专利名称：干细胞增殖因子的制作方法
技术领域：
本发明涉及从人胚细胞肿瘤细胞系中分离的自分泌生长因子。具体说来是涉及干(Stem)细胞增殖因子(SCPF)的生产、线化及应用。本发明的蛋白质以两种形式存在，即可溶性形式及膜结合形式，后者可在少数人骨髓细胞表面上检测到，并可刺激这些细胞的增殖。因此，SCPF可具有广泛的应用，包括(但不只限于)加强造血干细胞的生长。另外，可用抗体除去该蛋白质以此来控制肿瘤细胞生长。
已有人述及生长因子对以自分泌方式产生它们的细胞发挥其刺激作用。这些因子也可对其他靶细胞表现出相似的活性。然而，文献中尚未描述过从神经系统得到的肿瘤细胞可产生调节造血系统细胞生长的因子。
中枢神经系统的胚细胞肿瘤是很罕见的，占儿科实体瘤的不到3%。这些肿瘤大多发生于松果体腺和下丘脑，但也有报导发生在丘脑和基底神经节的。从组织学上看，这些肿瘤最常见的是胚细胞肿瘤(germinomas)不太常见的亚型包括绒毛膜癌，胚胎生殖细胞肿瘤及混合的胚细胞肿瘤。这些类型的肿瘤一般予后都很差。
治疗这些肿瘤有多种方法，对于胚细胞瘤可用外科和放射疗法，对于患有非生殖细胞瘤性胚细胞肿瘤、转移瘤或再发性肿瘤疾病的病人使用以增强铂为基础的化学疗法及自体骨髓移植，具有明显疗效。已报导转移瘤通过脑室旁路传播并可发生在沿分流束的任何部位。已有人报导代谢沉积物在颈部和肺部出现，但最多见的是这些沉积物与脑室内膜旁路和大脑膜移植物有关。有关从颅内胚细胞肿瘤培养的细胞系的报导不多，但已从神经器官外的胚细胞肿瘤得到几个细胞系。已从大鼠肿瘤中得到体外连续细胞系。已证明这些细胞系在原始多潜能细胞分化研究中有很大价值。
在人类医药中，能引发并调节造血机能的药物是很重要的(McCune et al.，1988，Science 2411632)。各种疾病和免疫功能紊乱，包括恶性肿瘤，似乎都与淋巴-造血系统的破坏有关。其中许多紊乱通过用始祖细胞再建造血系统得以缓解或治愈，当用这一方法启动细胞分化时将会克服病人的缺陷。在人体中，目前使用的替代治疗即是骨髓移值。除在治疗白血病中使用骨髓移植外，该疗法目前也常常用于治疗其他肿瘤生成(Epstein and Slease，1985，Surg.Ann，17125)。但这种疗法可因引入侵害性操作而造成疼痛(对于供体或受体两者)，并可能使受体发生严重的合并症，特别是当移植物对受体是异源的并出现移植物抗宿主疾病(GVHD)时。因此，GVHD的危险性限制了骨髓移植法对病人的使用，否则要引起致命疾病。骨髓移植法对病人的使用治疗造血功能紊乱的一种可能更为令人鼓舞的替代方法是给病人使用任何一种或合用几种集落刺激因子(Dexter，1987，J.Cell Soi.881)。
在血细胞生成过程中，少量自身更新干细胞产生特定的始祖细胞谱系，然后在特别激素的控制下分并化增殖由此产生成熟的循环血细胞。这些激素统称为集落刺激因子(CSFs)(Metcalf，1985，Science 22916;Dexter，1987，J.Cell Sci.881;Golde and Gasson，1988，Scientific American，July62;Tabbara and Robinson，1991，Anti-Cancer Res.1181;Ogawa，1989，Environ.Health Presp.80199;Dexter;1989，Br.Med.Bull.45337)。随着重组DNA技术的进展，目前已克隆并表达了许多这样的CSF(Souza et al.，1986，Science 23261;Gough et al.，1984，Nature.309763;Yokota et al.，1984，Proc.Natl，Acad，Sci，USA，811070;Kawasaki et al.，1985，Science 230291)。现已可得到这些重组体CSF，并已开始对其治疗潜力进行深入的研究。它们在医学中的潜在应用是广泛的，包括用于输血、骨髓移植、纠正免疫抑制性疾病、肿瘤治疗、创伤愈合及激活免疫反应等领域(Golde and Gasson，1988，Scientific American，July62)。除诱导造血始祖细胞的增殖和分化外，还显示CSF能激活成熟血细胞的许多功能(Stanley et al.，1976，J.Exp.Med.143631;Schrader et al.，1981，Proc.Natl，Acad.Sci.USA.78323;Moore et al，1980，J.Immunol.1251302;Kurland et al.，1979，Proc，Natl.Acda，Sci.USA，762326;Handman and Burgess，1979;J.Immunol.1221134;Vadas et al.，1983，Blood 611232;Vadas et al.，1983，J.Immunol.130795)，包括影响成熟造血细胞的迁移(Weibart et al.，1986，J.Immunol.1373584)。
本发明涉及干细胞增殖因子(SCPF)，其在刺激包括造血干细胞在内之各种干细胞群体生长中的应用，以及鉴定由胚细胞肿瘤产生之其他生长因子或细胞激活素的方法。SCPF是一种以分子量32，000道尔顿之分泌形式或37，000道尔顿之膜结合形式表达的新的自泌生长因子。SCPF刺激产生该因子之胚细胞肿瘤细胞系及CD34+人骨髓干细胞的增殖和生长。
本发明部分地基于发明人发现胚细胞肿瘤细胞系751向培养基中释放自泌生长因子。产生抗纯化的32KDa蛋白质的多克隆兔抗体(SAM.1)可识别32KDa分泌型产物及37KDa细胞结合蛋白质。该抗体亦可识别人骨髓中的细胞群体，而与不到2.6%的正常(粘着耗竭的)骨髓细胞反应。该SCPF骨髓细胞群体共表达干细胞标志物CD34。如在下文所述的工作实施例中所显示的，SCPF不同于任何已知的骨髓集落刺激因子(CSF)，因为对GM-CSF、G-CSF、M-CSF和IL-3特异的抗体均不能抑制SCPF的生物学活性。另外，SCPF也不同于C-Kit致癌基因产物SCF的配基，因为抗SCPF抗体并不能中和SCF功能。
在借助实施例对本发明所作的描述中，胚细胞肿瘤是从病人体内分离的，SCPF被鉴定为由该肿瘤细胞产生的自泌生长因子，并鉴定了该因子的生物化学及生物学性质。有关该新的蛋白质的广泛应用也包括于本文所描述的本发明之范围内。
图1显示根据流动细胞计数法确定的表型特征。用针对抗原标志物的抗体着染751-胚细胞系，其中所说的抗原标志物是对非神经-外胚层细胞(抗PAP，抗HCG)，和神经器官胚细胞(抗细胞角蛋白(anti-cytokeratin)、vimentin、NSE、GFAP和NFP)之细胞骨架结构特异性的。使用抗HLAI类作为对照。示于方框中的染色图形指示该细胞系为能够分化成神经或胶质谱系细胞的初级神经-外胚层细胞。
图2显示跟踪[35S]蛋氨酸代谢标记的751胚细胞肿瘤上清液的SDS-PAGE凝胶所作的放射自显影及Ambis扫描图。上清液是在35S-脉冲-751-GC-原始胚细胞体外生长24小时后收集的。从原发性皮下肿瘤中分离751-T2-nu/nu小鼠传代细胞。从肝转换瘤中分离751-Met nu/nu小鼠传代细胞。Ambis扫描针对32KDa蛋白质，并显示32KDa蛋白质在分泌量上不同于只在组织培养中传代的小鼠肿瘤、转移肿瘤及原始胚细胞系。
图3显示使用SAM.1抗体所作的37KDa凝胶纯化蛋白(SCPF)的Western印迹分析。(A)对显示37KDa蛋白质的SDS-PAGE凝胶的考马斯兰染色;(B)图3A中的凝胶的Western印迹。
图4显示抗体对肿瘤生长的抑制作用。用SAM.1抗体(抗SCPF)抑制软琼脂胶(甲基纤维素)中的肿瘤细胞集落形成。条形图显示集落(绝对数)抑制作用为抗体浓度之函数。NRS是以1∶20稀释的正常兔血清。下面的图显示用亚甲基兰染色的真实集落。
图5显示抗体对肿瘤生长的抑制作用。该图显示SAM.1抗体对肿瘤生长的抑制作用为氚标记之胸苷掺入(以测定DNA复制)的函数。将细胞以10，000个细胞/小井的数量加入96小井的微量滴定板中，并向各小井内再加入不同稀释度的抗血清。各稀释度均设三份。培养48小时后用3H-胸苷(IU/井)标记细胞并继续培养12小时，此后收获细胞并使用闪烁计数器测定放射性同位素的结合。数据表明，胚细胞751和真正原始骨髓细胞系(BO-BM.1)的增殖作用受到了抗体的抑制，但A251成神经细胞瘤细胞系则未受抑制。
图6显示对根据克隆生成活性CD34表达分离的人骨髓胚细胞所作的流动细胞计数分析结果。
图7显示CD34+细胞在长期体外培养中的复制情况在体外培养之前使用纯化的SCPF诱导CD34+细胞。
图8显示正常人骨髓细胞在对SCPF反应中的增殖作用氚标记的胸苷掺入检测法。
图9显示粘附耗竭的人骨髓细胞(9A)及用SAM.1(抗-SCPF)抗体染色的脐带血细胞(9B)的流动细胞计数分析。黑线代表FITC羊抗兔对照，兰线代表羊抗小鼠FITC对照。I类HLC(绿线)用作阳性对照。
图10显示人脐带血细胞群体的双染色(SAM.1和CD34)分析结果。
图11显示SAM.1结合于通过免疫磁性小珠分离的CD34+细胞的单色和双色流动细胞计数分析。(1a)羊抗兔FITC对照;(1b)用SMA.1抗体染色的CD34+细胞;(1c)用I类HLA鼠单克隆抗体染色的CD34+细胞;(2a)羊抗小鼠PE对照;(2b)用抗CD34抗体染色的CD34+细胞;(2c)羊抗小鼠FITC对照;(3b)用SAM.1(FITC)和抗CD34单克隆抗体(PE)双染色的CD34+细胞。
图12显示用流动细胞计数分析法比较单用SAM.1和抗CD34及两者合用的结合效率。
图13显示使用SCPF刺激的CD34+细胞的长期体外生长情况。
图14显示对使用SCPFGate C的长期培养中扩充的CD34+细胞所作的流动细胞计数分析结果(3种颜色)。
图15显示对使用SCPFGate B的长期培养中扩充的CD34+细胞所作的流动细胞计数分析结果。
图16显示SCPF的骨髓克隆产生活性。(A)单独CSF混合物(100U/ml GM-CSF，100U/ml IL-3，1U/ml EPO)的BFU活性;(B)不同浓度之SCPF的BFU活性;(C)与100ng/ml SCPF混合之CSF的BFU活性。数据表明，SCPF可单独诱导BFU活性(B)，并且也可与CSF混合物产生协同作用(C)。
图17显示SCPF的骨髓细胞克隆生成活性。(A)单用CSF混合物(100U/ml GM-CSF，100U/ml IL-3，1U/ml EPO)的CFU-GM活性;(B)不同浓度之SCPF的CFU-GM活性;(C)100ng/ml SCPF混合之CSF的CFU-GM活性。数据表明SCPF能够单独诱导CFU-GM活性(B)，而且还与CSF混合物产生协同作用(C)。
图18显示SCPF的骨髓细胞克隆生成活性。(A)单用CSF混合物(100U/ml GM-CSF，100U/ml IL-3，1U/ml EPO)的CFU-GEMM活性;(B)不同浓度之SCPF的CFU-GEMM活性;(C)与100ng/ml SCPF混合之CSF的CFU-GEMM活性。数据表明单用SCPF不能诱导CFU-GEMM活性(B)，但可与CSF混合物产生协同作用(C)。
本发明涉及干细胞增殖因子(SCPF)，用常规或重组DNA技术生产SCPF的方法，使用SCPF的方法，以及鉴定并分离从相似衍生的胚细胞肿瘤细胞系中得到的SCPF家族之其他成员的方法。
SCPF是由胚细胞肿瘤细胞系751按膜结合及分泌形式表达新的自泌生长因子。膜形式的SCPF也可在小部分CD34+人骨髓细胞的细胞表面上表达。另外，SCPF刺激CD34+骨髓干细胞的增殖，表明其可用于需要加速造血细胞生长的条件，即用于供骨髓移植或体内治疗调节造血功能之干细胞的培养物中。用抗体除去751肿瘤细胞培养物中的SCPF可导致肿瘤细胞集落形成减少，此现象提示SCPF参予支持肿瘤细胞增殖，因而这种对SCPF活性的抑制作用可用于治疗某些肿瘤。这一点可借助体内实验得以证明，其中联合注射抗SCPF抗体和751细胞后可降低该细胞系的肿瘤生成。此外，SCPF的膜结合形式的SCPF也可作为利用抗SCPF抗体鉴定和分离多潜能骨髓干细胞小群体的细胞表面标志。
SCPF或其片段及其衍生物在调节造血功能及治疗某些胚细胞肿瘤中可具有广泛的潜在应用。
在本发明的实践中，可在培养物中产生其他胚细胞肿瘤细胞系。这些肿瘤细胞可以是细胞激活素的来源，在特殊情况下对造血系统的细胞，而在一般情况下对各种不同组织类型之胚细胞或干细胞都具有生长增强活性。
下文只是为描述之目的而不是以限制方式更详细地讨论本发明。为清楚起见，主要就特别SCPF及胚细胞肿瘤细胞系来描述本发明。但其原理也同样适用于得自其他胚细胞肿瘤细胞系的其他自泌因子。
神经-外胚层胚细胞系据信中枢神经系统的胚细胞肿瘤是胚胎发生中神经嵴内原始细胞在其迁移到其他组织部位时形成的产物。这样的肿瘤细胞可产生多种作用于神经系统外组织的细胞激活素(Bhandar，1988，Med，Hypoth，27291)。因此，由胚细胞肿瘤产生的细胞系可以是早期作用性生长因子的来源，它影响包括造血系统细胞在内之各种类型细胞的增殖。
本发明用于详细描述的一个例子，是由得自诊断为沿脑室腔腹支流有多发性皮下肿块之病人体内外科切除胚细胞肿瘤产生的长期细胞系751。培养的细胞是非粘附性的，并在体外表现有极短的(7-8小时)倍增时间。经将培养的细胞转移到BNX小鼠体内，小鼠在接种102个细胞后7天内即产生了可见的皮下肿瘤，而大多数异种肿瘤在小鼠模型体内则需经过2-3个月，这一事实也可进一步证实其迅速生长动力学。
使用抗特异性细胞决定基的抗体进行流动细胞计数分析，表明751细胞系代表了在经过适当刺激后可进一步分化为神经或胶质细胞谱系的原始脑神经-外胚层细胞系。因此可见，其为具有生长和分化性质的原始多潜能细胞系。751细胞并不表达包括CD34在内的任何一种已知的白细胞表面标志物。此外，已使用对一组致癌基因序列特异的分子探针检测了致癌基因c-myc和c-fms的mRNA。因为已显示c-fms是巨噬细胞集落刺激因子的受体，所以751细胞可能以某种方式与骨髓的始祖细胞相关。
干细胞增殖因子由实施例中所述之751细胞系产生的干细胞增殖因子以两种形式存在，即分子量约32KDa的分泌形式，和分子量为37KDa的膜结合形式。经鉴定多个SCPF异型的P.I.在大约7.0至8.0范围内。
使用32KDa SCPF在兔体内产生多克隆抗血清。使用定名为SAM.1的特异性抗体以便于对751细胞产生的主要分泌蛋白质进行生物化学特性鉴定。因为该抗体可在Western免疫印迹实验中与751全细胞溶胞产物中的37KDa蛋白质反应，故首先显示它是对SCPF蛋白质特异性的。这一发现证明，该有用蛋白质可以32KDa分子量的分泌形式和37KDa分子量的膜形式存在，后者可包括固定于细胞上的跨膜成分。因此，上述蛋白质可作为可溶性分子和相互作用的细胞间的细胞表面蛋白质发挥其功能。
为了阐明该蛋白质(下文称为干细胞增殖因子，SCPF)的生物学活性，在不同浓度兔抗血清存在下，用集落抑制试验估测751细胞的集落形成能力。结果清楚地证明抗体可抑制肿瘤细胞集落形成，进而表明该分泌蛋白质是一种能促进751细胞生长的自泌生长因子。再者，抗体的增殖抑制效应是对其中成神经细胞瘤细胞系的生长不受抑制的胚细胞或干细胞系特异的。
纯化SCPF并试验其刺激人骨髓细胞增殖的能力。在克隆形成实验中显示SCPF诱导了母细胞的生长，进而通过流动细胞计数法显示其可表达CD34标志物及I类HLA抗原。当同样的细胞在不存在SCPF下，作为长期Gordon培养物生长并在重组体GM-CSF存在下试验再铺敷效力时，该细胞即产生粒细胞、单核细胞及混合表型的集落。因此，SCPF能够诱导CD34+骨髓细胞群体的复制，并在对继后集落刺激因子之刺激的反应中保持分化能力。
当抗SCPF抗体与人骨髓细胞反应时，细胞的小部分(但可测出的)显示为阳性染色。这些细胞也可表达CD34蛋白质，已报导该蛋白质是由造血干细胞表达的标志物。然而，产生SCPF的751胚细胞肿瘤对于CD34表达显示阴性，并且抗SCPF和抗CD34抗体在与纯化的CD34+细胞结合中彼此并不发生竞争性抑制，这些发现证明SAM.1抗体不针对CD34标志物而是针对膜结合形式的SCPF的。SAM.1抗体不与各种非人动物的任何蛋白质发生交叉反应，因此该抗体不与得自小鼠、牛及羊骨髓的细胞反应。
为了进一步确定SCPF的生物学特性，在纯化的异种SCPF存在下制成CD34+细胞的长期培养物。与对重组体IL-3或IL-6反应中迅速扩充的培养物不同，接受SCPF的培养物经受了一个细胞死亡的起始期，而产生其后能在对SCPF反应中增殖的残留的CD34+细胞群体。与生长于IL-3或IL-6中的培养物完全不同，用SCPF处理的细胞形态学上似乎更为均匀。然而，用SCPF处理的培养物根据细胞表面标志物的表达产生两种细胞群体。虽然两个群体均表达CD34，但一个并不表达CD38和HLA-DR，而另一个只以低水平表达这两种标志物。因此，总的说来SCPF是一种诱导CD34+骨髓细胞增殖而不引起分化的自泌生长因子，同时这些细胞保留了它们对其他分化信号反应的能力。因为除去SCPF可导致CD34+细胞存活性的迅速降低，所以可知该因子并不诱导培养细胞的恶性转化。
另外，当与其他集落刺激因子结合使用时，SCPF能够增强对骨髓细胞的刺激作用。然而，SCPF不同于任何已知的造血生长因子，因为对人GM-CSF、G-CSF、M-CSF和IL-3特异的抗体不能中和SCPF的生物学活性。此外，抗SCPF抗体并不抑制最近鉴定的干细胞因子(SCF)的功能，后者已被证明为由C-Kit致癌基因编码之受体的配基(Yokota et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.811070，williams et al.，1990，Cell 63167;Zeebo et al.，1990，Cell 63195。
SCPF编码序列的分离可从产生SCPF的细胞来源得到用于制备cDNA的信使RNA(mRNA)，而SCPF的基因组序列则可从任何细胞来源得到。例如，可利用751-NA、751-LIV或751-LN细胞作为编码SCPF之序列的来源和/或制备cDNA或基因组文库。可使用含SCPF编码序列的基因工程化微生物或细胞系作为用于该目的之DNA的方便来源。
可从使用本领域已知的技术产生的DNA片段制备cDNA或基因组文库。可使用同源于基于得自纯化蛋白质氨基酸序列信息的部分SCPF序列的核苷酸探针筛选上述文库来鉴定编码SCPF的片段。另外，可使用抗体探针筛选用表达克隆方法产生的文库如λgtll(Young and Davis，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.801194-1198)。虽然可以利用部分编码序列进行克隆和表达，但最好还是利用全长克隆，即那些含有整个SCPF编码区的序列。最后，可使用本领域技术人员熟知的分离DNA，产生适当的限制性片段，构建克隆和文库，以及筛选重组体的技术，如参见Maniatis et al.，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y中描述的技术。
不管选用什么方法来鉴定和克隆SCPF编码序列，都可利用表达克隆方法来大大减少筛选的工作量。最近，有报导克隆和表达抗体基因的一步骤方法(McCafferty et al.，1990，Nature 348552-554;Winter and Milstein，1991，Nature 349293-299)。基于这一技术，可将SCPF基因在相邻于入或fd等噬菌体的衣壳蛋白基因的位点处克隆到载体中。携带SCPF基因的噬菌体在其表面上表达融合蛋白质，从而可使用含有SCPF特异性抗体的柱选择并分离具有结合活性的噬菌体颗粒。也可使用市售的其中利用λ-Zap-bluescript的表达克隆系统(Stratagene，La Jolla，CA)进行SCPF cDNA文库的克隆，和抗体筛选。可利用瞬时基因表达系统鉴定正确的SCPF基因。例如，可使用cos细胞系统(如参Gerard & Gluzman，1986，Mol.Cell Biol.6(12)4570-4577)。
由于核苷酸编码序列的简便性，在本发明克隆和表达SCPF的实践中，可使用任何已知SCPF基因的编码类似氨基酸序列的其他DNA序列。这类改变包括不同核苷酸残基的缺失、加入或取代而产生编码相同或功能上等同基因产物之序列。基因产物可在序列内包含氨基酸残基的缺失、加入或取代，导致沉默改变而得以产生生物活性产物。可基于有关残基在极性，电荷，溶解度、疏水性、亲水性和/或两歧性等性质的相似性而作出这些氨基酸的取代作用。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸;带正电荷的氨基酸包括赖氨酸的精氨酸;具有相似亲水性值之不带电荷极性头部基因的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸。可借助聚合酶链反应，使用寡核苷酸序列增加特有基因序列的拷贝数。这一方法比使用简并寡核苷酸得到的探针更具特异性。
此外，在本发明的实践中也可使用包括结构修饰但基本上未改变所编码SCPF蛋白质生物学性质的其他DNA序列。这些修饰包括(但不只限于)SCPF中氨基酸残基的加入、缺失或取代，以造成附加的加工位点和/或除去糖基化位点。例如，在某些蛋白质中除去N-连接的糖基化位点可减少某些特别适用于酵母表达系统的被表达产物上的糖基化作用。
为了表达生物学活性SCPF，可将编码SCPF的核苷酸序列或其功能等同核苷酸序列插入适当的表达载体即含为转录或转译已插入编码序列所需之结构元件的载体中。可对经修饰的SCPF编码序列的变体进行基因工程处理，以提高被表达产物的稳定性、产生量、纯度或得率。例如，可对融合蛋白或含有SCPF及异源蛋白质之可裂解融合蛋白的表达进行工程化处理。可用亲和层析法，很容易地分离出这样的融合蛋白质，如将其固定在对异源蛋白特异的层析柱上。若在SCPF部分和异源蛋白间造成一个裂解位点，即可用适当的酶或可破坏裂解位点的试剂处理后从层析柱上释放出SCPF蛋白质(参见Booth et al.，1988，Immunol.Lett.1965-70;Gardella et al.，1990，J.Biol.Chem.26515854-15859)。
可用本领域技术人员已知的方法构建含有SCPF编码序列和适当转录/转译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术，及体内重组/基因技术(如参见Maniatis et al.，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory NY中描述的技术)。
可利用各种宿主-表达载体系统表达SCPF编码序列。这些系统包括(但不只限于)微生物，如用含有SCPF编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒型质粒DNA表达载体转化的细菌;用含有SCPF编码序列的重组体酵母表达载体转化的酵母;用含SCPF编码序列的重组体病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒，CaMV;烟草花叶病毒，TMV)转染或用重组体质粒表达载体(如Ti质粒)转化的植物细胞系统;用含有SCPF编码序列的重组体病毒表达载体(如杆状病毒)转染的昆虫细胞系统或用含有SCPF编码序列的重组体病毒表达载体(如反转录病毒、腺病毒、牛痘病毒)转染的动物细胞系统，或为稳定表达目的而进行工程化处理的转化的动物细胞系统。因为尚未完全证实SCPF含有碳水化合物，故可既使用细菌表达系统又使用提供转译和转译后修饰的表达系统，如哺乳动物、昆虫、酵母或植物表达系统。
依据所用的宿主/载体系统，可在表达载体中使用很多适当的转录和转译元件之任何一种，包括结构和可诱导性启动子、转录增强子元件及转录终止子等(参见Bitter et al.，1987，Methods in Enzymology 153516-544)。例如，当在细菌系统中克隆时，可使用λ噬菌体的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂合启动子)等可诱导性启动子。当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可使用得自哺乳动物基因组的启动子(如金属硫因启动子)或得自哺乳动物病毒的启动子(如反转录病毒长末端重复序列;腺病毒晚期启动子;牛痘病毒7.5K启动子)。以重组DNA或合成技术产生的启动子也可使用来提供被插入之SCPF编码序列的转录。
在细菌系统中，根据被表达之SCPF的需要许多表达载体可供选择。例如，当需生产大量SCPF时，可使用能指导高水平表达易于纯化的融合蛋白产物的载体。最好是那些经基因工程处理而含有裂解位点以有助于回收SCPF的载体。这样的载体包括(但不只限于)大肠杆菌表达载体PUR278(Ruther et al.，1983，EMBO J.21791)(其中SCPF编码序列可被连接到其读码内带有lac Z编码区的载体中，从而得以产生杂合SCPF-lac Z蛋白质)及PIN载体(Inouye & Inouye，1985，Nucleic Acids Res.133101-3109;Van Heeke & Schuster，1989，J.Biol.Chem.2645503-5509)等。
在酵母中，可选用许多含有色含结构或可诱导性启动子的载体。有关综述可参见Current Protocols in Molecular Biology，Vol.2，1988，Ed.Ausubel et al.，Greene Publish.Assoc.& Wiley Interscience，Ch.13;Grant et al.，1987，Expression and Secretion Vectors，for Yeast，Methods in Enzynology，Eds.Wu & Grolssman，31987，Acad，press，N.Y.，Vol.153，pp.516-544;Glover，1986，DNA Cloning，Vol.Ⅱ，IRL Press，Wash.，D.C.，Ch.3;Bitter，1987，Heterologous Gene Expression in Yeast，Method in Enzymology，Eds.Berger & Kimmel，Acad.press，N.Y.，Vol.152，pp.673-684;The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces，1982，Eds.Strathern et al.，Cold Spring Harbor Press，Vols.Ⅰand Ⅱ。可使用结构酵母启动子，如ADH或LEU2，或GAL等可诱导性启动子(Cloning in Yeast，Ch.3，R.Rothstein In，DNA Cloning，Vol.11，A Practical Approach，Ed.DM Glover，1986，IRL Press，Wash.，D.C.)。此外能启动外源DNA序列整合入酵母染色体的载体也可用。
在使用植物表达载体的情况下，可用任何一种启动子驱动SCPF编码序列的表达。例如，可使用CaMV的35S RNA和19S RNA启动子这类病毒启动子(Brisson et al.，1984，Nature 310511-514)，或TMV的衣壳蛋白质启动子(Takamatsu et al.，1987，EMBO J.6307-311);另外，也可使用RUBISCO的小亚单位这类植物启动子(Coruzzi et al.，1984，EMBO J.31671-1680;Broglie et al，1984，Science 224838-843)，或大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B这类热休克启动子(Gurley et al.，1986，Mol.Cell.Biol.6559-565)。可使用Ti质粒，Ri质粒、植物病毒载体及直接DNA转化、微注射、电穿孔等方法将这些构建体导入植物细胞中。有关这些技术的综述可参见Weissbach & Weissbach，1988，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，NY，Section Ⅷ，.421-463;Grierson & Corey，1988，Plant Molecular Biology，2d Ed.，Blackie，London，Ch.7-9。
一个用于表达SCPF的可代用的表达系统为昆虫体系，在这样的系统中，使用Autographa Californica核多角体病毒(AcNPV)作为载体来表达外来基因。病毒生长于Spodoptera frugiperda细胞中。可将SCPF编码序列克隆到病毒的非必需区域中(例如多角体基因)，并使之处于AcNPV启动子的控制之下(例如多角体启动子)。成功地插入SCPF编码序列将导致多角体基因失活并产生非闭合的重组体病毒(即缺少由多角体基因编码之蛋白质衣壳的病毒)。然后用这些重组体病毒感染在其中插入基因的被表达的Spodoptera frugiperda细胞(如参见Smith et al.，1983，J.Virol.46584;Smith，US Patent No.4，215，051)。
真核系统且更好是哺乳动物表达系统允许被表达哺乳动物蛋白质得以适当的转译后修饰。可使用具有适当加工初级转录本、糖基化、磷酸化及利于分泌基因产物之细胞机制的真核细胞作为表达SCPF的宿主细胞。其中优选哺乳动物细胞系。这样的宿主细胞系可包括(但不只限于)CHO、VERO、BHK、Hela、COS、MDCK、-293及WI38。
可对利用重组体病毒或病毒元件指导表达的哺乳动物细胞进行基因工程化处理。例如，当使用腺病毒表达载体时，可将SCPF编码序列连接到腺病毒转录/转译控制复合体中，如晚期启动子和三联前导序列中，然后可通过体外或体内重组将嵌合基因插入腺病毒基因组中。在病毒基因组的非必需区域插入(如E1或E3区域)将产生存活的并能够在被感染宿主内表达SCPF蛋白质的重组病毒(参见Logan & Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA813655-3659)。另外，也可使用牛痘病毒7.5K启动子(参见Mackett et al.，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA797415-7419;Mackett et al.，1984，J.Virol.49857-864;Panicali et al.，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA794927-4931)。其中特别感兴趣的是基于牛乳头状瘤病毒的载体(其具有作为染色体外元件复制的能力)(Sarver.et al.，1981，Mol.Cell.Biol.1486)。在该DNA进入小鼠细胞后不久，每个细胞内的质粒即可复制出大约100至200个拷贝。被插入之cDNA的转录不需要将质粒整合到宿主染色体内，从而可产生高水平的表达。可在质粒内接入可选择性标志如neo基因，以使这些载体能用来稳定表达。另外，可对反转录病毒基因组进行修饰，以将其用作能将SCPF基因导入宿主细胞内并用于指导表达的载体(Cone & Mulligan，1984，Proc.Natl.Acad.Aci.USA816349-6353)。也可使用可诱导性启动子实现高水平表达，这些启动子包括(但不只限于)金属硫因IIA启动子和热休克启动子。
为长期以高产率生产重组蛋白质，最好使用稳定的表达系统。
与其使用含有病毒复制原点的表达载体，不如适当表达控制元件(如启动子、增强子、序列，转录终止子、聚腺苷化位点等)及可选择标志控制的SCPF cDNA转化宿主细胞。重组质粒中的可选择标志赋予选择抗性，并使细胞将质粒稳定地整合到它们的染色体中，同时生长成能被依次克隆并扩充成细胞系的焦点。例如，可在引入外来DNA后，使工程化细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转入选择培养基中。可使用多种选择系统，它们包括(但不只限于)可分别在tk，hgprt或aprt细胞中使用的单纯疮疹病毒胸苷激素(Wigler，et al.，1977，Cell 11223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska & Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 482026)及腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy，et al.，1980，Cell 22817)基因。另外，可使用抗代谢物抗性作为dhfr选择的基础，它赋予对氨甲蝶呤抗性(Wigler，et al.，1980，Natl.Acad.Sci.USA773567;O′Hare，et al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA781527)、作为对gpt的选择基础，它赋予抗霉酚酸抗性(Mulligan & Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782072)、作为对neo的选择基础，它赋予抗氨葡糖苷G-418抗性(Colberre-Garapin et al.，1981，J.Mol.Biol.1501)以及作为对hygro的选择基础，它赋予抗潮霉素抗性(Santerre，et al.，1984，Gene 30147)基因。近年，已有人描述过其他可选择性基因，即可使细胞利用吲哚以取代色氨酸的trpB，使细胞利用组氨醇代替组氨酸的HisD(Hartman & Mulligan，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA858047)以及赋予抗鸟氨酸脱羧酶抑制物，2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸(DFMO)抗性的ODC基因(McConlogue L.，1987，In;Current Communication in Melecular Biology，Cold Spring Harbor Laboratory ed.)。
SCPF的生产本发明涉及膜结合和分泌形式的SCPF。SCPF是由人胚细胞瘤细胞素751天然分泌的。可从连续细胞系的条件培养基中分离SCPF，并可使用各种蛋白质纯化方法纯化成均一产物。另外，可使用重组DNA技术或化学合成方法产生SCPF。
SCPF的纯化可从分泌SCPF的细胞培养物上清液纯化SCPF，即从胚细胞瘤细胞系或基因工程化重组宿主细胞表达系统中纯化SCPF。在一特定实施方案中(参见下文实施例)，收集751细胞系的条件培养基并用SDS制备性凝胶电泳法纯化SCPF。也可使用抗SCPF抗体以免疫亲和法纯化SCPF。此外，还可使用等电聚焦法纯化SCPF。
从细胞的粗培养基中纯化SCPF的方法也可适用于纯化已克隆并表达的产物。此外，当以基因工程改造了SCPF编码序列以使之编码可裂解的融合蛋白质时，可使用亲和纯化技术很容易地纯化SCPF。例如，可在SCPF的羧基末端和麦芽糖结合蛋白之间以基因工程技术造成一个蛋白酶因子Xa裂解识别序列。可使用与直链淀粉(其上面结合了麦芽糖结合蛋白)结合的柱很容易地纯化所得到的融合蛋白质。然后用含麦芽糖的缓冲液从柱上洗脱SCPF融合蛋白质，再用因子Xa处理之。使裂解的SCPF通过第二个直链淀粉柱以除去麦芽糖结合蛋白(New England Biclals，Beverly，MA)而得以进一步纯化。使用本发明的这一技术，可在SCPF序列和第二个肽或具有可用于纯化的结合伙伴的蛋白质(如任何可制备免疫亲和柱的抗原)之间对任何裂解位点或酶裂解底物进行基因工程处理。
分离本发明SCPF的方法包括适用于分离蛋白质物质的普通方法，如包括用常见的蛋白质沉淀剂处理含SCPF的样品，然后是离子交换层析、亲和层析及超滤等分级分离技术(可合用几种方法)。如可按照美国专利4，885，236和4，882，268号中所述的方法从细胞悬液中纯化SCPF。纯化本发明多肽的其他方法也是本领域技术人员已知的(例如参见Current Protocols in Immunology，Coligan，et al.，eds.1992，列为本文作为参考文献)。
可在适当条件下对含多级分的SCPF进行SDS-PAGE分离，并回收含SCPF活性或相当于SCPF分子量的凝胶片。按照Laemmli等人所述方法(Nature，227680，1970)进行SDS-PAGE。应明确的是在适当范围内的条件改变也包括在该纯化方法内。
分离得自SDS-PAGE的含SCPF部分，并按O′Farrell(J.Biol.Chem.2504007，1975)的方法进一步作两径向凝胶电泳。第一径向是按常规方法使用宽范围的两性电解质进行等电聚焦电泳，以在凝胶上分辨出pI值在大约3.8至8.0的蛋白质。依据所需蛋白质的不同pI值以不同量加入PH2-11的两性电解质溶液。如果期望在窄PH范围内广泛提高分辨率，可按2∶1的比例将窄范围的两性电解质加到宽范围两性电解质中。优选使用分离pI约为5至9特别是约为7至8之蛋白质的两性电解质来分辨SCPF和其相应的异型。第二径向凝胶一般是以10-20%丙烯酰胺凝胶使用，但亦可使用任何一种常规的板凝胶。
可用标准方法如考马斯兰和银染色法检测由两径向凝胶电泳分辨的蛋白质。另外，可将凝胶中的蛋白质电泳转移到印迹转移膜上，并用India墨水或胶质金着染，或用Westem吸印法检测之。优选使用本发明的抗体以Western吸印法检测本发明的SCPF。
也可对含多级分的SCPF进行反相HPLC，并用例如乙腈洗脱之。所得到的基本上纯的SCPF可用来进行N末端氨基酸序列测定。在真空下干燥溶液并重新溶解在小体积乙腈(95%)+TFA(0.08%)中。然后将浓缩的样品引入接有苯硫乙内酰脲(PTH)分析仪的序列测定仪中。
可用生物检测法检验凝胶纯化之细胞激活素，如本发明SCPF可用生物检测法检测其刺激(和/或抑制)指示物细胞系增殖的生物学活性。例如，可用ML-1或KG-1a细胞检验SCPF活性。
化学合成方法也可基于其氨基酸序列，以固相化学合成技术全部或部分地产生SCPF分子(见Creighton，1983，Proteins Structures and Molecular Principles，W.H.Freeman and Co.NY，pp.50-60;Stewart and Young，1984，Peptide Synthesis，2nd.ed.，Pierce Chemical Co.)。这一方法也特别适用于产生与其一个或多个生物学活性区域相对应的SCPF片段。
抗SCPF抗体的生产生产可识别SCPF或相关蛋白质之多克隆及单克隆抗体也包括于本发明的范围内。
可用本领域已知的各种方法生产抗SCPF抗原决定基的多克隆抗体。为生产抗体，可注射SCPF蛋白或SCPF肽免疫包括(但不只限于)兔、仑鼠、小鼠、大鼠等多种宿主动物。可根据不同种的宿主动物，使用各种佐剂如包括(但不只限于)弗氏(完全或不完全佐剂)佐剂、氢氧化铅等矿物质凝胶、溶血卵磷脂等表示活性物质、普卢兰尼聚醇、多聚阴离子、肽、油乳剂、戚孔钥血兰蛋白、二硝基苯酚，以及BCG(bacille Calmette-Guerin)和Corynebacterium barvum这类适用于人的佐剂来提高免疫学反应。
在本发明的一个特定实施方案中，用纯化的SCPF免疫以产生SCPF特异性抗体。证明其中一个这样的抗血清(SAM.1)含有可与SCPF产生特异性反应，从而抑制其以自分泌方式刺激751细胞生长之活性的抗体(参见下文)。
可使用由培养的连续细胞系生产抗体分子的任何一种技术制备抗SCPF抗原决定基的单克隆抗体。所说的技术包括(但不只限于)最初由Kohler和Milstein(1975，Nature 256，495-497)描述的杂交瘤技术，以及更新的人B细胞杂交瘤技术(Kosbor et al.，1983，Immunology Today 472;Cote et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.802026-2030)以及EBV-杂交瘤技术(Cole et al.，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Theragy，Alan R.Liss，Inc.pp77-96)。可使用通过切接有适当抗原特异性之小鼠抗体分子的基因同来自人抗体分子的基因而发展的生产“嵌合抗体”的技术(参见Morrison et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.816851-6855;Neuberger et al.，1984，Nature，312604-608;Takeda et al.，1985，Nature 314452-454)。另外，用于生产单链抗体的技术(US Patent 4，946，778)也可适用于产生单链抗体。
可用已知技术产生含有分子之结合位点的抗体片段。例如，这些片段包括(但不只限于)可用胃蛋白酶消化抗体分子所产生的F(ab′)2片段，以及经还原F(ab′)2片段的二硫桥键所产生的Fab片段。
发现抗SCPF抗体可用于定量和定性测定成熟、前体及亚成分形式的膜结合或分泌的SCPF，并可用于亲和纯化SCPF蛋白质、阐明SCPF生物合成、代谢及功能，以及筛选编码免疫原抗原决定基之基因序列的SCPF表达文库。也可将抗SCPF抗体用作胚细胞或其他肿瘤的治疗剂。
SCPF的应用SCPF的功能活性和靶细胞特异性可提供广泛体外或体内应用。可在本发明的实践和方法中单独使用或与其他生物学活性生长因子、抑制剂或免疫调节剂联合使用表现有生长刺激活性的，包括SCPF或其片段或衍生物的任何化合物。SCPF、SCPF相关分子及其组合物可特别用于提高包括(但不只限于)造血干细胞在内之胚细胞/干细胞的增殖能力。
目前在造血干细胞中稳定地整合外源基因的主要障碍是已知的细胞激活素不能在没有分化的情况下刺激这些细胞增殖。已显示SCPF能够诱导纯化的CD34′细胞进入细胞周期并在长期培养中增殖(见下文)。可使用SCPF对干细胞进行基因操作，以便用于包括(但不限于)对镰状细胞性贫血等血液病进行基因治疗。
由于发现SCPF是一种由神经-外胚层来源的细胞素产生的自分泌生长因子，并且它也可作用于造血谱系的细胞，故提示SCPF可能是一种对不同组织来源的原始胚/干细胞特异的细胞激活素。已表明干细胞群体存在于包括脑、肝及皮肤在内的多种器官和组织中，此外，还显示头发脱失与头发滤泡细胞周围缺乏干细胞增殖有关。因此，SCPF可用作治疗那些需要干细胞群体生长的病理症状而不管它们的组织来源如何，这样的病理症状包括(但不只限于)头发脱失。
此外，可在受体结合试验中使用标记的SCPF或SCPF相关分子，或使用抗SCPF受体本身的抗体检测表达SCPF受体的细胞。可根据SCPF受体的存在和密度区分细胞，进而提供了一种预测这些细胞对SCPF生物学活性之反应性的方法。
鉴定来自胚细胞之细胞激活素的方法本发明阐明了鉴定和分离对各种胚/干细胞具有生物学活性之生长因子或细胞激活素的新方法。可从外科材料得到任何一种胚细胞肿瘤并制备为实践本发明所需的体外培养物。可基于表达某些标志物或对某些生长因子的反应性来选择细胞系，并可维持粘附和非粘附细胞群体。可使用抗各种细胞表面和内部细胞骨架成分(包括白细胞抗原和中间丝)的抗体，以流动细胞计数法确定已建立之细胞系的组织谱系特征。另外，可使用分子探针检验c-myc、c-fms、c-ras、c-myb、c-fos、c-sro、c-orb、c-neu、c-ros、c-sis等致癌基因的表达。
为了鉴定由已建立的细胞系产生的新的细胞激活素，可从代谢上标记细胞并用SDS-PAGE法分析所分泌的蛋白质。另外，可将培养物上清液加到已知在生物试验中对特定细胞激活素发生反应的、用作指示物的各种类型细胞内，以直接分析之。在用SDS-PAGE方法和/或根据生物学活性鉴定了主要蛋白质后，可用SDS制备性凝胶、离子交换层析及等电聚焦凝胶(参见下文所述)等纯化该蛋白质。可用SDS-PAGE进一步证实蛋白质的纯度，用蛋白质检定法定量，并用生物检测法进一步证实其活性，并将其用作生产多克隆和单克隆抗体的免疫原。
可以生物检测进一步试验经提纯的蛋白质在刺激和/或抑制各不同组织类型之各种指示物细胞系增殖的能力。也可使用亲和标记等方法，用放射标记的蛋白质鉴定其细胞表面受体。可使用特异性抗细胞激活素抗体鉴定并定量膜形式和分泌形式的细胞激活素，以研究它们的生物合成途径，亲和纯化蛋白质以及免疫筛选用于对编码序列进行分子克隆(例如使用上文所述的方法和技术)的表达文库。
实施例1产生SCPF之751胚细胞瘤细胞系的传代下述实验表明751肿瘤细胞系代表了一个在生长和细胞表面标志表达上表现有非寻常特征的极原始神经-外胚层细胞系。该细胞系的生长是目前为止未叙述的一种或多种生长因子调节的。
材料和方法细胞培养物将751细胞系维持于添加了10%胎牛血清、∠-谷氨酰胺和抗生素(青霉素/链霉素)的RPMI1640培养基中。使用锥虫兰排除法估测存活率及细胞浓度。将细胞浓度调到1×103个细胞/ml并接种于75cm组织培养瓶中，然后于含5%CO2的空气环境下37℃保温。
动物由Harlan Sprague Dawley Inc.，In得到三重免疫缺陷的by/mu/xid雌性小鼠(BNX小鼠)，被圈于无菌动物群体中。给小鼠喂以无菌Rodent Blox和酸化水ad libtium，并在长至7-9周龄时用于实验。
体外细胞生长动力学按下述方法研究751细胞系的体外生长动力学。建立起始生长曲线研究确定最佳初始细胞浓度。由此得知起始生长曲线在每小井5×103、5×104和1×105个细胞。于7天内每隔12小时进行细胞计数。所有细胞计数/样品均抽一式三份。这些初步研究结果显示，用于所有继后生长曲线的最适细胞数为5×104个。然后将细胞铺敷在12小井平板中，达到终浓度(2ml体积)为5×104细胞/小井。所有计数均以12小时间隔进行7天，并记录百分存活率。所有细胞计数/样品均重复三份。
体内细胞生长动力学试验该细胞系移植到BNX小鼠体内的能力。为了检测肿瘤生长速率，将按Log10体行系列稀释的751-NA细胞系接种(0.1ml)BNA小鼠后肢皮下。每个稀释度接种8只小鼠。每周两次检查被接种小鼠的肿瘤状态。一旦肿瘤显现后，即使用测径器每两天检测肿瘤大小。通过测量两个垂直的直径确定肿瘤大小并将两个值相乘以估计肿瘤面积。
流动细胞计数分析用对白细胞表示标记CD2、CD3、CD4、CD8、CD5、CD7、CD10、CD14、CD19、CD20、CD33、CD34、Ⅰ类和Ⅱ类HLA特异的单克隆抗体筛选751细胞。这些抗体可从Becton Dickinson，CA得到。按下述方法(Griebel et al.，1988)进行流动细胞计数分析。离心(1，000rpm，10分钟)751肿瘤细胞并以2×107的浓度重新悬浮于含有0.2%明胶、1mM迭氮钠和2%正常兔血清的0.1M PBS中。将50μl细胞悬浮液加入含50μl适当单克隆抗体的96小井平底微量滴定板中，并于4℃下保温30分钟。然后用冰冷的PBS-明胶将细胞洗3次，并加入用PBS-明胶按1/75稀释的100μl FITC标记的F(ab′)2羊抗小鼠免疫球蛋白(重和轻链特异性的)(Cooper Biomedical，Malvern，PA)于4℃下继续保温30分钟。通过2毫微尼龙单丝筛预过滤以除去所有样品中的细胞聚集体，然后立即进行FACS分析(Small Parts Inc.，Miami，FL)。也设置适当的对照组以检出非特异性标记。在这些对照组中，骨髓细胞单独与FITC标记的F(ab′)2反应或与异型适配的对无关抗原特异的单克隆抗体反应。使用Becton Dickinson Fac-Scan流动细胞计数器分析FITC标记的751肿瘤细胞。收集从20，000个细胞得到的数据以分析单克隆抗体反应性型式。使用前方位角光散射(FALS)对90%光散射(LI900)的两个参数分析消除FALS对荧光的印迹，并作为荧光对细胞数的直方图给出。这些数据也作为对给定之表型标志物阳性的细胞百分数给出。
下列抗各种抗原的抗体均由市场购得抗细胞角蛋白、抗NF200、抗NF160、抗NF68(Sigma，St.Louis，MO)、抗Vimetin(Boeringer Mannheim)、抗GFAP和抗NSE(Dakopatts，Glostrup，Denmark)。FITC连接的第二抗体试剂购自Sigma。
结果1989年，19岁的白人妇女向其当地医生主诉头痛和眼花。经CT扫描诊断她长有大的超细胞实体瘤。对肿瘤作了部分外科切除并放入脑室内膜(VP)支路以代之。手术后给予总剂量为5000cGY的局部放射治疗。因控制了残留的肿瘤，看上去她健康状况良好，直到一年后她再次主诉头痛。还发现她有沿VP旁路生长的多发性皮下肿块。身体检查发现接近其旁路的颅骨右侧有一个肿块，沿旁路管道的胸壁上有两个肿块。头部CT扫描揭示有局部复发并在其旁路附近有软组织肿块。另外，还发现她的腹部有代谢沉积物。吸出颅骨上的损伤组织，从该部分得到之细胞的细胞学特征与胚细胞肿瘤一致。1990年2月，为进一步确定细胞组织学，再次切除一个胸壁肿块。对肿瘤的组织学检查发现，是与原来于1989年活体组织检查得到的小的原始细胞凸出群体相似的非胚胎细胞瘤性混合胚细胞肿瘤。
751细胞系的来源在1990年2月进行外科手术时，将一小部分胸壁肿瘤送到实验室去进行细胞分离并使之在细胞培养中体外生长。将肿瘤分割为大约3mm的几部分。在37℃下用凡尔生-胰蛋白酶将切碎的肿瘤有限消化10分钟。酶处理后，沉降除去未被消化的组织，收集上清液，离心，并收获细胞沉淀饼。将细胞沉淀饼重新悬浮并培养于生长培养基中。
每天检查初级培养物，且每周换一次培养基。原始细胞培养物含有可与塑料皿粘附和不粘附的两种细胞。继续培养两个月后，形状不同细胞类型的数目减少到只有两个限定的作为共培养物复制的群体，一个是作为粘附细胞，另一个则作为非粘附细胞生长。约16周时观察该胚细胞系的培养物，可见非粘附细胞生长超过粘附细胞群体，成为用有限稀释法克隆的优势细胞类型并被定名为751-NA。已通过多细胞群体传代，将751-NA的体外培养物以稳定的形式维持于上述生长培养基中。为了用751-NA细胞系制备小鼠肿瘤模型，将细胞注入beige，nude，x相联免疫缺陷(BNX)小鼠的皮下组织，并使之产生组织学上与原始病人肿瘤相似的胚细胞肿瘤。无菌除去BNX小鼠的皮下肿瘤，用凡尔生-胰蛋白酶处理(见上述参考文献)，并于体外培养中重建一新的非粘附细胞系;并称之为751-MU。用取自肝和引流淋巴结的代谢沉积物建立另外两种细胞系，分别称为751-LIV和751-LN。
751细胞系的特征检查已建立之751细胞系的生长动力学和表型特征。用生长曲线分析法检查细胞体外生长并显示出独特生长曲线，很少或没有对数生长期，但发现开始时呈对数生长，经过一个短的静止期后存活率急剧降低。在7-8个小时的对数期内计算倍增时间，来图解显示生长速率。
使用BNX小鼠模型估计细胞系的体内生长特征。为确定细胞在注入小鼠体内后的生长速率，将经过一系列对数稀释率的各种751细胞系接种到动物后肢的皮下组织内。每星期两次检查小鼠并测量肿瘤的两个垂直直径的大小。发现在接种后20天时由小到只含100个细胞的接种物而长成明显的肿瘤。接种1×102个细胞即可在仅仅7天内而不是如大多数文献报导的小鼠肿瘤模型那样在2-3个月内产生肿瘤。另外，多数报导接种少于5×102个细胞并未长成肿瘤。
根据使用抗神经-外胚层胚细胞、神经细胞谱系及胶质细胞谱系之特异性细胞决定基的多克隆和单克隆抗体，对细胞所作的流动细胞计数分析来确定该细胞群体(751-NA，751-LIV，751-LN)的来源。使用下列抗体进行这一研究使用胎盘碱性磷酸酶(PAP)和人绒毛膜促性腺激素(HCG)作为检测非神经元细胞之胚细胞的标志物;用细胞角蛋白和Vimentin作为神经-外胚层来源之胚细胞的标志物;用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)作为胶质细胞谱系的标志物;用神经特异性烯醇酶(NSE)和神经丝蛋白(NFP)-68，150和200作为神经元谱系细胞的标志物。结果表明，该细胞群体(751-NA，751-MU，751-LN)代表了能在适当条件下形成神经元或胶质谱系细胞的原始脑胚细胞(见图1)。体外尚未培养出表现有这种表型的人来源的其他细胞系。
进行实验研究，以确定751细胞系是否可表达任何已知的包括HPCA-1(CD34)在内的白细胞标志。对751胚细胞瘤所作的表达CD45，CD19，CD20，CD3，CD4，CD8，CD2，CD5，CD7，CD10，CD14，CD71和CD34的FACS分析结果表明，初原始细胞系缺少包括CD34标志物在内的所有白细胞标志。
751细胞系的致癌基因表达已在许多细胞培养物系统中研究了原始致癌基因在细胞的恶性表型表达(体外和体内)中的作用。使用针对许多不同致癌基因的DNA探针进行Northern分析。这些分析显示，751细胞含有丰富的致癌基因c-myc的mRNA以及c-fms致癌基因受体。这一点是特别重要的，因为c-fms致癌基因可作为巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的受体。虽然已描述了脑内小胶质细胞上的M-CSF受体，但其存在于神经来源的原始细胞上却未见报导。然而，其可见于骨髓中的先祖细胞上并且是参予单核细胞/巨噬细胞之谱系特异性分化的生长因子之一。该受体的表达即显示了M-CSF在原始胚细胞之增殖和分化中的作用。
实施例2衍生于751细胞系的干细胞增殖因子下述实施例证明SCPF当被分泌时分子量为32KDa，当细胞结合时分子量为37KDa。对纯化之蛋白质所作双向凝胶电泳表明存在多种PI在7.0至8.0之间的蛋白质异型。
材料和方法放射标记与聚丙烯酰胺凝胶电泳751-肿瘤细胞生长于30ml培养瓶内的含10%胎牛血清和抗生素(青霉素/链霉素)的Dulbecco氏基本培养基(DMEM)中，达到106细胞/m的细胞密度。一旦达到所需细胞密度后，将细胞洗涤除去生长培养基并在添加含有蛋氨酸和2%[35S]蛋氨酸(Amersham，IL)之25%DMEM的75%无蛋氨酸DMEM中再次培养并保温。每24小时收集一次上清液，离心除去非粘附细胞，并于-20℃下保存之。然后将35S标记的上清液加至样品缓冲液(Tris-Hcl，2-巯基乙醇，10%甘油，2%SDS及0.001%溴酚兰)中并于100℃加热5分钟。然后将样品上样于SDS-PAGE凝胶上并按前述方法电泳。电泳后，在TCA(10%，W/V)，冰醋酸(10%，V/V)和甲醇(30%，V/V)中固定凝胶。固定后将凝胶放在Fluoro-hance″(Research Products Inc.，Prospect IL)中继续浸渍30分钟。取出凝胶，放在纤维纸(预浸湿的)上并于真空下加热(60℃)干燥。干燥后，使凝胶暴露于高速X射线场(Kodak X-omat AR)并于-70℃下储存24-48小时，然后进行放射自显影并分析之。
在电泳缓冲液中溶解751细胞系的细胞溶胞产物、纯化的蛋白质及上清液，并使用Laemmeli的不连续缓冲系统(1970)在12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分析。除另外指出者外，均于变性条件下完成电泳。在各实验中，均对分子量标志物(Bio Rad Laboratories)进行平行电泳并用考马斯兰染色。
SCPF的GEL纯化培养后48小时从751-NA细胞培养物中收获无血清上清液。使用Savant浓缩器将该上清液浓缩20倍，然后分析之。将浓缩的样品加到12%制备性SDS-PAGE上。SDS胶电泳后用0.3M CuCl3对凝胶进行阴性染色。从凝胶中除去有用的蛋白带，切成小片和放入含200μl洗脱缓冲液(0.25mM Tris-甘氨酸，PH8.3)的透析袋(12-14，000截留分子量)内。然后于4℃下以100V将样品电洗脱18小时。电洗脱后加反向电流30-40秒钟，移出透析袋，收获样品并透析过夜。用SDS-PAGE法检查所有冲洗制剂的纯度，然后即可用作免疫原或用于细胞增殖试验中。
抗SCPF抗体的制备免疫前给New Zealand白兔抽血，并用该免疫前血液确定基线。用含有Ribi佐剂的7μg纯化之SCPF多肽经皮下给兔免疫。初次注射后两周，再次给兔注射含有Ribi佐剂的多肽。该兔最少接受5次免疫原加Ribi佐剂皮下接种。每次接种时均给兔抽血，并用Western印迹法检验血清中是否存在可与32KDa蛋白质反应的抗体。将所有含高浓度对32KDa蛋白质特异性的抗体的血清分为若干等份并于-70℃下储存。
Western免疫吸印在电泳缓冲液中制备751-NA肿瘤细胞系的溶胞产物并使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(Laemmeli，1970)解析蛋白质。按照Towbin等人(1979)所述的技术，使用Bio-Rad半干转印迹装置将存在于凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。在电印迹缓冲液(25mM)Tris，(192mM)甘氨酸和(5%V/V)甲醇中PH8.3条件下平衡凝胶。并也在该缓冲液中平衡硝酸纤维素膜。平衡后，将硝酸纤维素膜放在铂阳极上面的滤纸上，然后在顶上铺敷凝胶接着预浸渍滤纸。安好阴极后，于25V将样品吸印/电泳35-40分钟。转移后，在含有明胶和吐温20的磷酸盐缓冲盐水(PBS-凝胶-吐温)中将膜/印迹洗4次。将印迹与预先用PBS-吐温稀释的兔多克隆抗体一起保温过夜。保温后，在PBS-凝胶-吐温中洗印迹4次，再与过氧化物酶标记的羊抗兔抗血清(Sigma，St.Louis，Mo)保温1小时，然后在PBS-吐温中洗两次并在PBS中洗两次。加入底物(0.05%(W/V)4-氯-1-萘酚和30%H2O2)并在暗处室温下将印迹保温60分钟。显现的深兰色带表明阳性反应。
克隆生成试验751肿瘤细胞系能够在含有添加了10%FBS之DMEM的甲基纤维素中形成集落(＞128个细胞/集落)。向1.0ml甲基纤维素中加入103个细胞，还向其中加入不同稀释度的体积为100μl的抗32KDa蛋白质的多克隆兔抗体。充分混合样品并铺敷于20mm Petri平皿中，然后在含5%CO2的大气环境下于37℃接种。培养后48小时，使用倒置光学显微镜计数集落数。
对各种集落刺激因子特异的抗体购自Genzyme(Boston，MA)。
长期培养物(Gordon型培养物)为了在体外培养物中长期生长人造血干细胞，需要由粘附细胞群体提供可溶性和细胞接触依赖性因子。在含有无防腐剂肝素的培养基中收集人骨髓抽出物并稀释到长期培养基中，使之在25℃m2组织培养瓶中的终体积为8ml并含有2×107个有核细胞(Gordon et al.，1987，Exp.Hematol，15772)。生长培养基由添加了肌醇(40mg/ml)，叶酸(10mg/ml)，氢化可的松(10-6M)、2-巯基乙醇(2×10-4M)和马血清与FBS之1∶1混合物(血清终浓度为25%)的α-MEM组成。为了有利于附着，将培养物置于37℃下。4天后，收集培养基和非粘附细胞，通过Ficoll/Hypaque离心以除去粒细胞和红细胞，并将低密度部分移回培养瓶内，然后，每隔一周用新鲜培养基半量置换生长培养基和非粘附细胞，直到形成会合的粘附单层。
从长期培养物中除去培养基和非粘附细胞并加入2ml新鲜培养基。然后以2000拉德照射培养瓶以清除粘附层内的造血细胞。照射后，除去培养基并换成8ml含纯化之细胞群体的新鲜培养基，以确定它们是否可在培养物中再构成和引发骨髓细胞生成。作为对照，单用培养基重新配制某些长期培养物，以证明照射是以除去所有的造血先祖细胞(阴性对照)。另外，用正常骨髓细胞重新构成某些长期培养物(阳性对照)。重新配制后，每周收集半量培养基和非粘附细胞，计数并铺敷在含有生长因子的甲基纤维素培养基中。此外，在一定时间取出一个培养瓶并经胰蛋白酶处理粘附细胞得到造血细胞集落分析中使用的单细胞悬液。
体外先祖细胞检测法下述检测法为用于检测细胞CFU活性的标准方法。
设计前集落形式单位(Pre-CFU)检测法以检测人骨髓中的早期造血先祖细胞(Smith et al.，1991，Blood，772122)。将分离的细胞与rIL-1α(100U/ml)和rIL-3(50ng/ml)一起保温，培养7天后收集并计数。在0.36%琼脂糖中铺敷1×105个细胞及1000U/ml重组体GM-CSF，并于保温14天后记录细胞集落数(750个细胞)。
为了检测骨髓单核细胞/红髓样先祖细胞(CFU-GEMM)和红髓样系列的先祖细胞(BFU-E)，而使用结合的CFU-GEMM/BFU-E检测法(Aeh et al.，1981，Blood 58309)。简单地说，将1×105个纯化的干细胞铺敷在培养基总体积为1.0ml，含有添加了5×10-5M2-巯基乙醇、30%FBS、100U/ml人rIL-3和1.0U/ml Epo及0.9%甲基纤维素之Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基的35mm直径平皿中。将培养物置于含5%CO2和10%空气氧的湿润大气环境中于37℃下保温14天。使用倒置显微镜计数细胞集落(＞50个细胞)。
还检测了由CFU-GM代表的早期造血先祖细胞(Iscove et al.，1971，Blood 371)。简单地说，将1×105个纯化的干细胞铺敷在含有总体积为1.0ml，添加了2%FBS、0.6%L-谷氨酰胺、0.9%甲基纤维素和100U/ml人重组rIL-3之α-MEM培养基的35mm直径平皿中。按上述作CFU-GEMM检测中所述的方法保温培养物并使用倒置显微镜计数细胞集落。
结果SCPF的生物化学特性为了显现由751细胞系分泌的蛋白质，使用[35S]蛋氨酸进行脉冲追踪实验。在无蛋氨酸培养基中将细胞标记12小时，然后将其置于含有蛋氨酸的冷生物培养基中。然后对35S标记的上清液进行SDS-PAGE分离。发现一个由751肿瘤细胞分泌的主蛋白带，显示计算的表观分子量(用回归分析法)为32KDa。另外发现该蛋白质的最大分泌发生在培养后的24-36小时之间(图2)。
用SDS-PAGE法分辨分泌多肽以分离该蛋白质，并根据相对于分子量标志物的适移率鉴定出32KDa多肽。一旦被鉴定后，即用电吸印法将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，切断相当于32KDa蛋白质的区域并溶解于二甲基亚砜(DMSO)中。将此蛋白质接种到兔体内，为产生的多克隆抗体传代。
使用Western免疫吸印技术试验抗751-LN总细胞溶胞产物的抗体的特异性。在该系统中，使用Bil-Rad半干转移装置将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，然后进行改良的比色ELISA分析。深兰色带的出现指示阳性带反应。这些检测法显示出可与表观分子量(根据回归分析结果计算的)为37KDa的单一蛋白质特异性反应的多克隆抗体(图3)。这一结果与分泌性蛋白质的分子量(32KDa)结合考虑，揭示(1)存在将分泌性蛋白质输送到细胞表面的信号序列;(2)分子上有使蛋白质固定于膜上的跨膜成分;以及(3)该蛋白质有两种形式，一种是膜结合形式的(37KDa)，另一种是细胞外可溶形式的(32KDa)。两种分子形式均可作为“生长因子”，且其中膜结合形式的蛋白质还在正常胚细胞发育期间参予细胞-细胞相互作用。
SCPF对胚细胞瘤细胞系的自泌生长调节作用使用抗32KDa蛋白质的多克隆抗体，在甲基纤维素中进行集落抑制试验。在前述实验中，751细胞在甲基纤维素中48小时内形成多于50个细胞的集落。如果32KDa蛋白质是调节肿瘤细胞生长的自分泌因子，阻断蛋白质与其细胞受体的结合应能降低细胞复制和集落的生长。使用系列稀释的兔多克隆抗32KDa抗体，将751-NA，751-MU和751-LN肿瘤细胞混入含有各不同稀释度血清的甲基纤维素中，于37℃下保温48小时，然后计数新形成的集落。就其相互关系来说，抗体的1/20稀释液抑制98%的集落形成。这一抑制作用显示为抗体浓度依赖性的，同时当血清稀释度为1/120时出现明显的抑制作用(＞25%)。1/20稀释的正常兔血清并不阻断集落形成(图4)。此外，用3H胸苷摄入检测法试验抗37KDa抗体阻止细胞增殖的能力(图5)。该图显示抗体事实上确实可抑制细胞增殖，并且这一抑制作用是对胚/干细胞特异的，因为只有751-Mu Met和BO Bm，I细胞受到了抑制。A251成神经细胞瘤细胞系则没有受到抑制。
SCPF与人骨髓细胞群体的相互作用下文所述的实验结果表明，抗SCPF抗体(SAM.1)可与骨髓细胞的一个小群体发生特异性地反应，并且该细胞群体看来落入CD34+分隔区内。最后，抗SCPF抗体可识别不同于CD34蛋白质的标志物，并且可能在描述干细胞群体中是很重要的。
鉴于751细胞的原始性质，而且它看来是受自分泌生长因子(SCPF)调节的，所以设计下述实验以确定纯化的天然蛋白质是否可与骨髓细胞相互作用。使用(1)骨髓-甲基纤维素克隆生成检测法，(2)3H-胸苷掺入法，以及(3)流劝细胞计数法分析这一相互作用。图3显不了用考马斯兰染色的SDS-PAGE凝胶，以及使用这些检测法中所用之纯化天然37KDa蛋白质的SAM.1多克隆抗体得到的Western印迹。凝胶上存在一条以37KDa迁移的单一带(图3A)。当与SAM.1抗体反应后该凝胶的硝酸纤维素印迹揭示出在同一位置上的带(图3B)。当在克隆生成检测法中使用不同浓度纯化之SCPF时，没有观察到有限定形态学的集落。
表1干细胞增殖因子的人骨髓克隆生成活性刺激剂 GM G M 胚细胞 总计r人GM-CSF 50u/ml 26/31 70/59 11/15 - 107/10510u/ml 14/20 52/41 6/5 - 72/661u/ml 5/3 6/1 1/0 12/4751条件培养基(×10浓度) - - - 9/7751-SCPF(天然)100μg/ml - - - 16/15/19751-SCPF(天然)10μg/ml - - - 11/13/9751-SCPF(天然)1μg/ml - - - 6/8/7对照-单加培养基 - ︱ - - ︱检测法-克隆生成(甲基纤维素)-体外1×104个非粘附细胞/小井-14天检测法然而，在这些检测试验中观察到在很松散的细胞簇内存在胚细胞样细胞。从克隆生成试验中除去这些胚细胞样细胞-置入有或没有基质饲养层的悬浮培养物中并使用SCPF扩充之。于培养后96小时收获没有基质饲养细胞的悬浮液，使用单克隆抗体HPCA-1(抗CD34)作为阴性对照的异型对照组及作为阳性对照的W6/32(抗人Ⅰ类HLA)单克隆抗体进行流动细胞计数分析。图6显示这些细胞的流动细胞计数分析结果。可见所有细胞均着染了W6/32抗Ⅰ类HLA，而且有很高百分比例的细胞还与抗CD34反应，由此表明并不是所有细胞都是CE34+。这一实验结果可能是由于1)在扩充悬浮培养物前以克隆生成检测中去掉了非CD34+细胞，或者(2)在悬浮培养时细胞发生分化。但这一事实表明SCPF蛋白可与CD34+表型的细胞相互作用。置于有基质饲养层之长期培养物中的细胞(图7)在Gordon培养条件下分析其连续生长情况。
图7显示这些细胞在SCPF不存在下在长期Cordon培养物中发生增殖。可见基质细胞对于两种可溶性因子及细胞一细胞相互接触以保持良好的生长状态和存活率是很重要的。仅给基质条件培养基的细胞不增殖或存活。在72小时从Gordon培养物中除去细胞，并于重组体GM-CSF存在下试验其复制效率(表2)。
表2SCPF刺激的骨髓细胞的复制效率以人重组体CM-CSF的反应克隆类型(形态学)处理/培养物 浓度(u/ml) 总计G GM MGordon培养物人r-GM-CSF 100 29 36 11 7650 23 41 9 73
养物进行传代。另一方面，SCPF处理的培养物的细胞存活性则迅速降低，以致到第7天时只有10-15%细胞存活。然而，该残留的CD34+细胞群体现已成为SCPF反应性的，并已在培养物中增殖达12周。对照培养物(没有生长因子)维持了3周后最终死亡。接受IL-3或IL-6的细胞是呈现混合形态的并包含粘附和非粘附细胞。细胞离心制剂显示该培养物中包含许多成熟的粒细胞及成熟的胚细胞样细胞。这些IL-3和IL-6处理的细胞在连续培养中维持达16周。SCPF处理的细胞大小更为均匀，在外观上都是单核的和胚细胞样的，并且是非粘附的。根据剂量反应实验，可知SCPF的最适浓度在50ng/ml至10ng/ml之间。
培养后12周时，用流动细胞计数法检测SCPF处理的CD34+细胞是否有CD34、CD38及DR/Ⅱ类HLA表达。图14和15所示数据说明，根据大小，SCPF扩充的CD34+细胞由两个形态学群体组成。图14(C区域)显示有CD34+、CD38-和DR-表型的小细胞群体。大的群体(图15，B区域)是CD34+，CD3810W和DR10W。因此可见，SCPF能在体外培养物中诱导CD34+细胞增殖，同时保持其CD34+表型，即可使CD34+细胞增殖而不发生分化。还于培养后8周时试验SCPF扩充之CD34+细胞和IL-3扩充之CD34+细胞的复制效率(表3)。
25 14 27 8 465 4 19 2 251 - 11 2 13只加培养基 1 2 1 4看来，在集落检测中诱导，然后在Gordon培养物中扩充的细胞能够对GM-CSF反应，并形成粒细胞(G)、单核细胞(M)及混合的GM细胞的集落，从而表明它们能够经受谱系分化而成为骨髓样细胞。在3H胸苷掺入试验中检测到的骨髓细胞的增殖还表明，SCPF诱导了骨髓来源之细胞增殖(图8)。
从上述实验证实，SCPF可与骨髓细胞的群体相互作用，因为已产生了抗SCPF的多克隆兔抗体(SAM.1)，并且SCPF是细胞结合形成的，故进行骨髓细胞的流动细胞计数分析以确定与SCPF相互作用之骨髓细胞的表型性质。使用粘附耗竭的人骨髓细胞，并以人脐带血作为新的造血干细胞的来源，试验SAM.1识别人骨髓细胞的能力。图9显示SAM.1可与骨髓(2.5%)和脐带血(1.96%)内的很小细胞群体结合。在限定这一细胞群体的尝试中，使用抗CD34藻红蛋白(PE)标记的抗体和SAM.1荧光素异硫氰酸酯(FITC)系统进行双色FACS分析(图10)。根据这些实验的结果及以前的发现，可知751细胞并不表达CD34，因而SAM.1不是针对CD34标志物本身的，显然SAM.1能识别共表达CD34标志物和SCPF的细胞群体。
显示CD34+和SCPF+的细胞群体代表了1.65%总的被检细胞群体(图10)。还用流动细胞计数法检测了SAM.1识别小鼠、牛及羊骨髓内细胞群体的能力。所有这些例子中，SAM.1不能识别任何一个来自这些非人的骨髓的有意义的细胞群体。
使用抗SCPF抗体对纯化的CD34+细胞进行流动细胞计数研究。使用与抗CD34单克隆抗体偶联的免疫磁性小球从正常人骨髓中分离出了CD34+群体并储存于液氮以备流动细胞计数用(Kessler et al.，1987，Blood 70321)。基于单和双色分析，可知SAM.1能识别CD34选择的细胞群体(图11)。此外，SAM.1和抗CD34之间没有竞争性作用(图12)。在这些实验中，CD34+细胞或单与SAM.1或与SAM.1/抗CD34的混合物一起保温。从图12中可以看出，抗CD34并不干扰SAM.1与这些细胞结合的能力。重复这些实验，但改为将CD34+细胞单与抗CD34或与SAM.1/抗CD34的混合物一起保温。如图12A所示，SAM.1不干扰抗CD34抗体的结合。这一结果再次表明，SAM.1抗体可识别不同的细胞表面抗原。
使用SCPF建立CD34+细胞的长期培养物在外加纯化之天然SCPF的情况下引发CD34+细胞的长期培养物。还包括不加任何外源生长因子的培养物，以及加有100U/ml白介素3(IL-3)和100U/ml白介素6(IL-6)的培养物。将纯化的CD34+细胞以200，000细胞/ml的浓度加入24小井平板的各小井内，并加入适当的生长因子。加入不同浓度(1ng/ml至10ng/ml)的纯化的SCPF。每隔3天换培养基并加入外源生长因子。每天检查所有培养物以估计细胞的存活性和生长状态。
这些研究的结果总结于图13中。接受IL-3或IL-6的培养物迅速扩增，且几乎不存在不活细胞，到第7天，对所需培表3对干细胞增殖因子和人重组体IL-3有反应性之CD34+细胞的复制效率细胞φ处理r-IL-3 r-GM-CSF100§ 50 25 5 100 50 25 5CD34+扩充的 r-IL-3 12↑ 7 1 0 9 6 3 -(8周)CD34+扩充的 SCPF 162 109 92 41 145 114 62 31(8周)CD34+扩充的 IL-6 18 11 6 - 15 12 4 -(8周)↑所记录的集落数φ103个细胞/小井§单位/ml这些数据再次提示在IL-3存在下增殖的细胞复制效率很差(使用重组体IL-3和GM-CSF)。另一方面，于IL-3和GM-CSF存在下，SCPF处理的CD34+细胞则有很好的复制效率，由此再次表明了SCPF扩充之细胞的原始性质。因为CD34+细胞于去掉SCPF后4-5天内即死亡，可见SCPF并不能于CD34+细胞施加任何恶性表型。
就该生长因子与骨髓干细胞作为初级信号相互作用的能力所进行的研究表明，SCPF能够诱导BFU和CFU-GM集落(图16和17)。SCPF看来并不能诱导CFU-GEMM。然而，该因子能够提高集落刺激因子混合物(GM-CSF，IL-3和EPO)的活性，从而显著增加对BFU(图16A和C)、CFU-GM(图17A和C)及CFU-GEMM(图18A和C)集落的CSF活性。
SCPF诱导CD34+细胞进入细胞周期下述实验分析SCPF和IL-3诱导纯化CD34+骨髓细胞复制的能力。结果证明，当单独给予SCPF和IL-3时，两者均可刺激细胞进入细胞周期。当将两种细胞激活素结合加到培养的细胞内时，可对增加Gα期细胞的百分比产生加合作用(表4)。
表4用流动细胞计数法和Propidium Iodine法检测的SCPF对CD34+细胞进入细胞周期的诱导作用
$100μ/ml r Hu-IL-3§100ng/mlSCPF抗体抑制研究下述研究工作旨在检验人GM-CSF、G-CSF、M-CSF和IL-3特异性多克隆抗体在甲基纤维素骨髓集落检测法中中和SCPF诱导的胚细胞集落形成上的应用(表5)。
表5特异性抗体对SCPF集落形成活性的抑制作用SCPF/胚细胞集落数细胞 抗体 处理100ng/ml 50ng/ml 25ng/mlBM2+ 24 16 8抗GM-CSFN/A - 23 14 9BM + 21 13 6抗G-CSFN/A - 19 14 4BM + 26 14 5抗M-SCFN/A - 19 16 7BM + 19 11 5抗IL-3N/A - 17 10 5BM + 8 2 0SAM.1N/A - 26 15 8单用IL IL-3(20ng GM(20 GM(20ng-3(20 /ml)+SCF ng/ml) /ml)+SCFng/ml) (25ng/ml) 单用 (25ng/ml)BM + 24φ59 31 92SAM.1M/A - 22 63 33 86a使用1×104个细胞进行克隆生成检测b所观察到的总集落数数据表明这些多克隆抗体均不能中和由SCPF诱导的胚细胞集落，而SAM.1则能够中和它们的诱导作用。然而，SAM.1抗体却不能抑制GM-CSF和IL-3的人干细胞因子(SCF)增强效应。这表明SCPF不同于已知的CSF，因为SAM.1抗体并不抑制SCF的功能，SCPF在功能上看来不同于SCF。
两向凝胶电泳化学试剂，丙烯酰胺、N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，尿素，过硫酸铵、N，N，N，N-四甲基乙二胺和AG501-Xg分析纯混合的柱床树脂均购自BiO-Rad(Rockville Centre，NY)。Pharmalyte pH3-10和Biolyte pH3-10两性电解质和分子量标准品(Mr20，100，胰蛋白酶抑制剂，大豆;24，000，胰蛋白酶原;29，000，碳酸酐酶;36，000，甘油醛-3-磷酸脱氢酶;45，000，白蛋白，卵;66，000，白蛋白，牛;97，400，磷酸化酶B;116，000，β-半乳糖苷酶)均购自Sigma Chemical Co.(St.Louis，Mo)。BCA蛋白质检测试剂购自Pierce(Rockford，IL)。所有其他化学试剂均为分析纯并分别购自Fisher Scientific或Sigma Chemical Co.。
第一径向。在内径为0.3cm底部封有石腊的11cm玻璃试管中制备等电聚焦凝胶(IEF)(O′Farrell，J.Biol.Chem.，2504009，1975)。分两步骤制备含有4%丙烯酰胺，9M尿素，2%Nonidet P-40和2%两性电解质的试管凝胶。首先，混合下列成分并于AG501-X8树脂存在下(45mg/ml混合物)轻轻搅拌约10分钟，这些成份为2.5ml丙烯酰胺储备溶液(38%(W/V)丙烯酰胺和于水中的2%(W/V)N，N′-亚甲基双丙烯酰胺)，5.0ml10%(W/V)Nonidet P-40(加在水中)，13.75g尿素和3.75ml水。然后通过玻璃棉塞过滤该丙烯酰胺混合物以除去树脂。第二步，将4.23ml丙烯酰胺混合物和5%PH3-10两性电解质(50%Pharmalytes和50%Biolytes)，适当体积的溶解的蛋白质样品及去离子水(加至总体积4，98ml)相混合以制得用于各蛋白质的凝胶。除气约2分钟后，加入5.0μl新制备的10%(W/V)过硫酸铵和3.5μlN，N，N，N-四甲基乙二胺。凝胶迅速成型(0.76ml凝胶混合物/管)，用去离子水复盖，并使之聚合3小时。所有蛋白质均以13，000×g离心3分钟，然后加到凝胶混合物中。
将试管放入下方小室(阳极)含0.01M磷酸且上方小室(阴极)含脱过气的0.02M氢氧化钠的Bio-Rad 155型凝胶电泳槽内。使用350V恒定电压于室温等电聚焦18小时。等电聚焦完成后，连接充满空气的注射器/装到试管基底端的橡胶管并稍微加压以自玻璃试管内轻轻挤出凝胶。使用表面电极(Bio-Rad)检测IEF pH梯度。然后在5.0ml平衡缓冲液(2.3%十二烷基磺酸钠，5%β-巯基乙醇和10%(V/V)甘油加于0.062M Tris-Hcl中，PH6.8)将凝胶轻轻搅动10分钟，或在乙醇/干冰浴中很快冷冻并储存于-70℃下备用。
第二径向。按照Laemmli所述的方法，在加有4%丙烯酰胺堆积胶的10%凝胶(厚1.5mm，长14.5cm)上以板SDS-PAGE法分离样品。将包埋在1%琼脂糖(溶于平衡缓冲液中)中的第一径向IEF凝胶和分子量标准品使用1%琼脂糖(溶在0.125M Tris-Hcl中PH6.8)连接到堆积胶上。使用100mA/凝胶的恒定电流于室温(20-25℃)下进行电泳，直到染料跑完凝胶的大约100%长度。
固定和染色在甲醇/乙酸/水(40/10/50)中固定第二径向板凝胶内的分离的蛋白质。按标准技术用考马斯兰染色固定的凝胶，或按下述改良方法进行银染色。染色前，在3次更换的20%乙醇中将固定的凝胶最少洗1小时。按标准方法(Merril，et al.，Methods Ezymol.，104441，1984)进行染色。在恒定轻轻搅拌下使凝胶着染30-45分钟。然后在两次更换的20%乙醇中将已染色的凝胶洗总共20分钟后，进行显色。将凝胶放入乙醇/乙酸/水(20/10/70)中终止显色。使凝胶在Kodak Rapid Fixer(胶片强度)中放置2-5分钟以除去本底染色。然后用3次更换的水将凝胶洗总共30分钟，再在Kodak海波清洗剂中洗5分钟以除去凝胶中的固定剂。在3次更换的20%乙醇中洗最少1小时，以从凝胶中除去海波清洗剂。最后，于室温下在两片Bio Gel Wrap(Bio Design，Inc.，Carmel，NY)之间包裹各凝胶以干燥已染色的凝胶。
染色凝胶的照片按照制造高的说明书用Kodak电泳复制胶片制取银染色凝胶的直接印制品。该胶片显现出见于凝胶中之蛋白质的永久记录，并可借助光源盒显现出越过几个凝胶的蛋白质图形的光学匹配。在少数的情况下，使用Kodak Ektapan4×5英寸胶片对凝胶照像并印到16×20英寸Orthofilm上。所得到的印制品显示蛋白质斑点为印在干净的胶片上的大黑点。这些印制品的大版面易于检查，并因直接在印制品上得到蛋白质图形差别的精确记录而引人注目。
SCPF活性的生物检测法以增殖检测法，由CD34+细胞系(ML-1)使用[3H]-甲基胸苷([3H]Tdr)掺入来检测从SDS-PAGE凝胶(1-D或2-D)洗脱的蛋白质中是否存在SCPF(该方法是由我们实验室建立的)。另外，也可用其他CD34+细胞如KG-1a CD34+细胞(ATCC CCL 246.1)检测试验制剂的SCPF活性。
简单地说，在每小井100μl体积含有10%FBS和L-谷氨酰胺的Iscovas改良的Dulbecco氏培养基中将1×108个ML-1细胞接种于园底96小井微量滴定板的小井内。将2倍系列稀释的假定的SCPF蛋白质制剂加入(100μl/小井)一式三个小井内。然后在含5%CO2(在空气中)的湿大气环境下于37℃将培养物保温48小时。保温后，用1μCi[3H]Tdr/小井将培养物标记时间为培养的最后16-18小时。用液闪计数法定量放射性同位素掺入量。表6和7分别显示了使用KG-1a和ML1细胞进行生物分析所得到的[3H]胸苷掺入量。试验自SDS-PAGE，37KDa蛋白质分离的2倍稀释的假定SCPF(见上文)，[3H]胸苷掺入的试验结果显示制剂中存在SCPF生物活性(与对照组比较)。
使用SDS-PAGE上鉴定的37KDa蛋白质中分离的制剂进行2-D凝胶电泳。用考马斯兰染色后，在2-D凝胶上鉴定出多个SCPF异型。将凝胶切成小块并移出8个含蛋白质的凝胶片。按前述方法从这8片凝胶中洗脱蛋白质。在各凝胶片中洗脱的蛋白质上进行生物分析。[3H]胸苷的掺入与见于4号凝胶片中的异型制得的蛋白质制剂相关(表8，CPM中所示的数据)。在4号凝胶片中鉴定的SCPF异型用表面电极分析测得代表PH7.0至8.0之间的蛋白质。该级分中的生物活性证明了如在生物检测中对细胞激活素进行两倍稀释所看到的经曲稀释效应。
使用SAM.1抗体进行Western印迹分析，以进一步证实表8中鉴定的生物活性数据。将按上述方法跑两径向凝胶(PH梯度凝胶和继后的分子量凝胶)转印到硝酸纤维素或PVDF滤膜上，并使用作为第一抗体的SAM.1和作为第二抗体的碱性磷酸酶共轭的羊抗兔LgG(轻和重链)(BioRad)按标准杂交技术进行杂交。数据表明，抗体与PH范围为7.0-8.0(此范围与表现有SCPF生物活性的蛋白质相符)的蛋白质强烈反应。
可使用SAM.1或其他SCPF特异性抗体以标准的免疫亲和技术(Current Protocols in Immunology，Chapter8，Coligen，et al.，eds.，1992)将从2-D凝胶上不连续斑点得到的SCPF进行纯化为均质形式。从免疫亲和基质上洗脱SCPF，然后按上述方法进行等电聚焦，但最好在一个较窄的PH范围(PH6-8)内进行。然后可根据上述生物学检测试验将凝胶中分离的蛋白质进行SCPF生物活性筛选。
表6SCPF生物学检测KG-1a细胞μg/ml SCPF(37KDa制剂)-三份样品的平均值1 0.5 0.250 0.125 0.063CPM 120,196 118,351 73,472 41,700 39,748S.D.(+/-) 36,890 13,105 13,060 7,733 1,2810.031 0.016 0.008 0.004 0.002 对照CPM 39,052 40,874 40,586 40,530 41,852 44,884S.D.(+/-) 5,019 3,308 3,350 3,175 2,392 7,499
表7SCPF生物学检测ML-1细胞μg/ml SCPF(37KDa制剂)-三份样品的平均值1 0.5 0.250 0.125 0.063CPM 115,151 99,383 90,586 89,309 49,462S.D.(+/-) 7,737 7,332 2,702 4,593 1,6590.031 0.016 0.008 0.004 0.002 对照CPM 54,680 53,180 50,606 54,161 53,432 48,020S.D.(+/-) 5,099 4,107 1,101 1,799 1,076 4,120表8CEL级部(1-D)-对ML细胞系的SCPF生物学检测回收之蛋白质的稀释度-三份样品的平均值CPM 1:3 1:6 1:12 1:24 1:48 1:96 1:192 对照组*片1-CPM 4115 1501 6177 4891 5934 4191 4377 0片2-CPM 6853 3568 5837 5216 5306 5976 5493片3-CPM 229 4358 3427 4310 3625 5012 1313片4-CPM 13454 9386 8631 8214 8722 1600 0片5-CPM 0 884 6936 0 0 0 2353片6-CPM 1302 0 3251 1817 948 636 0片7-CPM 0 0 0 0 2606 4480 3587片8-CPM 5209 0 0 1209 0 4650 2162＊ 对照组平均CPM-45，020±4，120(S.D.)
检测与其他生长因子的协同作用以分离自人尸体脊椎体的骨髓中免疫选择ML-1 CD34+细胞。接触细胞激活素前和后用CD34-PE、CD38-FITC和Cr-PerCP着染免疫选择的CD34+细胞，在1.0ml加或不加各种细胞激活素(单一或合并的)的Dulbecco氏培养基中培养2×105个CD34+细胞(见表9和10)。培养前和培养后6天计数细胞。然后用SCPF抗体，SAM.1着染细胞并进行FACS分析。根据侧散射和PE荧光记录光栅中通过的CD34+细胞。根据向前的光散射来鉴定两个不同大小的CD34+细胞群体(大的和小的)。分析这些细胞的CD38和Dr表达。表9和10中分别给出大和小CD34+细胞群体的数据。
这些结果显示SCPF和IL-3当单独使用时能够刺激细胞进入细胞周期。SCPF和IL-3结合则具有加成效果，并可能对于增加大CD34+细胞及小CD34+细胞的总数有协同作用。
细胞系的寄存物产生SCPF的751细胞系已寄存在美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD);并给予了下列登记号细胞系751-NA-15;登记号CRL 10092本发明并不只限已叙述的特定实施方案限定的范围，这些实施方案旨在举例说明本发明的个别方面，而任何功能上等同的细胞系、DNA构建体或因子均包括于本发明范围内。事实上，除了本文所揭示并描述的内容外，根据上面所作描述和附图，对本发明所作的各种修改对于本领域技术人员来说都是显而易见的。这些修改将落入本发明待批权利要求之范围内。
权利要求
1.包含有下述特性之多肽的干细胞增殖因子(a)刺激人骨髓干细胞的增殖；(b)结合能抑制(a)之干细胞增殖作用的SAM.1抗体；以及(c)在结合和中和IL-3、GM-CSF、G-CSF或M-CSF的抗体存在下刺激人骨髓干细胞的增殖。
2.根据权利要求1的干细胞增殖因子，其中多肽是用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量为32千道尔顿的可溶性多肽。
3.根据权利要求1的干细胞增殖因子，其中多肽含有跨膜区并且用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得其分子量为37千道尔顿。
4.根据权利要求1的干细胞增殖因子，其中人骨髓干细胞表达CD34。
5.根据权利要求1的干细胞增殖因子，其由胚细胞瘤细胞系产生。
6.根据权利要求3的干细胞增殖因子，其中胚细胞瘤细胞系是神经-外胚层来源的。
7.根据权利要求4的干细胞增殖因子，其中胚细胞瘤细胞系是751-NA-15，寄存在ATCC寄存登记号为CRL 10092。
8.与权利要求1的干细胞增殖因子免疫特异结合的抗体。
9.根据权利要求8的抗体，其为单克隆抗体。
10.根据权利要求9的抗体，该抗体中和干细胞增殖因子的生物学活性。
11.根据权利要求10的抗体，其为单克隆抗体。
12.产生权利要求1之干细胞增殖因子的方法，该方法包括(a)以指导基因表达之调节性核苷酸序列的操作控制下，培养含有编码权利要求1之干细胞增殖因子的核苷酸序列的细胞，从而由该培养的细胞表达生物学活性干细胞增殖因子;以及(b)从培养物中回收生物学活性干细胞增殖因子。
13.根据权利要求12的方法，其中培养的细胞是胚细胞瘤细胞系。
14.根据权利要求13的方法，其中胚细胞瘤细胞系是神经-外胚层来源的。
15.根据权利要求14的方法，其中胚细胞瘤细胞系是在ATCC的保藏登记号为CRL 10092的751-NA-15细胞系。
16.根据权利要求12的方法，其中培养的细胞是用处于调节性核苷酸序列的操作控制下编码干细胞增殖因子的重组DNA载体转化的基因工程宿主细胞。
17.根据权利要求16的方法，其中宿主细胞是原核细胞。
18.根据权利要求16的方法，其中宿主细胞是真核细胞。
19.根据权利要求16的方法，其中重组载体还包含编码可选择性标志的核苷酸序列。
20.根据权利要求16的方法，其中干细胞增殖因子是从培养基中回收的。
21.刺激人骨髓干细胞增殖的方法，该方法包括使骨髓细胞与权利要求1的干细胞增殖因子接触。
22.根据权利要求21的方法，其中骨髓干细胞是CD34+。
23.根据权利要求21的方法，是在培养物中实际操作。
24.根据权利要求21的方法，是在体内实际操作。
25.抑制由权利要求1的干细胞增殖因子刺激的肿瘤细胞增殖的方法，包括将肿瘤细胞与能结合和中和干细胞增殖因子的抗体或抗体片段接触。
26.根据权利要求25的方法，是在培养物中实际操作。
27.根据权利要求25的方法，是在体内实际操作。
28.生产衍生于胚细胞瘤细胞系的细胞激活素的方法，所说的细胞激活素刺激人干细胞的增殖，该方法包括(a)培养含有编码细胞激活素之核苷酸序列的细胞，所说的编码序列处于指导基因表达之调节性核苷酸序列的操作控制下，以便由培养的细胞表达生物学活性细胞激活素;以及(b)从培养物中回收生物学活性细胞激活素。
29.根据权利要求28的方法，其中培养的细胞是胚细胞瘤细胞系。
30.根据权利要求28的方法，其中培养的细胞是用处于调节性核苷酸序列的操作控制下编码细胞激活素的重组DNA载体转化的基因工程化细胞。
31.包括有下列特性之多肽的干细胞增殖因子(a)刺激人干细胞的增殖;以及(b)在结合并中和权利要求1之干细胞增殖因子、IL-3、GM-CSF、G-CSF或M-CSF的活性的抗体存在下，刺激人干细胞的增殖。
32.分离的编码权利要求1之干细胞增殖因子的多核苷酸序列。
33.根据权利要求32的多核苷酸，其中多核苷酸是DNA，cDNA或RNA。
34.包含权利要求32之多核苷酸序列的生物学功能表达载体。
35.根据权利要求34的载体，其中载体是质粒。
36.根据权利要求34的载体，其中载体是病毒。
37.根据权利要求36的载体，其中病毒是RNH病毒。
38.根据权利要求37的载体，其中病毒是反转录病毒。
39.用权利要求34的载体稳定地转化的宿主细胞。
40.根据权利要求39的宿主细胞，其中宿主是原核细胞。
41.根据权利要求39的宿主细胞，其中宿主是真核细胞。
42.检测被检对象体内与干细胞增殖因子相关之疾病的方法，该方法包括使权利要求8的抗体与怀疑患有干细胞增殖因子相关疾病之被检对象的样品接触，并检测抗体的结合。
43.根据权利要求42的方法，其中疾病选自白血病、再生障碍性贫血、神经元病变、严重的复合免疫缺乏症及脾功能亢进这一组疾病。
44.根据权利要求42的方法，其中检测是体内检测。
45.根据权利要求42的方法，其中检测是体外检测。
46.根据权利要求42的方法，其中抗体是有可检标记的。
47.根据权利要求46的方法，其中可检测标志选自放射性同位素，荧光化合物，生物发光化合物，化学发光化合物及酶这一组物质。
48.根据权利要求21的方法，其中骨髓细胞进一步与细胞激活素接触。
49.根据权利要求21的方法，其中细胞激活素选自IL-3、IL-6和SCF这一组。
50.在ATCC的寄存登记号为CRL 10091的胚细胞瘤细胞系。
全文摘要
本发明涉及分离自人胚细胞瘤细胞系的自分泌生长因子，具体是涉及干细胞增殖因子(SCPF)的生产，纯化和应用。本发明的蛋白质以可溶性及细胞结合两种形式存在，其可在少数人骨髓细胞的表面上检测到并可刺激这些细胞的增殖。因此，SCPF可具有广泛的应用，包括(但不只限于)增加造血干细胞生长。此外，用抗体除去该蛋白质可用于控制肿瘤细胞生长。
文档编号C07K16/22GK1081715SQ9310521
公开日1994年2月9日 申请日期1993年4月6日 优先权日1992年4月6日
发明者M·J·P·罗曼, C·E·巴格威尔, P·D·罗曼 申请人:佛罗里达大学研究基金会有限公司