专利名称：：一种含有细胞生长因子的间充质干细胞悬液及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医学创面修复
技术领域：
，是一种可用于创面修复含有人表皮生长因子和牛碱性成纤维细胞生长因子的间充质干细胞悬液，特别是用于促进深度烧伤创面的愈合。技术背景深度烧伤包括深ii度和in度烧伤。深n度烧伤为皮肤真皮深层的损伤，深n度创面有真皮残留，网织层内存有毛囊、汗腺和皮脂腺，这些皮肤附件的上皮增殖可形成修复创面的上皮岛，虽然不需植皮创面也能自行愈合，但愈合后多遗留瘢痕，形成各种挛縮畸形。而烧伤创面愈合的时间愈长，愈合产生的瘢痕及瘢痕挛縮而导致的功能障碍和外观异常愈明显。同时对于大面积深度烧伤或皮肤缺损伤患者由于自体皮源不足，多年来运用网状植皮、邮票植皮、小皮片移植、微粒植皮等技术来扩大皮肤覆盖面积，但这些方法皮肤扩增面积有限，难以满足大面积皮肤缺损患者尽早封闭创面的需求，在加快创面愈合的速度和改进创面愈合质量，从而在减少功能障碍的发生率和提高患者生活质量方面，目前常规应用的这些方法显然还存在着很多不足。因此加速深度烧伤创面愈合和有效地控制后期瘢痕增生尤为重要，也是目前烧伤治疗的重点和难点。近年来，间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)在创伤修复方面的作用日益受到各国学者的关注。间充质干细胞具有多向分化潜能性，在体内正常循环中能够分布于多种组织和器官。国内外已有大量研究证实间充质干细胞可以分化为骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱、心肌、肝脏、神经、肾脏等多种组织细胞。体内研究也表明，烧伤、创伤、慢性溃疡等可以促使间充质干细胞向创面迁移并分化为皮肤组织细胞参与创面愈合。然而，间充质干细胞的定向分化调控需要特定的组织微环境，如相关细胞因子的参与(详见曹亮，胡祥，安伟德等.不同细胞因子体外诱导骨髓间充质干细胞定向肝细胞分化的研究.中华实验外科杂志,2006,23(7):871;马岚，李克，许煊慧等.不同细胞因子对间充质干细胞向神经细胞诱导分化的影响.中国临床康复，20059(46):1-3.)。研究证实，表皮生长因子和碱性成纤维生长因子对促进创面愈合起着至关重要的作用，但至今未见有关将间充质干细胞联合表皮生长因子和碱性成纤维生长因子外用能明显促进深度烧伤创面修复的报道。
发明内容本发明提供一种可用于创面修复的含细胞生长因子的间充质干细胞的悬液。所说的细胞生长因子为重组人表皮生长因子和重组牛碱性成纤维细胞生长因子。本发明细胞悬液的组分如下1.间充质干细胞，间充质干细胞的浓度为ixios个/毫升一1X10MV毫升；所说的间充质干细胞为人类骨髓来源的间充质干细胞或人早胚来源间充质干细胞；2.人表皮生长因子，浓度为1000IU/毫升；3.牛碱性成纤维细胞生长因子，浓度为8000IU/毫升；4.细胞的悬浮液，为无血清DMEM。本发明细胞悬液的制备方法为1.制备间充质干细胞悬液按常规分离、培养和扩增人类骨髓来源的间充质干细胞或人早胚来源间充质干细胞，培养基为含2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100吗/ml链霉素和含10%胎牛血清的DMEM。2.制备含有人表皮生长因子和牛碱性成纤维细胞生长因子的间充质干细胞悬液按常规将上述间充质干细胞悬液重悬于无血清DMEM，细胞浓度为lX105个/毫升一1X107个慮升，再加入人表皮生长因子和牛碱性成纤维细胞生长因子，人表皮生长因子浓度为1000IU/毫升，牛碱性成纤维细胞生长因子浓度为8000IU/毫升，即成本发明间充质干细胞悬液。使用时，将本发明间充质干细胞悬液或痂下注射，或创面外涂，剂量为lml/5cm2。痂下注射时，在深度烧伤创面的痂下直接注射，每天一次，共三次；创面外涂时，先将深度烧伤创面上的坏死组织去除，再涂抹细胞悬液后用外用生物敷料将创面覆盖，每天一次，共三次。动物实验表明，上述两种方法均能明显促进深度烧伤创面修复，新生皮肤不易形成水疱和破溃。本发明制备方法简单，使用方便，能明显促进深度烧伤创面修复，因而可有效控制后期瘢痕的增生。图1为免疫组化检测到的组织相关融性抗原HLA—I图。其中A:棕染的组织相关融性抗原HLA—IB:阴性对照图2为免疫荧光共聚焦检测间充质干细胞在小鼠体内分化为表皮细胞的图。其中A:红色荧光标记的角蛋白B:绿色荧光标记的组织相关融性抗原HLA—IC:镜下皮肤组织结构D:A、B、C叠加图像具体实施方式现结合实施例，对本发明作详细描述。实施例1:制备含细胞生长因子的间充质干细胞的悬液1.制备细胞悬液按常规分离、培养和扩增人类骨髓来源的间充质干细胞或人早胚来源间充质干细胞(详见周敦华,黄绍良,吴燕峰等.人间充质干细胞体外扩增及生物学特性的研究.中华儿科杂志，2003，41(8》608-610.)制备成单个间充质干细胞悬液，按2Xl(^个/ml细胞密度接种于培养瓶中，置于37"C培养箱中以完全型DMEM培养液进行培养，当细胞达70%—80%融合时进行传代、扩增。培养基为含2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素、10(^g/ml链霉素和含10X胎牛血清的DMEM(均为美国Gibco产品)。2.制备含有人表皮生长因子和牛碱性成纤维细胞生长因子的间充质干细胞悬液按常规将上述制备的细胞悬液重悬于无血清DMEM，细胞浓度为分别为lX10MV毫升、1乂106个/毫升、1Xl(^个/毫升，再加入人表皮生长因子和牛碱性成纤维细胞生长因子，人表皮生长因子浓度为1000IU/毫升，牛碱性成纤维细胞生长因子浓度为8000IU/毫升。动物实验间充质干细胞促进深度创面修复实验1.动物分组取C57小鼠48只，购自上海动物实验中心，SPF级。雄性，体重1823g,8~10周龄。随机分成8组，每组6只。(1)人间充质干细胞痂下注射组无血清DMEM中含人间充质干细胞，浓度为lXl()6个/毫升，剂量为lml/5cm2创面。(2)人间充质干细胞创面涂抹组无血清DMEM中含人间充质干细胞，浓度为lXl()6个/毫升，剂量为lml/5cm2创面。(3)本发明细胞悬液痂下注射组无血清DMEM中含人间充质干细胞、重组人表皮生长因子和重组牛碱性成纤维细胞生长因子，细胞浓度为lX106个/毫升，人表皮生长因子浓度为1000IU/毫升，牛碱性成纤维细胞生长因子浓度为8000IU/毫升，剂量为lml/5cm2创面。(4)本发明细胞悬液创面涂抹组无血清DMEM中含人间充质干细胞、重组人表皮生长因子和重组牛碱性成纤维细胞生长因子，细胞浓度为lX106个/毫升，人表皮生长因子浓度为1000IU/毫升，牛碱性成纤维细胞生长因子浓度为8000IU/毫升，剂量为lml/5cn^创面。(5)重组人表皮生长因子和重组牛碱性成纤维细胞生长因子痂下注射组无血清DMEM中含重组人表皮生长因子和重组牛碱性成纤维细胞生长因子，人表皮生长因子浓度为1000IU/毫升，牛碱性成纤维细胞生长因子浓度为8000IU/毫升，剂量为lml/5cn^创面。(6)重组人表皮生长因子和重组牛碱性成纤维细胞生长因子创面涂抹组无血清DMEM中含重组人表皮生长因子和重组牛碱性成纤维细胞生长因子，人表皮生长因子浓度为1000IU/毫升，牛碱性成纤维细胞生长因子浓度为8000IU/毫升，剂量为lml/5cn^创面。(7)空白对照痂下注射组等量无血清DMEM。(8)空白对照创面涂抹组等量无血清DMEM。2.深度烧伤动物模型的制作将C57小鼠背部消毒，置90。C沸水中烫10秒，在小鼠背部制成1.3X1.3cm2的深度烧伤创面。3.给药以上各注射组，分别用lml注射器抽取注射液，按lml/5cm^l」量注入小鼠背部创面痂下，每天一次，共三次。SPF级条件下喂养、每日观察。以上各创面涂抹组，清除创面坏死组织后分别按lm1/50112剂量涂抹药液，每天一次，共三次，SPF级条件下喂养、每日观察。4.结果观察(1)创面愈合时间观察每日观察各组小鼠创面愈合情况，记录创面完全<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由表1可见，虽然组1、组2的间充质干细胞或组5、组6的重组人表皮生长因子和重组牛碱性成纤维细胞生长因子与空白对照相比能明显:':促进创面愈合，但组3、组4创面愈合时间最短，说明间充质干细胞联合重组人表皮生长因子和重组牛碱性成纤维细胞生长因子，相互有协同作用，能更有效地促进创面愈合。(2)愈合创面组织学观察a)制备石蜡切片取材取第3、4组小鼠创面愈合处全层皮肤lXlcm2固定4%多聚甲醛固定皮肤组织18-24小时脱水、透明、包埋梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋切片4微米连续石蜡切片b)免疫组化方法如下58"C烤片过夜后经两次二甲苯将切片上的石蜡脱净，后经无水酒精及各级酒精下行至水。后PBS洗3次每次5分钟。加100微升4。/。BSA(Sigma公司)封闭过夜。PBS洗5分钟后加50微升一抗，一抗为小鼠抗人单克隆抗体HLA—I(Sigma公司)，4"C孵育过夜。PBS洗3次每次5分钟，加50微升二抗，二抗为山羊抗小鼠IgG(华美生物工程有限公司产品)37"C孵育60分钟。PBS洗后DAB(博士德公司)显色。显微镜下观察发现间充质干细胞悬液外用处的皮肤，检测到大量的组织相关融性抗原HLA—I(见图l)，图1中，A可见表皮层有大量HLA—I阳性的棕色深染细胞；B为阴性对照。实验结果表明人间充质干细胞在小鼠体内参与深度烧伤创面修复。c)免疫荧光组化法方法同上，其中一抗为小鼠抗人单克隆抗体HLA一I(Sigma公司)和兔抗鼠多克隆抗体角蛋白(北京中山生物技术有限公司)。二抗为FITC标记的山羊抗小鼠IgG(华美生物工程有限公司产品)和TOTC标记的山羊抗兔IgG(北京中山生物技术有限公司)。二抗洗净后直接用免疫荧光共聚焦显微镜观察，检测组织相关融性抗原HLA—I和角蛋白的表达水平。结果人胚源性间充质干细胞悬液外用处的皮肤，检测到大量的组织相关融性抗原HLA—I和角蛋白，两者的表达有重叠(见图2)。图2中，A可见表皮层角蛋白表达阳性，呈红色荧光;B可见表皮层有大量HLA—I表达阳性细胞，呈绿色荧光；C为镜下皮肤组织结构；D为A、B、C叠加后的图像。实验结果表明人间充质干细胞在小鼠体内可以分化为表皮细胞、参与深度烧伤创面修复。上述实验结果表明，本发明含有人表皮生长因子和牛碱性成纤维细胞生长因子的间充质干细胞悬液能有效促进深度烧伤创面修复，因而可用于制备创面修复药物。权利要求1.一种含有细胞生长因子的间充质干细胞悬液，细胞悬液的组分如下1)间充质干细胞，间充质干细胞的浓度为1×105个/毫升-1×107个/毫升；所说的间充质干细胞为人类骨髓来源的间充质干细胞或人早胚来源间充质干细胞；2)人表皮生长因子，浓度为1000IU/毫升；3)牛碱性成纤维细胞生长因子，浓度为8000IU/毫升；4)细胞的悬浮液，为无血清DMEM。2.权利要求l所述的间充质干细胞悬液在制备创面修复药物中的应用。全文摘要本发明涉及医学创面修复
技术领域：
，是一种可用于创面修复含有人表皮生长因子和牛碱性成纤维细胞生长因子的间充质干细胞悬液，特别是用于促进深度烧伤创面的愈合。间充质干细胞为人类骨髓来源的间充质干细胞或人早胚来源的间充质干细胞。使用时将本细胞悬液直接痂下注射或涂抹于去除坏死组织后的创面上。动物实验表明，能明显促进深度烧伤创面修复，新生皮肤不易形成水疱和破溃。本发明制备方法简单，使用方便，能明显促进深度烧伤创面修复，因而可有效控制后期瘢痕的增生。文档编号A61P17/02GK101327318SQ200810040558公开日2008年12月24日申请日期2008年7月15日优先权日2008年7月15日发明者唐洪泰,夏照帆,杨晓妍,钰王,肖仕初申请人:中国人民解放军第二军医大学