一种甲拌磷残留的酶联免疫检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物领域中一种诊断方法，具体涉及一种甲拌磷残留的酶联免疫检测 方法。
【背景技术】
[0002] 甲拌磷[phorate，0, 0-二乙基-S-(乙硫基甲基）二硫化磷酸酯]是有机磷类的 高效广谱的内吸性杀虫杀螨剂，具有触杀、胃毒、熏蒸作用，高毒，主要用于防治棉花，甜菜， 小麦，高粱和油菜上的害虫，只用于拌种。甲拌磷进入植物体后，受植物代谢的影响而转化 为毒性更大的氧化物（亚砜，砜），昆虫取食后体内神经组织中的乙酰胆碱酯酶的活性受到 抑制，从而破坏了正常的神经冲动传导，而导致中毒，直至死亡。并有较长的残效期（约1~ 2个月，甚至更长），对人类的健康存在着潜在的威胁。世界粮农组织（FAO)规定甲拌磷的 最1?残留限量：在粮食作物中不允许存在残留，在棉花中应小于〇. 〇5mg/g，蔬菜残留不得 检出。但是由于其杀虫作用好，目前在蔬菜，粮食等上存在不合理使用的现象比较严重。对 公众健康具有较大危害。另外甲拌磷在土壤中不易降解，极易污染土壤和水源，容易造成环 境污染。因此除加强甲拌磷的使用管理，从源头控制的同时，还应加强对其在农产品，土壤， 水源等方面的检测盒监管，防止其进入食物链。
[0003]目前，有关甲拌磷残留量的分析多采用气相色谱法（GC)和液相色谱法（Pauland Zavitsanosetal，2002)。由于常规仪器分析方法前处理步骤复杂，费时费力、设备昂贵， 检测费用高，需要专业人员操作，不适宜大量样品和现场快速检测。对于待检样品量、特别 是现场快速检测样品量的迅速增加，开发和应用可靠、灵敏、快速、实用的残留分析新技 术，成为监测和控制残留、保证食用农产品安全和避免国际间贸易争端的重要前提。而酶联 免疫分析（ELISA)快速检测技术因其成本低，速度快，一次检测样本量大，仪器化程度低， 现已成为常用的检测方法，因此开发甲拌磷特异，灵敏，且适用于现场大批量样本快速筛选 的酶联免疫方法具有重大的现实意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种甲拌磷残留的酶联免疫检测方法，该方法能够现场大量 快速检测土壤、水、农产品等样品中残留的甲拌磷，该方法灵敏度、准确度和精密度高，该酶 联免疫检测方法用包被抗原预包被酶标板，节约了甲拌磷抗体的用量，而且克服了直接包 被抗体不利于试剂盒长期保存的问题。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
[0006] -种甲拌磷残留的酶联免疫检测方法，所述酶联免疫检测方法包括以下步骤：
[0007] ①合成甲拌磷半抗原，包括甲拌磷半抗原前体的合成和甲拌磷半抗原的合成；
[0008] ②并用步骤①中所述的甲拌磷半抗原合成甲拌磷完全抗原，所述甲拌磷完全抗原 包括甲拌磷免疫抗原和甲拌磷包被抗原；所述甲拌磷免疫抗原是用N，N' -二环己基碳二亚 胺法将所述甲拌磷半抗原与牛血清白蛋白（BSA)共价偶联所得，所述甲拌磷包被抗原是用 N，N' -二环己基碳二亚胺法将所述甲拌磷半抗原与鸡卵清白蛋白（OVA)共价偶联所得；
[0009] ③制备甲拌磷多克隆抗体：a.将步骤②中所述的甲拌磷免疫抗原与弗氏佐剂充 分混合，形成油包水的结构为止；b.将步骤a中形成油包水的结构后立即对免疫动物进行 免疫注射，免疫注射的次数为4~7次；c.测定血清中抗甲拌磷抗体效价；d.用辛酸-硫酸 铵法进行纯化，得到对甲拌磷具有特异性反应的所述甲拌磷多克隆抗体；
[0010] ④酶标抗原的制备：采用混合酸酐法将羊抗兔或羊抗鼠与辣根过氧化物酶共价偶 联制得所述酶标抗原；
[0011] ⑤用步骤②中所述的甲拌磷包被抗原包被酶标板，洗涤去除游离物并封闭，所述 酶标板96孔或48孔的聚苯乙烯微孔板；所述封闭采用封闭液进行进行封闭，所述封闭液为 非牛源血清白蛋白的磷酸盐缓冲液溶液；
[0012] ⑥准备洗涤液、底物显色液、反应终止液、磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液以及封闭 液；
[0013] ⑦在步骤⑤中所述的酶标板的微孔条中加入甲拌磷标样或待测样品和所述的甲 拌磷多克隆抗体，反应60~70分钟后，倒出微孔条中的液体，用所述洗涤液进行洗涤；再加 入步骤③所述的酶标抗原，反应60~70分钟后，倒出微孔条中的液体，用所述洗涤液进行 洗涤；加入所述的底物显色液，反应30min，再加入所述的反应终止液，测定OD值。
[0014] 进一步地，所述甲拌磷免疫抗原和甲拌磷包被抗原通过紫外吸收光谱法进行鉴 定。
[0015] 进一步地，所述甲拌磷半抗原前体的合成方法为：①在反应瓶中加11.IgP5S2，逐 滴滴入无水乙醇9. 66g，在75~85°C下，搅拌，溶液呈淡黄色后，停止反应，得到硫化物；② 反应瓶中加入步骤①中所得的硫化物，在室温条件下，滴加IOg30%甲醛水溶液，磁力搅拌 20min后，加入7.9g2-巯基乙醇在60°C反应5h，柱色谱层析，得到所述甲拌磷半抗原前体， 该甲拌磷半抗原前体具有特征基团羟基，其合成路线如下。
【主权项】
1. 一种甲拌磷残留的酶联免疫检测方法，其特征在于：所述酶联免疫检测方法包括以 下步骤： ① 合成甲拌磷半抗原，包括甲拌磷半抗原前体的合成和甲拌磷半抗原的合成； ② 并用步骤①中所述的甲拌磷半抗原合成甲拌磷完全抗原，所述甲拌磷完全抗原包括 甲拌磷免疫抗原和甲拌磷包被抗原；所述甲拌磷免疫抗原是用N，N'_二环己基碳二亚胺法 将所述甲拌磷半抗原与牛血清白蛋白共价偶联所得，所述甲拌磷包被抗原是用Ν，Ν' -二环 己基碳二亚胺法将所述甲拌磷半抗原与鸡卵清白蛋白共价偶联所得； ③ 制备甲拌磷多克隆抗体：a.将步骤②中所述的甲拌磷免疫抗原与弗氏佐剂充分混 合，形成油包水的结构为止；b.将步骤a中形成油包水的结构后立即对免疫动物进行免疫 注射，免疫注射的次数为4~7次；c.测定血清中抗甲拌磷抗体效价；d.用辛酸-硫酸铵法 进行纯化，得到对甲拌磷具有特异性反应的所述甲拌磷多克隆抗体； ④ 酶标抗原的制备：采用混合酸酐法将羊抗兔或羊抗鼠与辣根过氧化物酶共价偶联制 得所述酶标抗原； ⑤ 用步骤②中所述的甲拌磷包被抗原包被酶标板，洗涤去除游离物并封闭，所述酶标 板96孔或48孔的聚苯乙烯微孔板；所述封闭采用封闭液进行进行封闭，所述封闭液为非牛 源血清白蛋白的磷酸盐缓冲液溶液； ⑥ 准备洗涤液、底物显色液、反应终止液、磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液以及封闭液； ⑦ 在步骤⑤中所述的酶标板的微孔条中加入甲拌磷标样或待测样品和所述的甲拌磷 多克隆抗体，反应60~70分钟后，倒出微孔条中的液体，用所述洗涤液进行洗涤；再加入步 骤③所述的酶标抗原，反应60~70分钟后，倒出微孔条中的液体，用所述洗涤液进行洗涤； 加入所述的底物显色液，反应30min，再加入所述的反应终止液，测定OD值。
2. 根据权利要求1所述的甲拌磷残留的酶联免疫检测方法，其特征在于：所述甲拌磷 免疫抗原和甲拌磷包被抗原通过紫外吸收光谱法进行鉴定。
3. 根据权利要求1所述的甲拌磷残留的酶联免疫检测方法，其特征在于：所述甲拌磷 半抗原前体的合成方法为：①在反应瓶中加11. Ig P5S2，逐滴滴入无水乙醇9. 66g，在75~ 85°C下，搅拌，溶液呈淡黄色后，停止反应，得到硫化物；②反应瓶中加入步骤①中所得的硫 化物，在室温条件下，滴加 IOg 30%甲醛水溶液，磁力搅拌20min后，加入7. 9g 2-巯基乙醇 在60°C反应5h，柱色谱层析，得到所述甲拌磷半抗原前体，该甲拌磷半抗原前体具有特征 基团羟基，其合成路线如下。
4. 根据权利要求1所述的甲拌磷残留的酶联免疫检测方法，其特征在于：所述甲拌磷 半抗原的合成方法为：在反应瓶中加入所述甲拌磷半抗原前体与丁二酸酐，以4-二甲氨基 吡啶作为催化剂进行反应，得所述甲拌磷半抗原，该甲拌磷半抗原上的羧基能够与蛋白质 共价偶联，其合成路线如下。
5. 根据权利要求1所述的甲拌磷残留的酶联免疫检测方法，其特征在于：步骤②中所 述免疫动物为兔、羊、狗或鼠。
6. 根据权利要求5所述的甲拌磷残留的酶联免疫检测方法，其特征在于：所述免疫动 物为雄性新西兰大白兔。
7. 根据权利要求1所述的甲拌磷残留的酶联免疫检测方法，其特征在于：所述甲拌磷 多克隆抗体能够用甲拌磷单克隆抗体或甲拌磷基因工程抗体中的一种代替。
8. 根据权利要求7所述的甲拌磷残留的酶联免疫检测方法，其特征在于：所述甲拌磷 单克隆抗体的制备方法：a.用所述甲拌磷免疫抗原免疫小鼠，得血液里含有甲拌磷的鼠的 细胞；b.将鼠的细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选阳性孔，并对所述阳性孔进行克隆化，得到单 克隆抗体的杂交瘤细胞株；c.采用体内诱生法，得到所述的甲拌磷单克隆抗体。
9. 根据权利要求7所述的甲拌磷残留的酶联免疫检测方法，其特征在于：所述甲拌磷 基因工程抗体是将甲拌磷免疫抗原免疫小鼠，提取小鼠脾细胞RNA，以逆转录得到的cDNA 为模板，PCR扩增抗体，将抗体中的轻链、重链连接成ScFv酶切经PCR扩增的ScFv片段，并 与噬菌体载体连接，转化入大肠杆菌进行表达，纯化，得到所述甲拌磷基因工程抗体。
10. 根据权利要求1所述的甲拌磷残留的酶联免疫检测方法，其特征在于：步骤⑥中所 述的操作过程是在37°C下进行反应的。
【专利摘要】本发明涉及一种甲拌磷残留的酶联免疫检测方法，所述酶联免疫检测方法包括以下步骤：①合成甲拌磷半抗原；②合成甲拌磷完全抗原，甲拌磷完全抗原包括甲拌磷免疫抗原和甲拌磷包被抗原；③制备甲拌磷多克隆抗体；④酶标抗原的制备；⑤用甲拌磷包被抗原包被酶标板；⑥相关溶液的配制；⑦检测。该甲拌磷的酶联免疫检测方法能够现场大量快速检测土壤、水、农产品等样品中残留的甲拌磷，该方法灵敏度、准确度和精密度高，该酶联免疫检测方法用包被抗原预包被酶标板，节约了甲拌磷抗体的用量，而且克服了直接包被抗体不利于试剂盒长期保存的问题。
【IPC分类】G01N33-577, G01N33-531
【公开号】CN104764880
【申请号】CN201410007117
【发明人】魏松红, 纪明山, 马晓宁
【申请人】马晓宁, 纪明山, 魏松红
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2014年1月8日