一种抗alpha-烯醇化酶抗体层析试纸条及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫分析检测领域。具体而言，本发明涉及一种检测抗alpha-烯醇化 酶抗体免疫层析检测试纸、制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 稀醇化酶（enolase)是1934年Lohman和Mayerhof在研宄肌肉提取物中磷酸甘 油酸向丙酮酸转换的过程中发现的。它既可催化糖酵解过程中2-磷酸-D-甘油酸（PGA) 向磷酸_烯醇式丙酮酸（PEP)的转化，又可在糖原合成过程中，催化逆向反应，即作为磷 酸丙酮酸水合酶，使PEP向PGA转化，因此烯醇化酶在细胞能量代谢过程中起重要的作用 【JBiolChem，2000,275(8) :5958-5965】。在脊椎动物中，烯醇化酶存在3种同功酶：a， 0，y。a-烯醇化酶在许多组织均存在，(6-烯醇化酶几乎仅见于肌肉组织，Y-烯醇化 酶则主要存在于神经元和神经内分泌组织。根据它们的分布和作用不同，a-烯醇化酶又 称为非神经元稀醇化酶（non-neuralenolase，NNE)、enolasel(eno-l)、磷酸稀醇丙酮酸 脱氢酶（phosphopyruvatehydratase)、c_myc启动子结合蛋白(c-mycpromoter-binding protein，MBP-1)、纤维蛋白溶酶原结合蛋白（plasminogen-bindingprotein)。
[0003] NNE在结构上高度保守，除了作为糖酵解反应的限速酶，还作为自身抗原参与机体 免疫反应。研宄证明，多种自身免疫病均可检出抗NNE抗体。NNE作为一种自身抗原，既是 胞浆酶，又可表达于肾脏、血管等组织及一些细胞如内皮细胞膜或与细胞表面结合。抗NNE 自身抗体通过识别NNE的膜联形式和/或干扰它的功能而于局部诱发免疫炎性反应。自 身免疫性视网膜病变患者体内存在抗NNE抗体，并特异定位于视网膜神经节细胞层及内核 层，诱导该区域细胞凋亡，导致失明【JAutoimmun，2004,23(2) :161-167】。存在于人呼吸 道上皮细胞中的NNE自身抗原诱导的自身免疫反应，造成呼吸道上皮细胞损伤，诱发气道 炎症反应，参与重症哮喘和阿斯匹林敏感性哮喘的发生【JAllergyClinImmunol，2006， 118(2) :376-381】。类风湿性关节炎患者的关节滑膜中可见大量的NNE表达，作为一种自身 抗原，NNE发生氨基甲酰鸟氨酸化，并刺激机体产生特异性自身抗体，从而引发类风湿性关 节炎的慢性炎症反应【ArthritisResTher，2005, 7 (6) : 1421-1429】。研宄还发现，大约有 10-18%的炎症性肠病（inflammatoryboweldisease，IBD)血清中抗NNE抗体阳性【Clin ExpImmunol. 1998；112 ：1〇-16]〇
[0004] 目前实验室常用的检测抗NNE的方法是酶联免疫吸酶联免疫吸附试验（enzyme linkedimmunosorbentassay，ELISA)和免疫迹法（immunoblottingtest，IBT)〇尚未 发现有商品化的抗NNE抗体检测试剂盒。
[0005] ELISA法检测可用于高通量标本测定，灵敏度也较高，目前被广泛认可，但操作比 较繁琐，需多次加样和洗涤，完成整个实验过程需三小时左右，且易受温度和孵育条件的影 响，需酶标仪，亦需要专业免疫学技术人员在专业实验室中进行实验操作，给实验带来诸多 不便。
[0006] 免疫印迹法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，但操作 相对复杂，完成整个实验过程需三小时左右，亦需要专业免疫学技术人员在实验室中进行 实验操作，同时易受各种温度和孵育时间等环境条件因素的影响，对试验带来诸多不便。且 试剂具有较强的毒性和污染性。
[0007] 免疫层析法（immunochromatography)是近几年来兴起的一种快速诊断技术，其 原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入 样品（尿液或血清）后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体 的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，形成肉眼可见的检测带。现有的 免疫层析试纸条产品常用的示踪标记粒子有纳米金、纳米硒、乳胶等等，其中以纳米金应用 最为广泛。
[0008] 与其他检测方法相比，免疫层析法检测时间短，只需要5~20分钟，操作人员无需 培训，操作简便、快速，无需低温保存，储运方便等优势。
[0009] 在自体免疫性疾病诊断方面，已出现较多的免疫层析试纸，但抗NNE抗体的免疫 层析试纸在国内外市场上仍没有问世。
【发明内容】
[0010] 本发明所要解决的技术问题是为了克服现有方法的不足，将免疫层析法应用到抗 NNE抗体的检测中，采用间接免疫法来实现对样品中的抗NNE抗体进行检测，通过把NNE抗 原蛋白包被在结合垫或分析膜的检测带上，实现对样品中抗NNE抗体的高特异、高灵敏度、 高准确性的检测，快速筛查抗NNE抗体阳性标本，为临床炎症性肠病等自体免疫性疾病提 供快速的辅助诊断。
[0011] 本发明的目的之一在于提供一种快速、准确的抗NNE抗体的免疫层析检测试纸条 及制备方法，目的之二是提供一种基于免疫层析技术的抗NNE抗体检测方法。
[0012] 作为本发明第一个方面的抗NNE抗体的免疫层析检测试纸条，包括样品垫、结合 垫、分析膜、吸水垫和底板，分析膜上设置检测带和质控带，所述底板的上部贴合有分析膜， 分析膜上部的两端分别贴合有结合垫和吸水垫，结合垫上部的一端贴合有样品垫。
[0013] 所述的结合垫结合蛋白为纳米金标记物或彩色胶乳标记物，结合垫为1层（图1) 或2层（图2)，其中2层时错落与分析膜搭接。
[0014] 所述抗NNE抗体的免疫层析检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
[0015] 步骤I.NNE抗原蛋白的制备
[0016] 步骤2.结合垫⑵制备
[0017] (1)纳米金标记物的制备：用20~40nm粒径的纳米金溶液标记NNE抗原蛋白、抗 人IgA抗体、葡萄球菌A蛋白（SPA)、链球菌G蛋白（ProteinG)，以及其他与质控带C线能 形成免疫复合物的蛋白。
[0018] (2)彩色胶乳标记物的制备：用带活性氨基或羧基基团的彩色胶乳标记NNE抗原 蛋白、抗人IgA抗体、葡萄球菌A蛋白（SPA)、链球菌G蛋白（ProteinG)，以及其他与质控 带C线能形成免疫复合物的蛋白。
[0019] (3)结合垫（2)制备：玻璃纤维膜或聚脂膜作为结合垫，先用含BSA和糖的缓冲液 预处理并烘干，将步骤（1)制备的纳米金标记物或胶乳标记物，用喷涂仪喷涂在预处理的 玻璃纤维膜或聚脂膜上，干燥备用。
[0020] 步骤3.分析膜⑶制备
[0021] (1)检测带T线⑷制备：根据结合垫标记蛋白类型选择检测带T线包被蛋白，如 结合垫上的结合蛋白含NNE，检测带T线的包被蛋白是抗人IgG。如果结合垫上含有抗人 IgG，检测带T线包被蛋白为NNE。
[0022] (2)质控带C线（5)制备：根据结合垫的标记蛋白类型选择质控带的包被蛋白，如 结合垫标记蛋白是单一的NNE，质控带C线的包被蛋白为抗NNE的抗体；如果结合垫标记蛋 白是单一的抗人IgG抗体，质控带C线的标记蛋白为对应的抗人IgG抗体的抗体；或者其他 结合垫标记蛋白形成免疫复合物的蛋白。
[0023] 步骤4.样品垫制备
[0024] 将玻璃纤维膜或聚酯膜经缓冲液浸渍烘干备用，或者直接使用。
[0025] 步骤5.试纸条组装
[0026] 把步骤1~4所制作完成的材料，按图1或图2搭接，根据底板的规格切割成一定 的长度和宽度，安装在底板和卡壳里。优选地，试纸条长度为6. 5cm，宽度为3_或4_。
[0027] 所述的NNE抗原蛋白是把全长NNE基因或者含有重要抗原表位的基因序列，克隆 到原核或真核表达载体里，表达纯化获得。
[0028] 所述的NNE抗原蛋白是用多肽合成仪合成含有NNE重要抗原表位的NNE多肽，并 偶联到载体蛋白上而获得。
[0029] 所述的抗人IgG抗体为鼠源、兔源、羊源、马源、骆驼源或豚鼠源中的一种或多种 单克隆抗体或多克隆抗体。
[0030] 所述的抗NNE的抗体是以NNE为免疫源，鼠源、兔源、羊源、马源、骆驼源或豚鼠源 中的一种或多种单克隆抗体或多克隆抗体。
[0031] 所述的抗人IgG抗体的抗体是指能与该抗体形成免疫复合物的抗体，比如该抗人 IgG抗体是鼠抗人IgG，它的抗体是羊抗鼠IgG的抗体或其他非鼠源的鼠IgG抗体。
[0032] 在本发明的另一方面，提供一种抗NNE抗体检测方法，用本发明第一方面方法及 步骤所制备的抗NNE抗体免疫层析试纸条，对待检样品进行检测，具体步骤：
[0033] (1)样本处理：取血清、血浆或全血样本，用加样缓冲液稀释0~100倍；
[0034] (2)把上述处理过的样品滴加到试纸条的样品垫上，静置5~20分钟，观察T线和 C线；
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