专利名称：一种血管内皮生长因子单克隆抗体Avastin壳聚糖纳米粒制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，是一种血管内皮生长因子VEGF的单克隆抗体 Avastin的纳米粒制剂。
背景技术：
脉络膜新生血管和视网膜新生血管分别是年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)和增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy, PDR)等难治性眼底病最具特征和危害最大的病理改变，也是致盲的 重要原因，至今没有好的治疗方法，药物治疗更是几近空白。脉络膜和视网膜新 生血管的形成机制复杂，近年来国内外的多项研究表明其发生发展主要与缺氧、 血管内皮生长因子(VEGF)表达水平增高诱发新生血管有关，且VEGF含量与其 病理过程密切相关；以VEGF为治疗靶点，玻璃体腔注射VEGF的单克隆抗体 (Avastin)能有效抑制脉络膜和视网膜新生血管的生成。但治疗时需进行多次玻 璃体腔注射，这是一种侵入性治疗方法，不仅操作不便，给患者带来痛苦，而且 治疗费用也较昂贵，特别是需要反复多次注射，有引起眼内容炎等的风险，因此 不是理想的给药方式。开发安全有效的眼部抗新生血管生成的新制剂，对眼部新 生血管性病变的治疗具有十分重要的意义。
由高分子材料制备的纳米粒载体对所包载的蛋白类药物具有靶向和保护作 用，能抵御内环境酶、pH等因素的影响，还有缓释作用，提高生物利用度，可 以减少给药次数。壳聚糖(Chitson, CS)是自然界来源第二大丰富的亲水性多糖， 其良好的生物相容性、无毒和可生物降解特性，赋予其广阔的医药应用前景。但 至今未见有关将Avastin制备成壳聚糖纳米粒制剂的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种血管内皮生长因子单克隆抗体Avastin壳聚糖纳 米粒制剂，可用于玻璃体注射或进一步制成滴眼液，治疗AMD、 PDR等眼部新生血管性病变。
由于壳聚糖可打开上皮细胞的紧密连接，以该材料制备成纳米粒，除有耙向 性和缓释作用外，亦具有良好的穿透性，可穿越黏膜和上皮细胞等形态学屏障，
将包载的单克隆抗体Avastin运送至眼内，因此可抑制眼内新生血管形成。
本发明采用离子胶联法制备Avastin壳聚糖纳米粒制剂。步骤如下
1) 制备壳聚糖溶液将一定量的壳聚糖溶解于稀醋酸，壳聚糖溶液的浓度 为0.1% 10% (w/v);
2) 制备胶联剂溶液以蒸馏水为溶剂，将胶联剂溶解于蒸馏水，所用胶联 剂为多聚磷酸钠，胶联剂溶液的浓度为0.1% 5% (W/V);
3) 制备Avastin溶液将适量Avastin原液分散于上述2)制备的胶联剂溶 液中或l)制备的壳聚糖溶液中，Avastin溶液的浓度为mg/ml lg/ml;
4) 制备Avastin壳聚糖纳米粒:将上述2)制备的胶联剂溶液缓慢滴加于3) 制备的Avastin壳柬糖溶液，或将上述1)制备的壳聚糖溶液缓慢滴加 于3)制备的Avastin胶联剂溶液，在滴加过程中持续搅拌，反应8 15 分钟，即得Avastin的壳聚糖纳米粒溶液；
5) Avastin壳聚糖纳米粒的匀化将4)中所得的Avastin壳聚糖纳米粒溶 液放入高压乳匀机，在100 1000Bar压力下进行匀化，经检测，本发 明制备的Avastin壳聚糖纳米粒外观形态较为圆整，粒径在100nm以下， 平均粒径为80 90nm。
本发明制备的Avastin纳米粒制剂可制成注射剂通过玻璃体腔注射，由于纳 米粒制剂具有缓释作用，可减少给药次数，从而降低治疗风险、减轻患者痛苦。 也可进一步制成滴眼剂，使用更为方便、安全，患者无痛苦，费用低，便于推广 应用。
本发明制备方法快速简便、成本低廉、可重复性好，还可用于其他蛋白类药 物的壳聚糖纳米粒的制备。
图1为本发明Avastin壳聚糖纳米粒的透射电镜图(X20, 000)。图2为本发明Avastin壳聚糖纳米粒的粒径分布曲线图。
具体实施方式
实施例1.制备Avastin壳聚糖纳米粒
取壳聚糖200mg，溶于100mL 0.5%的稀醋酸中，得0.2%的壳聚糖溶液； 以蒸馏水配制0.2%的多聚磷酸钠溶液，并向其中加入Avastin原液，Avastin的 浓度为25mg/ml。在以600转/分钟速度持续搅拌下，将含Avastin的多聚磷酸钠 溶液缓慢滴加于壳聚糖溶液中，滴毕，持续搅拌下反应10分钟，即得Avastin 的壳聚糖纳米粒。将上述纳米粒混悬液经高压乳匀机，在660Bar压力下进行1 个循环的匀化，得Avastin壳聚糖纳米粒。在透射电镜下观察，纳米粒外观形态 较为圆整，分散度较好(图1)，用BECKMANC0ULTERN4PLUS激光粒度仪检 测粒径，粒径分布范围在80-90nm (图2)，平均粒径为88.9nm。 实施例2.制备Avastin壳聚糖纳米粒
壳聚糖用量为300mg，多聚磷酸钠溶液的浓度为0.5%，其余同实施例l。
平均粒径为156.8nm。 实施例3.制备Avastin壳聚糖纳米粒
壳聚糖用量为100mg，多聚磷酸钠溶液的浓度为0.2%，其余同实施例l。
平均粒径为127.5nm。 实施例4.制备Avastin壳聚糖纳米粒
壳聚糖用量为100mg，多聚磷酸钠溶液的浓度为0.1%,其余同实施例1。
平均粒径为167.6nm。 实施例5.制备Avastin壳聚糖纳米粒
多聚磷酸钠溶液的浓度为0.1%。 Avastin原液加入壳聚糖溶液中，然后以多 聚磷酸钠溶液进行胶联，其余同实施例l。平均粒径为238.9nm。
动物实验
(一)SD大鼠实验性糖尿病视网膜新生血管模型的建立
1)动物准备选20周龄的SD大鼠35只(购于第二军医大学实验动物中心)， 雌雄不限，体重150-180克。静脉注射链脲佐菌素(Streptozotocin， STZ)建立大鼠糖尿病视网膜新生血管模型。注射后在标准化饲养室常规饲养。 (二 ) Avastin纳米粒玻璃体腔内注射药效学观察
1、 Avastin -CS-NPs的体内治疗
实验分组注射40周后SD大鼠视网膜可见增殖性改变。实验期间所有SD 大鼠生长状态良好，均未经胰岛素治疗。将成模SD大鼠随机分成8组，每组5 只。8组分别为
Avastin-CS-NPs组注射Avastin -CS-NPs水溶液(25mg/ml);
注射Avastin-CS-NPs水溶液(10mg/ml); 注射Avastin-CS-NPs水溶液(5mg/ml); 单纯Avastin组注射单纯Avastin溶液(25mg/ml);
注射单纯Avastin溶液(1 Omg/ml); 注射单纯Avastin溶液(5mg/ml); VEGI组注射单纯VEGI溶液； 空白CS组注射与上六组等量的CS溶液。
2、 在玻璃体腔注射组分别将实施例1制得的Avastin-壳聚糖纳米粒制剂 (25mg/ml、 10mg/ml、 5mg/ml)、未作纳米包裹的药物Avastin(25mg/ml、 10mg/ml、
5mg/ml)及空白纳米粒注射入各组SD大鼠的玻璃体内。设空白壳聚糖组为阴性 对照组，VEGI组为阳性对照组。
注射方法实验采用单盲法，即动物实验人员预先不知道每组动物的具体治 疗药物，给药途径为直接玻璃体腔内注射，给药剂量均为O.lml， 1/日，隔两周 注药l次，共治疗12周。PBS对照组给药时刻同其他各组，每次玻璃体腔内注
射与上三组等量的PBS水溶液。测量从第一次注药起，记为Od。
3、 疗效观察每日观察SD大鼠的生活状态，各组大鼠开始治疗后分别于
注药前后的不同时段(0、 2w、 4w、 8w、 12w)用眼底照相机、FFA技术动态追 踪SD大鼠视网膜新生血管生成、消退的形态学改变并对病情变化做初步判断。
4、 组织标本取材在给药后不同时段取出SD大鼠的眼球和视网膜，置10% 福尔马林溶液中进行形态学观察(HE染色)、免疫组化VEGF/CD34染色显示微 血管密度。通过组织病理检查、电镜、免疫组化和荧光RT-PCR等方法和技术对 微血管密度(MVD)、 VEGF mRNA表达水平、循环血管内皮细胞(CECs)及 其祖细胞(CEPs)进行检测，对视网膜新生血管进行定量、定性的观察和评价，并与对照组做疗效对比分析。
(三) Avastin眼表局部给药药效学观察
1. 在眼表局部给药组，将实施例1制得的Avastin—壳聚糖纳米粒制剂制成 2%的滴眼液剂型，并用玫瑰精荧光标记后滴入各组SD大鼠结膜囊内。
2. 在给药前后的不同时段用眼底照相机、FFA技术动态追踪SD大鼠视网膜 新生血管生成情况及病情变化。
3. 在不同时段取出SD大鼠的服球和视网膜，用组织病理检査、电镜、免疫 组化和荧光RT-PCR等方法和技术对微血管密度(MVD)、 VEGFmRNA表达水 平、循环血管内皮细胞及(CECs)及其祖细胞(CEPs)进行检测，观察和评价 视网膜新生血管量，并与对照组做疗效对比分析。
(四) 数据统计处理各组数据描述均以均数士标准差(又土s),重复测量数据 应用SPSS13.0统计软件处理，进行多元方差分析、组间t检验，检验水准a二0.05。
(五) 结果各组大鼠在实验期间生存状态良好；各组大鼠视网膜病理染色示网 膜厚度均较治疗前明显变薄；VEGF/CD34染色、MVD计数示微血管密度较治 疗前明显减少；VEGFmRNA表达水平、CECs及CEPs检测示其表达水平降低， 各组间差异显著，其中纳米粒组均较未做纳米包裹的各组疗效显著，具有明显的 缓释作用。
实验结果说明Avastin-壳聚糖纳米粒制剂可有效抑制眼部新生血管的形 成，具有明显的缓释作用。
权利要求
1.一种血管内皮生长因子单克隆抗体Avastin壳聚糖纳米粒制剂的制备方法，步骤如下1)制备壳聚糖溶液将一定量的壳聚糖溶解于稀醋酸，壳聚糖溶液的浓度为0.1％～10％(w/v)；2)制备胶联剂溶液以蒸馏水为溶剂，将胶联剂多聚磷酸钠溶解于蒸馏水，胶联剂溶液的浓度为0.1％～5％(w/v)；3)制备Avastin溶液将适量Avastin原液分散于上述2)制备的胶联剂溶液中或1)制备的壳聚糖溶液中，Avastin溶液的浓度为0.1μg/ml～1g/ml；4)制备Avastin壳聚糖纳米粒将上述2)制备的胶联剂溶液缓慢滴加于3)制备的Avastin壳聚糖溶液，或将上述1)制备的壳聚糖溶液缓慢滴加于3)制备的Avastin胶联剂溶液，滴加过程中持续搅拌，反应8～15分钟，即得Avastin的壳聚糖纳米粒溶液；5)Avastin壳聚糖纳米粒的匀化将4)中所得的Avastin壳聚糖纳米粒溶液按常规放入高压乳匀机，在100～1000Bar压力下进行匀化，即为Avastin壳聚糖纳米粒制剂。
2. 按权利要求1所述的制备方法，其特征在于制备Avastin壳聚糖纳米粒时， 反应时间为10分钟，多聚磷酸钠浓度为0.2%。
3. 权利要求1所述制备方法制得的Avastin壳聚糖纳米粒制剂。
4. 权利要求3所述Avastin壳聚糖纳米粒制剂在制备抗新生血管生成药物中 的应用。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，是一种血管内皮生长因子VEGF的单克隆抗体Avastin的纳米粒制剂。制备方法为将一定量的壳聚糖溶于稀醋酸制备壳聚糖溶液；将胶联剂多聚磷酸钠溶解于蒸馏水制备胶联剂溶液；将适量Avastin原液分散于胶联剂溶液或壳聚糖溶液制备Avastin溶液；持续搅拌下将Avastin溶液缓慢滴加于胶联剂溶液或壳聚糖溶液制备Avastin壳聚糖纳米粒；用高压乳匀机进行匀化即可。本发明制备方法快速简便、成本低廉、可重复性好，制得的Avastin壳聚糖纳米粒制剂制成注射剂通过玻璃体腔注射，由于纳米粒制剂具有缓释作用，可减少给药次数，从而可降低风险、减轻患者痛苦。本发明纳米粒制剂还可进一步制成滴眼剂，使用方便、安全、费用低，患者无痛苦，便于推广应用。
文档编号A61K9/16GK101623268SQ20081004031
公开日2010年1月13日 申请日期2008年7月8日 优先权日2008年7月8日
发明者刘小宇, 南 周, 李凤前, 程金伟, 蔡季平, 魏锐利, 潇 黄 申请人:中国人民解放军第二军医大学