专利名称：神经元性组织工程化周围神经的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物组织工程技术领域，具体涉及一种新型的修复长距 离周围神经缺损的神经元性组织工程化周围神经的制备方法。
背景技术：
周围神经再生的基本生物学特性为周围神经损伤后，远端神经发 生瓦勒变性，近端轴突发出的轴芽在间充质细胞的间隙向前滑行，长到 远端的Biingner带中，并向耙器官生长形成突触连接；施万细胞使轴突 髓鞘化；恢复神经结构，完成神经再生的过程。
目前，国内外多以雪旺细胞(Schwann cell， SC)、神经干细胞(neural stem cell, NSC )、骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)为种 子，体外或在体诱导分化为SC，构建组织工程化周围神经神经。这种组 织工程化神经为损伤神经的再生提供通道和促进再生的因子，恢复神经 的结构，但其桥接距离一般不超过30mm，不能满足临床上长段神经缺损 修复的需求。轴突再生需跨越两个吻合口，增加了神经再生的难度；另 外，轴突外生及在生长过程中的误入，易出现效应器的废用性萎縮或神 经-效应器失配。这些问题目前难以解决。
本申请人在2007年4月18日递交的专利申请号为200710039573.5， 发明名称为"组织工程化周围神经移植体及其制备方法"的中国发明专 利申请基础上进一步改进与完善。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能满足临床上长段神经缺损修复的需 求，且神经再生后能较好恢复神经功能的以神经元为种子细胞的组织工 程化周围神经的制备方法。
为克服目前组织工程神经存在的问题，本发明的组织工程化周围神 经的制备方法，所选用的种子细胞是以毛囊神经嵴干细胞(NCSC)诱导分化的神经元样细胞和类施万细胞的混合细胞，且神经元样细胞和类施
万细胞的比例是1:1;所选用的支架是异种去细胞神经基膜管。 一种组织工程化周围神经的制备方法，它包括以下步骤
A) 毛囊神经嵴干细胞的获得、培养和鉴定；
B) 毛囊神经嵴干细胞加入2000nmol/L维甲酸和500ng/mL音猥因子激动 剂(Sonic hedgehog)，作用7天诱导分化成神经元样细胞；毛囊神经嵴 干细胞加入125ng/ml内皮素-l (neuregulin-1)，作用7天诱导分化成类 施万细胞；
免疫细胞化学鉴定诱导后的神经元样细胞呈Tubulin P III阳性， 类施万细胞呈S100阳性；
C) 异种去细胞神经基膜管支架的制备；
优选的，采用1%溶血卵磷脂制备犬脱细胞神经支架，参见DumontCE 等，Transplantation, 1997,63:1210-1215，冻干并Co60照射灭菌后，备 用；
D) 体外构建组织工程化周围神经将步骤B诱导的神经元样细胞和类施 万细胞悬液按l:l混合，制备细胞悬液，细胞密度为1.5X107ml，用微 量注射器抽取细胞悬液，将微量注射器沿纵轴伸入异种去细胞神经基膜 管支架中，每隔5mm注射等体积的细胞悬液，构建组织工程化周围神经。
上述毛囊NCSC可以从成体SD大鼠触须垫毛囊隆突区获取毛囊神经 嵴干细胞(NCSC)，参见Sieber-Blum等，Developmental Dynamics, 2004， 231:258-269.，采用贴块法于神经干细胞培养液中培养，传代获得毛囊 NCSC，免疫荧光细胞化学检测毛囊NCSC呈Nestin阳性和SoxlO阳性； 毛囊NCSC也可来源于自身，取材时对个体损伤小，可实现自体移植，不 涉及免疫排斥反应和伦理道德问题；此外毛囊NCSC还具有成体干细胞和 胚胎干细胞的特性，具有自我更新能力，具备多分化潜能，可分化为神 经元、胶质细胞、平滑肌细胞、黑素细胞等，在特定的培养条件下，神 经细胞的分化率可达90%以上。
本发明制备得到组织工程化周围神经可避免再生轴突外生及生长过 程的误入，縮短了再生神经纤维到达效应器的时间，避免了效应器的蒌縮，不仅能满足临床上长段神经缺损修复的需求，而且神经再生后能较 好恢复神经功能。
图1是本发明制备的神经元性组织工程化周围神经的功能恢复评估结果 其中A:空支架组；B:组织工程化周围神经组；
C本发明制备的神经元性组织工程化周围神经组 图2是采用HRP逆行示踪技术对移植体中细胞表达分子的检测结果
其中A:生理盐水组；B: HRP示踪组(箭头示TMB染色阳性细胞)； C:移植体中突触素的阳性表达(箭头示阳性细胞)
图3是免疫荧光组织化学检测结果，第一行和第二行分别是术后2周、4 周时移植体中植入细胞Tujl的表达
具体实施例方式
现结合附图和实施例，对本发明作进一步的描述，但本发明的实施 并不仅限于此。
实施例1:
1.制备成体毛囊神经嵴干细胞(NCSC) (1)毛囊NCSC的原代培养
清洁级SD大鼠，体重100g，颈椎脱臼处死。75%乙醇消毒，取大鼠 触须垫毛囊，室温、显微镜下、无菌条件下取完整毛囊置于4°C DPBS中， 剪去毛囊球部，剥除毛囊外层结缔组织囊，暴露毛囊隆突部(保留毛干 lmm，便于贴块操作)，以4°C DPBS清洗2遍，备用。每22mm培养板 均匀涂布鼠尾胶(lmg/ml， Sigma) 3(^1，室温干燥lh以上，置于37"C、 5% C02培养箱中以原代培养液孵育3h备用。每22mm培养皿种植4个 毛囊隆突，于37匸、5MC02培养箱中静置lh后，再缓慢加入原代培养 液[DMEM/F12 (1: 1， GIBCO) ; B27 (2%, GIBCO) ; N2 (1%， GIBCO) ; ITS+3 (insulin, transferrin, selenium, and three essential fatty acids， Sigma) ; bFGF (20ng/ml， Invitrogen) ， EGF (20ng/ml， Invi加gen); L-谷氨酰胺(200mmol/L);胎牛血清(10%, GIBCO)]，静置培养4 6 天后传代培养。(2)毛囊NCSC的传代培养
0.25%胰酶消化2min，以显微镊夹除毛囊隆突，吸出胰酶加入等体 积含10%血清培养基终止消化，每22mm皿加入lml培养液(不含胎牛 血清，其余成分同原代培养液)，以吸管吹打制备单细胞悬液，细胞密 度为lxl0Vml。 37°C、 5%0)2培养箱中静置培养，每两天换半液。
免疫荧光细胞化学检测毛囊NCSC呈Nestin阳性和SoxlO阳性，参 见Kuhlbrodt et al，1998; Rehberg et al, 2002; Lendahl et al， 1990; Josephson et al, 1998。
2. 成体毛囊NCSC的诱导分化
(1) 向神经元样细胞的诱导分化
取第2代毛囊NCSC，加入2000nmol/L维甲酸RA (Sigma)和 500ng/mL音猥因子激动剂Sonic hedgehog (Shh， R&D.)，作用时间为 7d。培养液配方DMEM/F12 (1: 1， GIBCO) ; B27 (2°/。， GIBCO); N2 (1%， GIBCO) ; ITS+3 (insulin, transferrin, selenium, and three essential fatty acids, Sigma) ; bFGF (20ng/ml， Invitrogen) ， EGF (20ng/ml， Invitrogen) ; L-谷氨酰胺(200mmol/L))
(2) 向类施万细胞的诱导分化
取第2代毛囊NCSC，以125ng/ml neuregulin-1 (NRGl， Sigma) 诱导分化，作用时间为7d。培养液配方同上。
之后进行神经元样细胞和类施万细胞的鉴定。免疫细胞化学鉴定诱 导后的神经元样细胞呈Tubulin P III阳性，类施万细胞呈S100阳性。 具体方法为吸出培养液，0.01M的PBS充分洗涤3次；4%的多聚甲醛固 定，室温，20分钟；0.01M的PBS充分洗涤3次；马血清(1: 10) 37°C 孵育30min; Tubulin卩III (1:50，单克隆鼠抗，R&D)、 S100 (1:500，单 克隆兔抗，Dako)，室温，2.5h; FITC-IgG(l:200，山羊抗兔，Sigma)、 TRITC-IgG(1:200，山羊抗鼠，Sigma) 37°C， 30min; 0. 01M的PBS充分 洗涤3次；荧光显微镜观察，拍照。
3. 异种去细胞神经基膜管支架的制备及修饰
无菌条件下取犬坐骨神经，CMF-PBS (pH7.3) 4。C， 5d， 1%溶血卵 磷脂/0.1mol/LPBS (pH7.0)，室温，4d，每隔24h换液l次，最后两次换液时加入10mM的CaCl2溶液；CMF-PBS洗30min， DNase I (600U/ml) 、 RNaseA (10U/ml) ， 37°C， 24h， CMF-PBS洗3次，每
根长约4cm置于离心管中，低压冻干，Co60照射灭菌，-2(TC保存备用。 4.体外构建组织工程化周围神经
将上述诱导的神经元细胞和类施万细胞消化后按l: l比例混合，制 备细胞悬液，细胞密度为1.5xl06/ml，在手术显微镜下，用的微量 注射器抽取细胞悬液，将微量注射器沿纵轴伸入支架中，每隔5mm注射 等体积的细胞悬液，这样长4cm的支架共有8个注射点，可以保证细胞 悬液在支架内的均匀分布。用毛囊NCSC原代培养基(含1%青链霉素双 抗)37°C、 5。/。C02培养箱静置培养。
rAAV2/EGFP转染诱导后的细胞以标记细胞，采用上述条件构建神 经元性组织工程化周围神经，取构建好的组织工程化周围神经直接进行 体内移植以修复SD大鼠坐骨神经缺损。 实施例2:
1. 组织工程化周围神经移植体修复SD大鼠坐骨神经缺损
切除成年雄性SD大鼠一侧坐骨神经10mm，两断端距离维持40 mm， 用显微外科技术将神经移植体套接坐骨神经断端；另一侧不做手术。动 物存活2、 4、 32、 48周。
动物分组如下本发明制备的神经元性组织工程化周围神经组(毛 囊NCSC诱导分化的神经元样细胞和类施万细胞分别按1:1比例植入)、 组织工程神经移植组(仅植入毛囊NCSC)、犬去细胞神经基膜管支架移 植组。每组5只动物。
2. 功能恢复的评估
手术2、 4、 32、 48周后颈椎脱臼处死动物，分离出移植体及其两端 所连的近远段坐骨神经，仔细剔除神经周围的肌肉等组织，将移植体及 相连坐骨神经至于神经屏蔽盒电极上，给予适宜刺激，记录动作电位幅 度及其时间间隔。本发明制备的神经元性组织工程化周围神经组的动作 电位幅度高于组织工程化周围神经移植组和空支架移植组，见图l，图l 中A:空支架组；B:组织工程化周围神经组；C本发明制备的神经元性 组织工程化周围神经组。3.移植体中细胞表达分子的检测 (l)取术后各时相点动物，暴露移植侧坐骨神经，在其远端处做横断处理， 用微量注射器注射5|al 30%HRP进行逆行示踪，术后48h灌注固定处死动 物，取材，行30pm冰冻切片，进行TMB法染色，以示踪移植体中植入 的神经元细胞。设立注射生理盐水为对照组，以排除细胞内源性过氧化 物酶产生的假阳性；设立正常坐骨神经组，以排除胶质细胞吸收HRP造 成的假阳性。HRP逆行示踪技术在术后2、 4、 32、 48周时分别检测到植 入神经元的存在，并有功能性物质突触素的表达，见图2，图2中A:
生理盐水组；B: HRP示踪组(箭头示TMB染色阳性细胞)；C:移植
体中突触素的阳性表达(箭头示阳性细胞)。
(2)免疫荧光组织化学检测
术后灌注固定取材，石蜡包埋，切片(5pm)，行免疫荧光多标技 术并进行激光共聚焦观察。检测分子为NF-200 (1:100，单克隆鼠抗， Jackson) 、 Synapsinl (1:200, 单克隆兔抗，Sigma) 。 2、 4周时可观察 到植入的细胞呈绿色荧光，32、 48周时植入细胞呈较弱的绿色荧光，这 与植入细胞在体内时间太长，EGFP不表达有关，见图3。神经电生理检 测表明本发明制备的神经元性组织工程化周围神经传导速度明显低于空 支架合组织工程化周围神经的传导速度，提示突触延搁的存在，详见表1。
表1:移植体中神经电生理检测结果
组别 电极间距 动作电位上 刺激强度 传导速度
、相幅度时间 (V) (m/s) (cm) 、
间隔(ms)
空支架组1 0.32 2.0 31.25
1: 1组 1 0.40 2.5 25.00
NCSC组 1 0.32 2.0 31.25研究发现，诱导性组织工程神经移植组的功能恢复优于组织工程化
周围神经移植组和空支架移植组。HRP逆行示踪技术在术后2、 4、 32、 48周时分别检测到植入神经元的存在，并有功能性物质突触素的表达； 免疫荧光组织化学检测结果表明2、 4、 32、 48周时神经元细胞数量依次 增多；神经电生理检测表明诱导性组织工程神经传导速度明显低于空支 架合组织工程化周围神经的传导速度，提示突触延搁的存在。以上结论 初步证实植入的神经元可以在体内存活，用桥接神经元的办法构建组织 工程神经能够修复长距离神经缺损。
权利要求
1、一种组织工程化周围神经的制备方法，所选用的种子细胞是以毛囊神经嵴干细胞(NCSC)诱导分化的神经元样细胞和类施万细胞的混合细胞，且神经元样细胞和类施万细胞的比例是1∶1；所选用的支架是异种去细胞神经基膜管，该方法包括以下步骤A)毛囊神经嵴干细胞的获得、培养和鉴定；B)毛囊神经嵴干细胞加入2000nmol/L维甲酸和500ng/mL音猥因子激动剂，作用7天诱导分化成神经元样细胞；毛囊神经嵴干细胞加入125ng/ml内皮素-1，作用7天诱导分化成类施万细胞；免疫细胞化学鉴定诱导后的神经元样细胞呈TubulinβIII阳性，类施万细胞呈S100阳性；C)异种去细胞神经基膜管支架的制备；D)体外构建组织工程化周围神经将步骤B诱导的神经元样细胞和类施万细胞悬液按1∶1混合，制备细胞悬液，细胞密度为1.5×106/ml，用微量注射器抽取细胞悬液，将微量注射器沿纵轴伸入异种去细胞神经基膜管支架中，每隔5mm注射等体积的细胞悬液，构建组织工程化周围神经。
2、 根据权利要求l所述的一种组织工程化周围神经的制备方法，其特征 在于步骤A中毛囊神经嵴干细胞是从成体SD大鼠触须垫毛囊隆突区获取 的，采用贴块法于神经干细胞培养液中培养，传代获得毛囊NCSC，免疫 荧光细胞化学检测毛囊NCSC呈Nestin阳性和SoxlO阳性。
3、 根据权利要求l所述的一种组织工程化周围神经的制备方法，其特征 在于步骤C采用1%溶血卵磷脂制备犬脱细胞神经支架，冻干并Co60照射 灭菌后，备用。
全文摘要
本发明涉及生物组织工程技术领域，目前构建的组织工程化周围神经神经其桥接距离一般不超过30mm，不能满足临床上长段神经缺损修复的需求，且再生后功能恢复不佳。本发明的神经元性组织工程化周围神经的制备方法，选用以毛囊神经嵴干细胞以特定条件诱导分化的神经元样细胞和类施万细胞的混合细胞作为种子细胞，按1∶1的比例移入异种去细胞神经基膜管支架中构建。本发明制备得到的组织工程化周围神经可避免再生轴突外生及生长过程的误入，缩短了再生神经纤维到达效应器的时间，避免了效应器的萎缩，不仅能满足临床上长段神经缺损修复的需求，而且神经再生后能较好恢复神经功能。
文档编号A61L27/00GK101318031SQ200810040559
公开日2008年12月10日 申请日期2008年7月15日 优先权日2008年7月15日
发明者芳 刘, 喜 张, 张传森, 张志英, 杨向群, 藺海燕, 许家军 申请人:中国人民解放军第二军医大学