和3’端具有SfiI限制性酶切位点的引物(SEQIDNOS29-61)通过二次PCR对每个扩增DNA片段进行扩增。表1用于扩增VH和DJ基因片段的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>其中，R表示A或G;S表示C或G为获得VL基因，采用每个用于\基因扩增的引物(表2)和用于K基因扩增的引物(表3)进行一次PCR，并采用在5’端和3’端具有BstXI消化位点的引物(入:SEQIDNOS.76-81；和k:SEQIDNOS.106-108)将每个扩增片段进行二次PCR。表2扩增入基因片段的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>其中，K表示G或T;R表示A或G;Y表示T或C;W表示A或T表3扩增k基因片段的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>其中，H表示A、C或T表示A或T为将VH基因片段和VL基因片段导入噬菌粒载体中，采用pAKlOO载体(Krebber，A.etal.，J.Immunol.Method.，201:35，1997)。为导入VL基因片段，采用快变位点特异性突变试剂盒(Stratagene，USA)突变pAKlOO载体的lac阻遏基因(lacl)中存在的三个BstXI结构域(236、365和488)。采用修饰的pAKlOO载体，为制备用于构建ScFv文库的骨干载体，将采用H05引物(SEQIDN029)和H230引物(SEQIDNO49)扩增的重链V基因和采用CDR3-3引物(SEQIDNO54)和JH-U1引物(SEQIDNO57)扩增的DJ基因片段，以H48SfiI(SEQIDNO58)/H47Sfil(SEQIDNO61)进行二次PCR，并以Sfil消化制得的重链可变区且将其连接到以相同酶消化的修饰PAK100载体中。为导入轻链和连接体，采用引物(正向:SEQIDNO109；和反向:SEQIDNO110)扩增重链区，采用每个引物(正向SEQIDNO111；和反向:SEQIDNO112)扩增人4-1BB抗体(LB506)(韩国专利公开文本2000-0034847)。采用Xbal/EcoRI将扩增片段插入具有导入的重链可变域的修饰pAKlOO载体，从而制得抗体文库骨干载体。SEQIDNO1095'-CGAATTTCTAGATAACGA-3‘SEQIDNO1105‘-CCTCCGCCACTACCTCCTCCTCCGAGGCCCCCGAGGCCTGA-3‘SEQIDNO1115'-GGTAGTGGCGGAGGAGGCTCCGGTGGATCCAGCGGTGTGGGTTCCGATATTGTG-3‘SEQIDNO1125’-CTCGAATTCCCACGAGGCTGGCTCCTCCACGTTTGATTTC-3’为导入轻链可变区，以BstXI消化每个扩增的轻链(k，入)可变区并将其插入抗体文库骨干载体中。以Sfil限制性内切酶消化制得的质粒并将其连接到之前以Sfil消化的重链可变区扩增PCR片段上。连接质粒被转染到ElectroTen-Blue感受态细胞中(Stratagene,USA)。结果，从集落中收集了具有约1011多样性的ScFv噬菌体文库。实施例3牛物淘筛将实施例2中构建的文库原液培养至对数生长期并以M13K07辅助噬菌体(GEhealthcare,USA)进行复壮。在2xYT培养基中(2xYT/C/K；含有34ug/ml氯霉素和70ug/ml卡那霉素并添加了ImMIPTG)30°C下将制得的文库扩增过夜。以20%PEG6000/2.5MNaCl沉淀噬菌体原液并重悬在PBS中。将重悬的噬菌体原液在含有500yg/ml人Fc蛋白的2%脱脂乳/PBS溶液中37°C温育1小时以去除表现出抗人Fc的噬菌体。作为抗原的KDR(人VEGFR-2)是含有KDR胞外域的IgG_样结构域1、2和3的KDR(ECDl-3)-Fc。培养实施例1制备的KDR(ECD1_3)-Fc稳定细胞系，并从培养细胞系中纯化KDR(ECDl-3)-Fc。首先以2%脱脂乳/PBS将涂有KDR(ECDl-3)_Fc(10iig/ml)的Maxisorp星号离心管(NuncDenmark)在室温下封闭2小时，然后以5.4X1012pfu的噬菌体原液在室温下孵育1小时。以PBST(含0.1%Tween20的PBS)将离心管洗涤10次，再以PBS洗涤10次。在室温下以1ml的100mM新鲜三乙胺溶液将结合噬菌体洗脱10分钟。将洗脱好的噬菌体与10ml对数中期XL1-蓝细胞保留在一起，然后振荡培养30分钟。然后，将感染的XL1-蓝细胞在含有葡萄糖的2xYT/C平板上30°C培养过夜。在一次淘筛之后，通过将KDR(ECDl-3)-Fc涂在96孔板(Nunc，USA)以替代Maxisorp离心管进行二次和三次淘筛程序。实施三次淘筛之后，通过VEGF竞争试验分析获得的噬菌体的KDR中和能力。对于VEGF竞争试验，将以200ng的VEGF165(R&Dsystem)涂覆过夜的微板与2%脱脂乳/PBS在37°C反应2小时。以PBS洗涤微板，然后将由10ngKDR(ECD1_3)-Fc与不同量噬菌体在室温下反应1小时获得的混合物置于板的每个孔中并使其在室温下反应2小时。以PBS清洗反应溶液，使其与兔抗KDR抗体(Reliatech，Germany)在37°C反应1小时，与HRP(辣根过氧化物酶)偶联的羊抗兔抗体(Abcam，UK)在37°C反应1小时。反应完成之后，以TMB溶液(Sigma)显色每个孔，然后测量在450nm处的吸光值(图4)。结果，观察到6A6、6H1、6G1和6C1都能抑制VEGF和KDR的结合，其中，6A6和6H1显示出最高的中和VEGF能力。此外，6A6和6H1表现出具有类似于实施例4获得的改造1C11(下文称为1C11)噬菌体的结合亲和力。6A6(TTAC-0001)ScFv的DNA序列、氨基酸序列和⑶R序列如图5所示。此外，6A6(TTAC_0001)ScFv的碱基序列和氨基酸序列表示为重链CDR1(SEQIDN0:113*SEQIDNO:114)、重链CDR2(SEQIDNO:115和SEQIDNO:116)、重链CDR3(SEQIDNO:117禾口SEQIDNO:118)、轻链CDR1(SEQIDNO:119禾口SEQIDNO:120)、轻链CDR2(SEQIDN0:121禾口SEQIDNO:122)、轻链CDR3(SEQIDN0:123禾口SEQIDN0:124)，重链可变区(SEQIDNO125和SEQIDNO20)、轻链可变区(SEQIDNO126和SEQIDNOl)、IgG重链区(SEQIDNO:127禾口SEQIDNO:128)、和IgG轻链区(SEQIDNO:129禾口SEQIDNO130)。实施例4改造IMC-1121(rIMC~1121)和IMC-1C11(rlMC-lCll)噬菌体载体的构建为获得可用作阳性对照组的IMC-1C11ScFv(PCT/US2001/10504)和IMC-1121ScFv(PCT/US2002/006762)噬菌体颗粒(Imclone)，将每个抗体的ScFv区克隆到pAK载体中。对于IMC-1C11，采用从小鼠naAve抗体文库(LGLifeSciences)中获取的pTA-d9_07克隆(LGLifeSciences)作为模板克隆轻链可变基因。采用表4所示的LR和LF引物扩增克隆，以BstXI消化扩增的轻链可变基因并将其连接到以BstXI预处理的文库骨干载体上。采用表4所示的引物以pTA-A5N2-10克隆(LGLifeSciences)作为模板通过PCR扩增重链可变基因。采用每个引物对HF1-RI(A)、HF2-HR2(B)、HF3-HR3(C)和HF4-HR4(D)进行每个PCR反应之后，采用A_B(HF1-HR2引物组)和C_D(HF3-HR4引物对)通过重叠PCR扩增每个扩增片段，然后采用A-B-C-D(HF1-HR4引物对)通过重叠PCR进行扩增。然后以Sfil处理每个扩增片段并将其连接到以Sfil处理的含有1C11轻链基因的文库骨干载体上。表4显示了噬菌体载体(pAK-rlcll)的PelB信号序列和琥珀(TGA)密码子的DNA序列。表4:LR和LF引物<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>为获得IMC-1121，以6G1作为模板克隆轻链可变区。采用引物对LF-KRl(A)、LF1-LR2(B)、LF2-LR3(C)和LF3-LR4(D)通过PCR扩增6G1模板，采用A-B(LF-LR2引物组)和C-D(LF2-LR引物对)通过重叠PCR进行扩增，然后采用A_B_C_D(LF-LR引物对)通过重叠PCR进行扩增。以BstXI处理获得的PCR片段并将其插入文库骨干载体中(改造IMC-1121；下文称为IMC-1121)。此处所用引物如表5所示。对于重链可变区，将从人naAvescFv文库(实施例2)中获得的克隆序列中具有最接近IMC-1121的序列的YGKL-136克隆作为模板。采用每个引物对HF-HRl(A)、HF1-HR2(B)和HF2-HR(C)通过PCR扩增YGKL-136克隆，然后进行A+B和C重叠PCR(HF_HR引物对)。以SfiI处理制备的PCR片段并将其连接到含轻链的文库骨干载体中。表5用于克隆轻链可变区的LF和HF引物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCYGKL-136CTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATT144重链(模板)CACCTTCAGTAGCTATAGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATACACTACGCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTCACAGATGCTTTTGATATCTGGGGCCCCGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTATTTAGGCTGGTATCAGCAGAAACCA6G1轻链GGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAATTTGCAAACAGGGGTCCCGCCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATC145(模板)<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>实施例5可溶件ScFv的制备和纯化为制备可溶性6A6ScFv,以EcoRI和XbaI消化具有pelB序列和ScFv序列的PAK-6A6以获得具有pelB序列和ScFv序列的片段。采用相同的限制性内切酶将片段插入pET21b载体中(NoVagen，USA)。为了给插入具有pelB序列和ScFv序列的片段的载体添加myc标签，采用引物(mycFor，SEQIDNO160；和mycRev，SEQIDNO161)通过PCR扩增作为模板的插入了PelB序列和ScFv序列的pET21b载体，并采用EcoRJ和XboI将该PCR片段连接到具有pelB序列和ScFv序列的载体中，从而构建pET21b-KDR6A6。SEQIDNO1605'-GAGCCAGCCTCGTGGAATTCGAACAAAAA-3‘SEQIDNO:1615'-TGCTCGAGATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTGAATTCCACGAGGCT-3'对于动力学测量，按以下方式在myc标签下游的XboI位点插入V5标签序列(GKPIPNPLLGLDST)。采用引物(V5-正向，SEQIDNO:162；和V5-反向，SEQIDNO163)通过PCR扩增制得的序列，所述引物扩增pET21b-KDR6A6的EcoRI和含V5标签序列的XboI消化位点，以EcoRI和XboI消化扩增的片段并将其连接在以相同限制性内切酶消化的pET21b-KDR6A6,从而构建pETV-KDR6A6。将构建的pETV-KDR6A6转化到E.coliBL21(DE3)中。SEQIDNO1625'-CCAGCCTCGTGGAATTCGAAC-3‘SEQIDNO:163:5'-CCGCTCGAGGGTGGAGTCCAGACCTAATAGAGGGTTTGGGATCGGCTTTCCATTCAGATCCTCTTCTGA-3'培养被pETV-KDR6A6转化的E.coliBL21(DE3)细胞以表达可溶性ScFv蛋白并离心，采用含有20%蔗糖和200iig/ml溶菌酶和蛋白酶抑制剂混合物(Roche，Swiss)的50mMTris(pH8.0)溶液从细胞中收集胞质部分。采用Ni_NTI亲和层析(Hispr印，GEHealthcare,USA)和离子交换色谱(Q-琼脂糖，SP-琼脂糖，GEHealthcare,USA)纯化获得的部分，从而获得ScFv蛋白。对于6A6，采用含有20mM咪唑、0.4MNaCl和lxPBS的溶液平衡Hispr印柱，在柱内装填胞质部分并以300mM含咪唑的溶液(300mM咪唑，0.4MNaCl/lxPBS)洗脱。将洗脱的蛋白在50mM咪唑(pH6.7)溶液进行透析，然后以阳离子交换色谱洗脱同时将NaCl的浓度增至0.5M。浓缩洗脱的蛋白(Centripr印YM10，Milipore，USA)，然后透析并储存在PBS溶液中。图6显示了纯化的6A6ScFv的SDS-PAGE结果。实施例6以VEGF的VEGF竞争试骑为了检测分离的ScFv能否抑制KDR和VEGF的结合，实施了竞争试验。为此，将20ng的VEGF165涂在96孔微孔板室温过夜，然后使其与2%脱脂乳/PBS在37V反应2小时。反应完成之后，以PBS洗涤板，然后将由lOOng的Fc消化KDR(ECDl-3)与不同量ScFv在室温下反应1小时获得的混合物置于微孔板中并在室温下反应2小时。反应完成之后，以PBS洗涤板，然后往其中添加抗KDR小鼠抗体(5ug/ml,Reliatech，Germany)并在37°C反应1小时。然后，往其中添加15000稀释的HRP偶联羊抗小鼠抗体(Abcam，UK)并反应1小时，然后添加TMB溶液进行反应。接着，测量每个板孔中细胞在450nm和650nm处的吸光值。图7显示了以实施例5中纯化的抗KDR-ScFv的VEGF竞争试验结果。如图7所示，可以看出仅6A6-ScFv表现出中和KDR的有效能力。实施例7抗KDRScFv抗体的表位定位为了检测哪些抗KDRScFv抗体结合到KJDR胞外域1_3中的哪个结构域中，将按照实施例1方法制备的3ug/ml每种KDR(ECDl-2)、KDR(ECD2_3)和KDR(ECD1-3)-Fc涂在96孔板上并在37°C反应2小时。反应完成之后，以PBS洗涤板，然后将未涂KDR蛋白的板部分以2%脱脂乳/PBS封闭。接着，再以PBS洗涤板，然后往其中添加330nM抗KDRScFv抗体并在37°C下反应1小时30分钟。反应完成之后，再以PBS洗涤板，然后往其中添加1500稀释的HRP偶联兔抗6x组氨酸抗体(Abcam，UK)并在37°C下反应1小时。然后，以TMB溶液将每个孔中的细胞显色并测定450nm处的吸光值。结果，可以观察到6A6以与IMC-1121相同的方式结合到KDR的胞外域3上(图8)。但是，6G1和6C1更牢固地结合到结构域1上，尽管吸光值很低。实施例8:IrG的表达和纯化为表达完整形式的IgG，制备了各含有完整恒定区的重链和轻链表达载体。对于重链表达载体，以Sfil处理具有人4-lbb的重链骨干的plgGHD载体(Aprogen，Korea)，然后将其与以Sfil处理pAK-ScFv重链可变区所获得的片段连接，从而构建表达载体pIgGHD-6A6Hvy，其含有完整的恒定区和重链区(图9)。对于轻链表达载体，以BstXI处理具有人4-lbb的轻链骨干的plgGLD载体(Aprogen，Korea)，然后将其与以BstXI处理pAK-ScFv轻链可变区所获得的片段连接，从而构建表达载体pIgGLD-6A6Lgt，其含有完整的恒定区和轻链区(图10)。对于IMC-1C11和1121，按如上所述的相同方式构建IgG表达载体。对于IgG的表达，将相同量的重链表达载体(6A6克隆的pIgGHD-6A6Hvy)和轻链表达载体(6A6克隆的pIgGLD-6A6Lgt)共转染至CHODG44细胞(Aprogen，Korea)。在含有10%dFBS和500iig/mlG418的a-MEM培养基中培养共转染的细胞，然后选择具有最高蛋白表达水平的克隆，同时往其中添加10nM-700nM浓度范围的MTX。对于抗体的表达，在含有700nMMTX的CH0-SF2培养基中37°C培养细胞，并收集培养物。按照供应商的方案采用蛋白A柱(GEHealthcare,USA)通过亲和层析从组合上清液中纯化6A6-IgG。将上清液倒入以含有20mM磷酸钠(pH7.0)和100mMNaCl的溶液平衡的蛋白A柱中并以含有20mM磷酸(pH7.0)UmMEDTA和500mMNaCl的溶液清洗。然后，以含有lOOmMNaCl的0.1M甘氨酸-HC1(pH3.3)溶液洗脱蛋白。以1MTris中和洗脱的蛋白。按11比例将洗脱蛋白与5mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)混合，然后倒入以含有50mMNaCl的5mM磷酸钠(pH6.0)平衡的预装SP-琼脂糖柱(GEHealthcare)中。以含有50mMNaCl的磷酸钠缓冲液(pH7.0)洗脱结合到柱上的蛋白并将其倒入以洗脱缓冲液平衡的预装Q-琼脂糖柱(GEHealthcare)中，收集未结合的蛋白。以30KdVivaspin20(Sartorius)浓缩收集的蛋白并以PBS透析。图11显示了按上述方法纯化的6A6IgG蛋白的SDS-PAGE结果。实施例9以不同VEGFs的抗KDRIgG竞争试骑按采用VEGF165的实施例6进行的KDRScFv的VEGF竞争试验相同的方式进行以VEGF的抗KDRIgG竞争试验。结果，在抗IgGs之中，6A6IgG表现出最高的中和KDR的能力，类似于以ScFv进行的竞争试验结果，这表明了KDR中和能力类似于在氨基酸序列基础上改造的IMC-1121抗KDRIgG(图12)。此外，为了检测6A6IgG与同型和除VEGF165之外的VEGF族的结合和竞争，将各200ng的VEGF121、VEGF165、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E涂在96孔板，然后按与实施例6相同的方法进行竞争试验。结果，6A6IgG通过与属于VEGF-A的VEGF121、VEGF165和VEGF-E的结合显示了VEGF中和能力，且它不与VEGF-C和VEGF-D结合(图13)。实施例10抗KDRScFv和I甙结合亲和力的分析以BIAcore(GEHealthcare)测量了抗体与KDR(VEGFR-2)的结合亲和力。对于ScFv，按照供应商的手册将KDR(ECDl-3)-Fc固定到CM5芯片(GEHealthcare，Sweden)上，对于V5-标签ScFv，将V5抗体(Abchem，UK)固定到芯片上。将V5-标签ScFv结合到固定有V5抗体的CM5芯片上，然后使无Fc的KDR(E⑶1-3)作用于芯片表面，从而获得感应图。对于IgG，如在没有V5的ScFv情况下，将KDR(ECDl-3)-Fc固定到CM5芯片上，然后以不同量的抗体作用于芯片表面，从而获得感应图。根据每个浓度获得的感应图，测定动力学常数kon和k。ff，从动力学常数k。ff/k。n的比值计算Kd(表6)。结果，证实在不同ScFvs中，对KDR具有高亲和结合力的ScFv是6A6。此外，当6A6被转化成IgG的形式时，其Kd值大约比IMC-1121的低2倍。这表明了相对于IMC-1121，6A6IgG更牢固地结合到KDR上。表6抗KDRScFv的Kd(M)值，IgG<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>*N/A(不适用)实施例11利用FACS分析在HUVEC细胞中分析抗KDR_IgG的KDR中和能力将原始培养的HUVEC细胞在无血清的培养基中过夜培养以诱导KDR的过度表达，然后收集细胞，以PBS洗涤三次。将洗涤的细胞与6A6或IMC-lCllIgG(10iig/ml)在4°C反应1小时，然后与FITC标记的兔抗人IgG抗体(Abchem，UK)反应60分钟。反应完成之后，洗涤细胞并以流式细胞计数仪(FACS；型号EPICS9，CoulterCorp.，USA)进行分析。结果，如图14所示，IMC-1C11和6A6在相同水平识别HUVEC细胞的KDR。此外，为了检测对VEGF的竞争抑制能力，将HUVEC细胞在无血清状态下过夜培养以诱导KDR的表达，然后收集细胞并以PBS洗涤三次。将清洗的细胞与20ng/ml的VEGF在室温下反应30分钟。反应完成之后，将细胞与6A6-IgG和IMC-1C11IgG在4°C反应1小时，然后与FITC标记的兔抗人IgG抗体在4V反应30分钟。结果如图15所示，观察到两种抗体都表现出与VEGF165结合的信号，这表明6A6-IgG竞争性结合VEGF。此外，在VEGF竞争试验中，6A6-IgG和IMC-1C11IgG表现出相同水平的KDR中和能力，但是在实际的活体细胞中6A6-IgG的KDR中和能力大约是IMC-1C11IgG的2倍。实施例12在K562细胞中抗KDR_IgG的KDR中和能力的分析为了在除了HUVEC细胞之外的KDR表达细胞系中检测抗体的KDR结合亲和力，在白血病细胞系K562(ATCCCCL-243)中分析了KDR的表达。图16显示了在K562(ATCCCCL-243)细胞中KDR表达的蛋白印迹分析结果。如图16所示，不管是否存在血清，K562和HUVEC细胞都表达KDR。因此，按与实施例11对HUVEC细胞相同方式处理K562细胞(ATCCCCL-243)并通过FACS进行分析以检测KDR-IgG是否能与K562细胞结合。结果，如图17所示，不同于HUVEC细胞，6A6_IgG仅在显著水平能与K562细胞结合。通过VEGF竞争的FACS试验结果如图18所示。如图18所示，不同于HUVEC细胞，K562细胞在阳性细胞比率上未表现出大变化。尽管不清楚原因，但是考虑是因为6A6抗体牢固地结合在K562细胞表面表达的KDR上或利用VEGF/KDR(VEGFR-2)的自分泌环机制来调控细胞的生长，因而如果外部处理VEGF，可诱导K562细胞中的KDR表达，使得相对于外部处理VEGF之前在细胞表面表达增加量的KDR蛋白，且6A6-IgG信号增强。此外，如图19所示，可看出6A6_IgG能结合到Gleevec-抗性的K562细胞(TheCatholicUniversityofKorea)的KDR上。实施例13:6A6抗体抑制HUVEC细胞增殖的分析采用WST-1试剂(Roche，Swiss)分析抗KDR-IgG对HUVEC细胞增殖的抑制。将HUVEC细胞按2xl04细胞/孔的浓度分散在涂有明胶的24孔培养板的孔中并培养18小时。然后，将细胞在无血清M199培养基(Sigma-aldrich，USA)中进一步培养4小时，然后往其中添加20ng/mlVEGF和不同浓度6A6。然后，按照供应商手册将WST-1试剂加入其中，1小时和4小时之后，测量细胞在450nm和690nm处的吸光值(图20)。结果，当以VEGF处理HUVEC细胞时，其增殖增加了三倍，而当将6A6抗体添加到HUVEC细胞中时，细胞的增殖以浓度依赖方式被降低。实施例14:6A6抗体对KDR抑制和ERK磷酸化的影响的分析将充分生长的HUVEC细胞在含1%FBS的M199培养基培养6小时，然后以不同浓度的VEGF和6A6、IMC-1121和6C1抗体处理10分钟。然后，以1ml裂解缓冲液(20mMTris-HCl,pH8.0,2mMEDTA,137mMNaCl,ImMNa3V04,ImMPMSF，10%甘油，1%TritonX-100)裂解细胞并离心，且以1Pg/ml抗KDR/Flk-1抗体(SantacruzBiotechnology,USA)4°C处理上清液3小时。处理的上清液与蛋白A琼脂糖微粒(Sigma-aldrich，USA)温育1小时，将免疫沉淀的蛋白在SDS-PAGE上进行电泳，然后以蛋白印迹进行分析(图21的A)。结果，观察到当以VEGF处理细胞时，KDR的磷酸化如预期地增加，但以6A6或IMC-1121处理细胞时，由VEGF引起的KDR的磷酸化被抑制。此外，6C1抗体对VEGF的中和没有影响。根据如上所述的方法，进行了试验以检测已知接收KDR信号的激酶ERK的磷酸化是否被抑制。结果，确认6A6和IMC-1121会抑制ERK磷酸化，但如预期地6C1基本不抑制ERK的磷酸化(图21的B)。实施例15抗KDR-6A6IrG对由VEGF诱导的内皮细胞趋化性的抑制效应的分析为了检测6A6-IgG对由VEGF诱导的HUVEC细胞迁移的抑制效应，采用了具有6.5mm直径的聚碳酸酯过滤器(8yM孔径)的培养小室(transwell)(Corningcostar,USA)。以10yg的明胶涂覆过滤器的下层表面，并将新鲜的M199培养基(含1%FBS)和VEGF置于过滤器的下层孔中。按lxl06/ml的浓度以M199培养基(含FBS)稀释HUVEC细胞，并往其中添加不同浓度的抗KDR抗体且在室温下反应30分钟。将100yl的反应液置于上层孔中并在37°C反应4小时。然后，将细胞以苏木精和伊红染色。以棉球去除未迁移的细胞，而以显微镜观察迁移至下层孔的细胞以测量迁移细胞的数量。结果，观察到由VEGF诱导的HUVEC细胞的迁移被6A6抑制。实施例16抗KDR-6A6IrG对由VEGF诱导的微管形成的抑制效应的分析为了检测6A6抗体是否抑制由VEGF诱导的HUVEC微管形成，将250u1生长因子减少的基质胶(CollaborativeBiomedicalProducts,USA)置于16mm直径的组织培养板的孔中并在37°C聚合30分钟。将HUVEC细胞悬浮在M199培养液中(含1%FBS)，并混合不同量的抗体使其与细胞反应。30分钟之后，将细胞以2xl05细胞/孔的浓度涂在基质胶上，并往其中加入lOng/ml的VEGF，将细胞培养20小时。以显微镜观察培养的细胞，以Image-Proplus(Mediacybernetics,USA)进行显象。结果，观察到6A6IgG抑制了由VEGF诱导的HUVEC微管形成(图23)。实施例17由6A6与细胞表面KDR的结合抑制VEGF-KDR的内化将2xl04细胞/孔浓度的HUVEC细胞置于涂有明胶的盖玻片上，24小时之后，将细胞以M199培养基洗涤两次并在M199培养基(含FBS)中培育6小时。将HUVEC细胞与不同浓度的抗体反应30分钟并与lOng/mlVEGF反应10分钟。反应完成之后，以甲醇或20%甲醛将细胞固定和渗透10分钟并以PBS洗涤。然后以0.TritonX-100和2%BSA/PBS将细胞封闭30分钟，并将细胞与小鼠KDR抗体反应1小时，然后与FITC标记的抗小鼠抗体在室温下反应45分钟。以SloFade(MolecularProbe)包埋盖玻片并以共焦显微镜(Zeiss，Germany)在488nm(激发波长)下进行观察。结果，图24显示，观察到6A6抗体抑制了KDR向细胞的渗透，而6G1基本不抑制KDR向细胞的渗透。实施例18杭KDR-IgG对血管牛成的抑制效应的离体分析为了检测6A6-IgG是否抑制由VEGF诱导的主动脉环血管萌发，进行了主动脉环试验。首先，从6周龄的大鼠(SpragueDawley)中分离动脉，然后切成约0.5mm的大小。将切好的动脉置于涂有120u1基质胶的48孔板中并以50u1基质胶覆盖。将VEGF(10ng/ml)和6A6-IgG、6Cl-IgG和1121-IgG与人内皮无血清培养基(Invitrogen)各混合至终体积200iil，将混合物置于板孔中。6天之后，固定细胞并以Diff_Quick(BaxterDiagnostics)染色。按0(最低阳性)至5(最高阳性)的分数对数据进行评级，且进行了6次独立试验。图25的A显示了血管萌发的图像，而图25的B显示了血管萌发分数的统计结果。6A6抗体抑制了由VEGF诱导的血管萌发，但6C1抗体未显示出抑制能力。除了6A6抑制由VEGF诱导的血管生成的简单事实之外，上述的离体大鼠主动脉环试验结果具有非常重要的意义。即，结果揭示了6A6可与Flk-1结合以中和大鼠中表达的人KDR同系物Flk-1，尽管其是为中和人KDR的目的而制备。换言之，可以看出6A6抗体在人和大鼠之间具有交叉反应性。实施例19:6A6对抑制体内由VEGF诱导的血管生成的影响(体内小鼠基质胶塞入试验)大鼠主动脉环试验之后，进行了小鼠基质胶塞入试验以检测人KDR中和抗体6A6能否抑制小鼠体内由VEGF诱导的血管生成。为此，将0.6ml含有200iig抗体、lOOngVEGF和10单位肝磷脂的基质胶皮下注射到6-8周龄的小鼠中。7天之后，通过手术将基质胶塞入物取出，并对其进行照相(图26的A)。然后，在OCT(最佳切割温度)化合物的存在下在液氮中将塞入物快速冷冻并切成8-12um的厚度。以4%中性缓冲多聚甲醛将切好的塞入物固定，以抗CD31抗体测量微血管的密度(图26的B)。观察到6A6抗体可在小鼠体内抑制由VEGF诱导的血管形成。类同于大鼠离体实验，再次证实6A6抗体可中和小鼠KDR同系物Flk-1并在人和小鼠之间具有交叉反应性。在治疗抗体中，未公开过在人和小鼠之间具有交叉反应性的KDR抗体。若采用种交叉反应性的6A6抗体，可采用小鼠或大鼠确认抗体的体内作用。20=6A6抗体在结肠癌中言云力4勿It型中的抗痛效应采用已知相对于N0D/SCID小鼠具有更容易接受人癌细胞的优势的删除了T细胞、B细胞和NK细胞的N0D/SCIDIL-2R裸鼠(雌性，11周龄，重25g，TheJacksonLaboratories,USA)分析了6A6抗体在结肠癌异种移植动物模型中的抗癌效应。对于人癌细胞，采用了称为HCT116(ATCC，USA)的人结肠癌细胞，在第0天按2xl05细胞(无血清DMEM)/10y1的浓度将细胞皮下注射到小鼠左侧来实现肿瘤细胞的注射。从第1天(在注射肿瘤细胞的第0天起24小时)，每周三次将6A6抗体静脉注射到小鼠中。将小鼠分成三组，每组由5个动物组成。组1是注射PBS组(对照组)，组2是注射100μg/ea(=4mg/kg)6A6抗体，而组3是注射200μg/ea(=8mg/kg)6A6抗体。以26天的间隔根据以下等式测量小鼠中出现的肿瘤大小肿瘤体积=l/2x(长χ面积χ高)在第30天，将小鼠处死，并测量肿瘤重量。结果观察到相对于注射PBS的对照组，在以6A6抗体给药的组内肿瘤大小依据剂量减小(图27和图28)。实施彻丨21:6A6杭体在肺癌异种移棺云M勿1草型中的杭癌效应以7xl07细胞的浓度将人肺癌A549细胞(ATCC，USA)皮下注射到裸鼠中(JapanSL,Japan)以形成肿瘤。注射癌细胞10天之后，肉眼已经可观察到肿瘤，然后每周三次将6A6抗体腹膜内注射到小鼠中。将小鼠分成三组，每组由5个动物组成。组1是注射PBS组(对照组)，组2注射lmg/kg6A6抗体，而组3注射lmg/kgof阿伐他汀(Genentech，USA)。结果如图29所看到的，相对于注射PBS的对照组，在注射6A6抗体的组和注射阿伐他汀的阳性对照组中肿瘤的生长被抑制了。实施例22放射件碘标记的6A6抗体在体内的肿瘤靶向采用抗体和CML(慢性髓性白血病)K562细胞的结合亲和力分析了6Α6抗体的肿瘤靶向作用。采用碘珠方法以放射性碘-125标记抗体，以用碘标记超过90%的抗体(图30的Α)，制备了纯度超过98%的以放射性碘标记的抗KDR(6Α6)抗体(图30的B)。将Κ562细胞皮下注射到Balb/c裸鼠中以制备CML肿瘤模型，在注射K562细胞之后的21-28天当肿瘤大小达到Icm时，将碘-125标记的抗体(100μg)注射到K562肿瘤模型裸鼠的尾静脉中。注射抗体2小时和24小时之后，获得了体内形成肿瘤的动物的γ造影图像。观察到在2小时和24小时抗体导入肿瘤表现出相似的模式，24小时之后本底放射能下降。观察到抗体定位于肿瘤，这表明了K562肿瘤表达了KDR。从而，由于抗体本身通过定位的治疗效应，以及由于放射性同位素辐射的β射线引起的治疗效应，该抗体可能用作一种放射免疫治疗剂(图31)。实施例23采用轻链改组的6Α6-Ι戒的亲和力成熟为了鉴别亲和力高于6Α6的抗体，按实施例2的操作，采用限制性内切酶SfiI从完整人抗体文库DNA中移除重链。在移除重链的位点插入以SfiI限制性内切酶处理的ΡΑΚ-6Α6的重链。将制得的DNA转化到ETB(ElectroTenblue)细胞中(Stratagene，USA)，并将细胞在SOB培养基上培养1小时。然后，将细胞涂布在2xYT(Cm)平板上，第二天收集菌落并储存在_70°C。结果，构建了具有4xl06多样性的6A6轻链改组文库(图32)。为了检测是否成功构建轻链改组文库，随机挑选48个克隆，分析其轻链序列。结果，在48个克隆的轻链序列中不存在重叠。按与实施例3相同的方式通过噬菌体展示的生物淘筛程序从文库中筛选具有高于6A6的结合亲和力的克隆。通过以下程序最终获得了18个候选者。(1)为了防止在生物淘筛程序中再选到6A6，以在6A6的⑶R3上具有识别位点的限制性内切酶SpeI处理6A6轻链改组文库的DNA。DNA被转化到ETB细胞之后，基于培养细胞构建子文库，在ELISA中分析了子文库的KDR亲和力。在由第四轮淘筛获得的候选者之中，按与实施例5相同的方式选择了94个候选者并进行KDR结合试验。在表现出阳性反应的候选者之中，随机挑选四个候选者，测定其DNA序列。此外，采用各自的噬菌体对候选者进行VEGF竞争(图33)。结果，选择了具有类似等于阳性对照组6A6的KDR中和能力的4SD5、4SC3和4SC5。(2)在生物淘筛的清洗步骤中，通过与可溶性KDR的竞争选择了KE3、KE6、2KG8、3KE11、3KF11、3KG3和K3F1。此处所采用的生物淘筛程序如下。以4mlKDR(5yg/ml)涂覆Maxisorp星号离心管(Nunc,Denmark)并以2%脱月旨乳/PBS在37°C封闭2小时。然后，将500μ1悬浮在2%脱脂乳中的6Α6轻链改组文库噬菌体与KDR结合，然后在0.PBS-T(Tween20)中反应1小时。然后，以0.1%PBST将离心管洗涤10次并以PBS缓冲液洗涤10次。然后，添加4ml可溶性KDR(25μg/ml/PBS)并使其结合30分钟，以IOOmM三乙胺处理离心管以洗脱噬菌体。洗脱的噬菌体以500μIlMTris-Cl(ρΗ7.5)中和并将其转化到Ε.coliXLl-Blue细胞50分钟，然后培养细胞。将在三个淘筛步骤中选择的抗体在ScFv-噬菌体颗粒状态下进行VEGF竞争试验。在第一次淘筛中获得的四个候选抗体之中，选择了相对于其他候选抗体具有高VEGF竞争力的KE3和KE6，排除了KC7和KQll(图34的A)。在第二次淘筛中获得的三个候选抗体之中，排除了VEGE竞争力低的2KE5，而选择了具有类似于6A6的VEGF竞争力的剩余2KG4和2KG8。2KG4表现出与后面选择的抗体3KG3相同的序列，从而其被3KG3所取代(图34的B)。在第三次淘筛中获得的五个候选抗体之中，排除了具有低竞争力的3KG2和3KF7，仅选择了3KE11、3KF11和3KG3(图34的C)。类似地，选择了通过第三次淘筛获得的K3F1，K3F1相对于6A6K3F1表现出相当高的VEGF竞争力(图34的D)。(3)在生物淘筛程序的噬菌体和抗原KDR结合的步骤中，也添加了实施例8中获得的IMC-1121IgG，结果，选择了IE4、3IG11、3IG12、3IE1、3IH2、I2F2、I3A12和I3F2克隆。此处所采用的生物淘筛程序如下。以4mlKDR(5yg/ml)涂覆Maxisorp星号离心管(Nunc,Denmark)并以2%脱月旨乳/PBS在37°C封闭2小时。然后，将500μ1悬浮在含21μg/mlIMC_1121IgG(0.14μΜ)的2%脱脂乳中的6Α6轻链改组文库噬菌体在其中结合1小时，然后在0.PBST中反应1小时。然后，以0.1%PBST将离心管洗涤10次并以PBS缓冲液洗涤10次。然后，在离心管中添加4ml可溶性KDR(25μg/ml/PBS)并使其结合30分钟，以IOOmM三乙胺进行处理以洗脱噬菌体。洗脱的噬菌体以500μ1IMTris-Cl(ρΗ7.5)中和，然后将其转化到Ε.coliXLl-Blue细胞50分钟，然后培养细胞。将在三个淘筛步骤中选择的抗体在ScFv-噬菌体颗粒状态下进行VEGF竞争试验。在第一次淘筛中获得的三个候选抗体之中，仅选择了具有类似于6A6的VEGF竞争力的IE4(图35的A)。分析了IE4的DNA序列，结果，在IE4有28个氨基酸不同于6A6。此外，6A6具有108个轻链氨基酸，而IE4具有107个氨基酸，这表明了在6A6的CDR3中被删除了一个氨基酸。图35的B显示了通过第三次淘筛获得的三个候选抗体的VEGF竞争试验结果。在DNA测序中，3IG8具有完全不同于6A6的轻链序列，在FACS结果中，3IG8不与活体细胞结合，表明了其不转化成IgG的形式。选择了3IG11、3IG12、3IE1和3IH2，并排除了3IA7，因为其在轻链序列中有一个终止密码子。图35的C显示了通过第二次淘筛和第三次淘筛获得的候选抗体的VEGF竞争试验结果。选择了全部的3IA12、I3F2和I2F2。18个被选克隆的轻链DNA序列如SEQIDNO164至SEQIDNO181所示，由DNA序列推断的氨基酸序列如SEQIDNO:2至SEQIDNO19所示。表7显示了相对于6A6轻链氨基酸(TTAC-0001)被取代的区域。此外，克隆被重命名为“TTAC-0002至TTAC-0019”(表8)。表7:18个被选克隆的突变位点<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>表8开发的抗体的新名称<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>开发的抗体的名称新名称开发的抗体的名称新名称SD5TTAC-0005I2F2TTAC-OO152KG8TTAC-0006I3A12TTAC-OO163KE11TTAC-0007I3F2TTAC-OO173KF11TTAC-00084SC3TTAC-OO183KG3TTAC-00094SC5TTAC-OO193IG11TTAC-OO10产业应用性如上具体所述的，本发明提供了完全人抗体，其具有优异的中和体内细胞中VEGF受体的能力，并且提供了含有所述抗体的抑制血管生成的组合物和治疗癌症的组合物。相对于商业可供的针对血管内皮生长因子受体的抗体，本发明的6A6抗体在活体细胞中表现出优异的中和能力，并不仅在人而且在小鼠和大鼠中也表现出中和血管内皮生长因子受体的能力。因而，6A6抗体可用于抗癌研究并在癌症治疗中高度有效。尽管参照特定特征具体描述了本发明，但本领域技术人员显然会认识到这样的说明仅是优选的实施方式而不会限定本发明的范围。从而本发明的实际范围将由所附的权利要求和其等效物所确定。权利要求一种单链可变区片段分子，该单链可变区片段分子含有由SEQIDNOS1-19的任一氨基酸序列所表示的轻链可变区，并且具有中和血管内皮生长因子受体的功能。2.根据权利要求1所述的单链可变区片段分子，该单链可变区片段分子具有由SEQIDNO20的氨基酸序列所表示的重链可变区。3.一种编码权利要求1或2所述的单链可变区片段分子的DNA。4.一种含有权利要求3所述的DNA的载体。5.重组细胞，该重组细胞转化有权利要求4所述的载体。6.根据权利要求5所述的重组细胞，其中该细胞是细菌或动物细胞。7.一种抑制血管生成的组合物，该组合物含有权利要求1或2所述的单链可变区片段分子。8.一种治疗癌症的组合物，该组合物含有权利要求1或2所述的单链可变区片段分子。9.一种IgG，该IgG含有由SEQIDN0S1-19的任一氨基酸序列所表示的轻链可变区，并且具有中和血管内皮生长因子受体的功能。10.根据权利要求9所述的IgG，该IgG具有由SEQIDNO20的氨基酸序列所表示的重链可变区。11.一种抑制血管生成的组合物，该组合物含有权利要求9或10所述的IgG。12.—种治疗癌症的组合物，该组合物含有权利要求9或10所述的IgG。全文摘要本发明涉及中和血管内皮生长因子受体的人单克隆抗体及其用途。具体而言，本发明涉及中和血管内皮生长因子受体的人ScFv分子、以及含有该人ScFv分子的抑制血管生成的组合物和治疗癌症的组合物。相对于商业可供的针对血管内皮生长因子受体的抗体，所公开的中和血管内皮生长因子受体的单克隆抗体在活体细胞中表现出优异的中和能力，并不仅在人而且在小鼠和大鼠中也表现出中和血管内皮生长因子受体的能力。因而，单克隆抗体可用于抗癌研究并在癌症治疗中高度有效。文档编号C07K16/00GK101802003SQ200780053244公开日2010年8月11日申请日期2007年6月26日优先权日2007年6月13日发明者全在元,姜贞恩,尹採玉,张贤淑,朴美熙,朴英宇,权英根,李东宪,李东燮,李俊哲,李元燮,柳珍山,柳贤美,沈相烈,片宝贞,罗根配,薛衫淑,赵头贤,金世美,金圣祐,金渡伦,金蓝珠,金贵和,高尚锡申请人:韩国生命工学研究院