专利名称：作药物用的突变生长因子受体及其治疗癌的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有治疗性能的突变生长因子受体、至少含有一种突变生长因子受体的药物，以及一种或多种此类突变受体治疗癌的应用。
细胞生长是一种取决于机体特殊需要的细致调节过程。在年幼机体中，细胞分裂率超过细胞死亡率，这就导致机体增长。在发育完全的机体中，细胞再生和细胞死亡达到平稀，形成“恒态”。但是，在一些少有的情况下，细胞繁殖失控，即使机体中并不特别需要较高数目的此类细胞，它们却仍然开始生长并分裂。这种失控的细胞生长，是癌的起因。能够引起失控细胞生长的因素，常常是化学上的因素，但也可以是物理方面的因素，例如放射性辐射。
目前，基本上有两种治疗癌的途径。抑或经外科手术从病患机体完全除去癌细胞，抑或设法使机体中变质的细胞不造成危害，例如通过给药或理疗法如放射疗法。
在化学疗法中，常常使用药物，这些药物以某种形式影响DNS代谢，并使必然产生较高代谢效率的迅速生长细胞受损害，成为不分裂或仅缓慢分裂的细胞。然而，许多化疗法的一个严重缺点是，所用的高效物质特异性很小，使健康细胞在化疗中也受损害。此外，高效物质的这种很小特异性还要求，其定药量每次都必须在杀死癌细胞的同时，尽可能少地损害健康细胞。这常常是做不到的，从而癌症病人由于癌细胞不断扩散，致使维持生命所必需的各种机能因在后期缺失而死亡。
本发明的任务是，提供另一种具有宝贵治疗性能的高效物质，并提供一种含有该高效物质的药物，该高效物质或药物对治疗癌症特别有益。
按本发明，该任务用一种突变生长因子受体作药物，和用至少含有一种突变生长因子受体的药物来解决。
按照本发明，可以证明，突变生长因子受体具有宝贵的治疗性能，它们尤其适用于治疗癌症。
生长因子受体，在人体癌细胞发生和繁殖中，起着决定性作用。生长因子受体参与正常细胞的生长控制。细胞分裂的真正信号是生长因子，它的形成取决于机体的需要。受体起着传递信号的作用;也即，它在细胞分裂活动中，在细胞内部参与细胞外生长信号的转换。就许多生长因子受体而言，它们在生长因子结合到细胞外结构域后，将磷酸盐基转移到蛋白质中酪氨酸基上的能力起着决定性作用。这些受体也称作受体酪氨酸激酶。Yarden，Y.和Ullrich，A.在Rev.Biochem.1988，57，443-78中介绍了受体酪氨酸激酶的概况。在生长因子结合之后，这种生长因子受体的二聚化，在信号传递过程中是另一个重要过程。在具有酪氨酸激酶活性的生长因子受体的干预下，细胞外信号变成细胞内信号的过程，可分解为下列5个阶段1、生长因子(也称作配位体)结合到受体的细胞外结构域上，诱发构象变化;这导致2、构象发生变化的受体进行二聚化;
3、同时诱发胞浆结构域的变构性变化，以此又诱发激酶活力;
4、受体二聚体中，酪氨酸基发生转磷酸作用，该作用又产生一种活化受体构象，并使之稳定;以及5、多肽底物发生磷酸化作用，并与细胞因子发生交互作用。
信号传递链的机能亢进，导致相应细胞的分裂活性过高，并在极端情况下蜕化为癌细胞。Ullrich，A.和Schlessinger，J.在Cell(1990)61，203-212中概要介绍了生长因子受体及其在信号从细胞外环境传递到细胞内环境时的作用，以及突变受体对癌细胞的形成可能产生的影响。
现已意外地发现，当突变受体与一种细胞的野生型受体共同表达时，上述5个阶段的信号传递链可为突变生长因子受体所阻断或抑制。因此，突变生长因子受体适宜用作药物，可用它来治疗同生长信号通过相应受体加剧传递到细胞内有关的癌症。
优选的受体突变种不再具有野生型受体的酪氨酸激活酶活力。在配位体形成后，这种突变种不能再使受体二聚体或多肽底物中的酪氨酸基发生磷酸化作用。因此，细胞外生长信号变成细胞内信号的转变被阻断或部分抑制。
野生型受体中有一个点突变就能达到目的，因为当野生型受体经此点突变已失去酪氨酸激酶活力时，它就不再具有作用能力。作为药物，这样一种点突变是优选的。
此外，优先选择的是一种在酪氨酸激酶结构域有缺失的突变受体，该缺失使酪氨酸激酶丧失活力。
优选的是，经胞质结构域内缺失所突变的受体，仍然还含有跨膜区。具有现存跨膜区的突变受体，能极为有效地抑制生长信号传递，并因而比无跨膜区的受体，例如由细胞外结构域组成的突变种显示出更好的治疗作用。
尤其适合用作药物的，是受体酪氨酸激酶的突变种，例如EGF受体、PDGF受体或NGF受体。
表皮生长因子(EGF)的突变受体，尤其特别适合。
在一种特别优选的EGF受体突变种的情况下，野生型受体序列的氨基酸721位置上有一个点突变。在一种优选的突变种中，721位置上的赖氨酸基由突变种的丙氨酸基代替。这种突变种，按照布达佩斯条约以编号DSM6678寄存在德国微生物与细胞培养物保藏有限公司(DSM)。在另外一种优选的EGF受体突变种中，缺失野生型受体的533C-端部氨基酸。这种突变种以编号DMS6679寄存。
受体突变种可按照一般基因技术方法，由野生型受体制备，这些基因技术方法例如Sambrook，J.等在(1989)Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press)中已有描述。
本发明的药物，至少含有一种上述突变生长因子受体和常用的佐药与载体物质。
特别优选的，是一种含有包封在脂质体中的一种或多种受体突变种的药物。为了使脂质体有选择地到达靶组织，如果脂质体在其膜中含有抗体，而且这些抗体能识别靶细胞的特定表位，并有选择地结合到这些表位上，则是有利的。因此，受体突变种有选择地到达靶组织，并在那里发挥其预期的作用。
此外，有一种药物是优选的，这种药物含有一种或多种重组逆转录病毒载体形式的上述一种或多种受体。重组载体含有编码上述一种或多种受体用的核酸片段。在给病人投药后，逆转录病毒就感染靶细胞，并使受体突变种在其中进行表达。给以包封在脂质体中的高效物质，是一种目前常用的投药方式。
有一种特别优选的药物，它含有编码EGF受体突变种的逆转录病毒载体pNTK-HER-K721A及/或pNTK-HERCD-533，它们分别以编号DSM6678和DSM6679寄存在DSM。
上述突变受体或含有这些突变受体的药物，特别适用于治疗癌症。其中，可以特别有效地治疗因生长因子受体功能亢进所致的那些癌类。属于这些癌类的，尤其是乳房癌、卵巢癌和肺癌。Slamon，D.J.等在Science(1987)，235，177-182和Science(1989)，244，707-712，以及Kern，J.A.等在Cancer Res.(1990)，50，5184-5191中已详细论述了表面受体在这些癌症中所起的作用。
不受某种特定理论的局限，人们可以认为，所述的受体突变种之所以能在靶细胞中发挥其作用，是由于除野生型受体之外，突变种也被嵌入靶细胞膜中，受体突变种于是就使野生型受体的功能减退。
下面以EGF受体的突变种为模型来详细阐述本发明。
Ullrich，A.等人在Nature(1984)，309，418-425中记述的表皮生长因子受体(EGF受体)，是具有酪氨酸激酶活力的170kD糖蛋白。Ullrich，A.和Schlessinger，J.在Cell(1990)，81，203-212中详述了从结合配位体直到刺激激酶活力的分子级过程。正如Riedel，H.等在Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，(1988)85，1477-1481中和Di Fiore，P.P.等人在Cell(1987)，51，1063-1070中所述，当EGF在正常情况下引起成纤维细胞中的致有丝分裂反应时，过度表达受体所致的EGF受体信号传递功能亢进，导致了DIH 3T3小鼠细胞的配位体依赖性转化。彻底的临床检查，支持了这种受体在各种癌如乳房癌、卵巢癌和肺癌的形成过程中的这种功能，这正如Slamon，D.J.等人在Science(1987)，235，177-182和Science(1989)，244，707-712，以及Kern，J.A.等人在Cancer Res.(1990)，50，5184-5191中所述。
现已意外地发现，不再具有酪氨酸激酶活力的EGF受体突变种，在表达EGF野生型受体的已转化癌细胞中所进行的表达，能取消已转化的表型。
材料和方法重组逆转录病毒的制备Keller，G.等人在Nature，(1985)，318，149-154;Stewart，C.L.等人在EMBO J.，(1987)，6，383-388;von Ruden，T.和Wagner，E.F.在EMBO J.，(1988)，7，2749-2756中详述了逆转录病毒表达载体pN2、pNTK2及pNTK-HERC。pNTK-HER-k 721A通过克隆pNTK-HERc中CMVHER-k721A的一个BgL II片段来制备。借助如Sambrook，J.等人在Molecular cloning(Cold Spring Habour Laboratory Press，1989)中所述的一般克隆方法，通过Liven，E.等人在J.Biol.Chem.，260，12490-12491中所述方法，在pLSXNA 8的2kb大片段XBa I/Xho I的两侧上形成一个CLa I位点来制备pNTK-HERCD-533，接着用使CLaI裂解的pNTK2来连接2kb CLaI片段。通过将CVNHERXCD的一个ClaI片段克隆到pNTK2的CLaI位置上，来制备NTK-HERCD-566构建体。该构建体已以编号DSM6680寄存。生态营养性(ecotrope)重组逆转录病毒，用Markowitz D.在J.Virol.，(1988)62，1120-1124中所述的无辅助病毒生产系GP+E-86来制备。稳定的GP+E-86生产系，借助于如Miller，A.D.和Buttimore，C.在Mol.Cell.Biol.，(1986)6，2895-2902中所述的一种改进感染记录法(Infektionsprotkoll1)来制备。低效价两性营养性(amphotrophes)病毒，通过将逆转录病毒表达质粒瞬时转染到无辅助病毒包装细胞系PA317中来制备(对此，Miller，A.D.等人在Mol.Cell.Biol.，1985，5，431-437中已予说明)，并接着在G418(1mg/ML)中选择生产系GP+E-86的克隆之后，用它来感染二次包装细胞GP+E-86。通过用含有无细胞GP+E-86上消液的逆转录病毒稀释系列感染NIH 3T3细胞，并测定对G418有抵抗力的集落数目，来测定病毒效价。Blashand，A.J.在Oncogene，(1990)5，1213-1221中论述了含有肿瘤生长因子α(TGFα)基因的逆转录病毒(ψ2TGFα)。
借助逆转录病毒转移基因在4μg/L聚凝胺(Aldrich)存在下，用释放高效价NTK-HERc病毒(5×105G418R集落形成单位每mL)的GP+E-86细胞上清液，培养亚会合NIH 3T3细胞(105个细胞/6cm培养平板)4-12小时，接着在释放高滴度N2、NTK-HERK 721A、NTK-HERCD-533病毒抑或NTK-HERCD-566病毒的GP+E-86细胞上清液中培养。如Bordignon，C.等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA86，6748-6752中所述，通过多次感染来提高受体的表达水准。在上述试验中，用1mL GP+E-86细胞稀释上清液(1.25×105集落形成单位)感染一次，或用相同体积的未稀释GP+E-86细胞上清液(5×105集落形成单位)感染1至4次，所述GP+E-86细胞释放高滴度N2、NTK-HERK721A、NTK-HERCD-533病毒抑或NTK-HERCD-566病毒。
完整细胞中的受体磷酸化将如上所感染的细胞，在10cm碚养平板上培养到90%会合、洗涤，并在不含甲硫氨酸的DMEM(Gibco)中，添加含1%FCS的50μCi/mL35S-甲硫氨酸(Amersham)，培养16小时。用20ng/mL EGF(Amgen Corp.)刺激细胞10分钟，并在4℃下，将细胞溶于0.5mL溶解缓冲液(50mM HEPES pH7.2、150mMNaCl、1.5mM MgCl、1mM EGTA、10%甘油(Glyerzin)、1%Triton X-100、1mM PMSF、10mg/mL抑肽酶、100μM正钒酸钠)。在4℃下，将溶解产物在Eppendorf型离心分离机中以约12000g离心10分钟。然后，将上清液用过量单克隆抗体108.1(Honegger，A.M.，Ullrich，A.及Schlessinger，J.在Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，(1989)86，925-929中述及此)和蛋白A-琼脂糖在4℃下培养4小时。免疫沉淀物用HNTG(20mM Hepes pH7.3、150mM NaCl、0.1% Triton X-100及10%甘油)洗涤两遍。将片状沉淀物再悬浮在试验缓冲液中，煮沸5分钟，并用SDS-PAGE(7.5%)分析。以电泳法将蛋白质转移到硝化纤维素上，接着用抗磷酪氨酸的单克隆小鼠抗体(5E2)(见Fendly，B.M.等人，1990，Cancer Research，50，1550-1558)培养。为验证起见，在ECL-底物-反应(Amersham)之后，用联接过氧化物酶的山羊抗小鼠抗体来培养硝化纤维素过滤器。在用柯达(Kodak)X-Omat底片检测后，将硝化纤维素过滤器用含有0.2%Tween 20的PBS洗涤。接着，借助放射自显影照相术来验证35S-甲硫氨酸标记的蛋白质。显影带密度用显象密度测定法来确定。-胸苷掺入在用N2、NTK-HERK 721A、NTK-HERCD-533或者用NTK-HERCD-566进行4次感染后，如所述用NTK-HERc辅助感染亚会合HIN 3T3细胞(105个细胞/6cm培养平板)。将该细胞均分到12孔科斯塔平板(costarplatten)上。达到会合后，使细胞单层在0.5mL DMEM，0.5% FCS中饥饿24小时，并在加入EGF18小时后，将该细胞用0.5μCi甲基-[3H]胸苷(Amersham)标记4小时。将细胞用PBS洗涤两遍，并接着在冰上用10%TCA沉淀1小时。用10%TCA洗涤沉淀物，并再溶于200μL 0.2N NaOH/0.2%SDS。中和溶解产物，并用闪烁计数法来定量测定所掺入的放射性。
转化试验为了检验NIH 3T3细胞在软琼脂中的集落形成能力，在用N2、NTK-HERK 721A、NTK-HERCD-533，抑或用NTK-HERCD-566感染4次后，用NTK-HERc感染会合后的NIH3T3细胞(105个细胞/6cm培养平板)。在能产生自分泌刺激的那些情况下，用ψ2TGFα病毒(5×104G418R集落形成单位每mL)感染细胞。在6cm培养平板上，将NIH 3T3细胞(105个)在3mL培养基中含有或不含有10ng/mL EGF的情况下，完全涂到由MEM组成并含有10%FCS及0.2%琼脂(Gibco)的面层上。底层含有MEM、10%FCS及0.4%琼脂。四星期后，点算可见集落。
为进行空斑(Foci)形成试验，在用N2、NTK-HERK 721A、NTK-HERCD-533病毒，抑或用NTK-HERCD-566病毒感染四次后，用NTK-HERc(1×104G418R集落形成单位每mL)来辅助感染亚会合NIH 3T3细胞(105个细胞/6cm培养平板)。在有些实验中，用ψ2TGFα病毒(1×103G418R集落形成单位每mL)重复感染该细胞。感染后的细胞，在6cm培养平板上用含有4%FCS的DMEM，在有或没有10ng/mL EGF存在下进行培养。每隔3天换一次培养基。培养平板用结晶紫染色，在第18天点算空斑。
图1示意说明人的EGF野生型受体和突变EGF受体。图中指出了富半胱氨酸结构域(CYS)、酪氨酸激酶(TK)结构域及横跨膜结构域(TM)的位置。突变种HERK 721A在712位上有一个点突变(以丙氨酸代替赖氨酸)，而HERCD-533和HERCD-566则分别载有533和566氨基酸的C端部缺失。Livneh，E.等人在J.Biol.Chem.，(1986)，260，12490-12497，以及Honegger，A.M.等人在Cell(1987)，51，199-209中详述了这些突变种。
图2A野生型EGF受体和突变EGF受体的酪氨酸磷酸化。将仅表达野生型受体，抑或同时共同表达野生型受体和突变受体的细胞，用[35S]-甲硫氨酸标记过夜，接着在有或没有2ng/mL EGF存在下，培养10分钟。将细胞溶解，并用抗EGF受体抗体(mAb108)使之沉淀，用SDS-PAGE加以分离，并用抗磷酸酪氨酸受体(5E2)进行免疫学分析。
图2(B)EGF受体在NIH 3T3细胞上的表达。将仅表达野生型受体，抑或同时共同表达野生型受体和突变受体的细胞，用[35S]-甲硫氨酸标记过夜，接在有或没有20ng/mL EGF存在下培养10分钟。将细胞溶解，并用抗EGF受体抗体(mAb108)沉淀，用SDS-PAGE进行分离，并用抗磷酸酪氨酸受体(5E2)进行免疫学检测，其中进行ECL底物反应。用含0.2% Tween 20的PBS洗去ECL底物，并用自动射线照相术检测[35S]-甲硫氨酸标记过的蛋白质。
图3模拟EGF的[3H]-胸苷插入。在仅表达野生型受体(虚线)，抑或共同表达野生型受体和突变受体的细胞中，例如A中为野生型EGF受体+K721A，B中为野生型EGF受体+CD-533，C中为野生型EGF受体+CD-566，在12孔科斯塔培养平板中培养到会合，并在含有0.5%FCS的EMEM中饥饿2天。添加10%FCS或不同浓度的EGF，并在添加EGF后18小时添加[3H]-胸苷(0.5μCi/孔)，历时4小时，并测定其在DNS中的掺入。记录致有丝分裂反应，以揭示剂量与反应之间的关系。所测值用基底胸苷掺入来校正，并将EGF的最大观察反应定为100%。所占的三角形标示出最大胸苷插入的半值。
结果将仅表达野生型受体或共同表达野生型受体和突变受体的细胞，用[35S]-甲硫氨酸标记，在有或没有EGF存在下培养10分钟，溶解，并用抗人体EGF受体的小鼠抗体(mAb108)免疫沉淀。样品用SDS-PAGE分离，转移到硝化纤维素过滤器中，并用磷酸酪氨酸特异性小鼠抗体5E2(图2A)检测酪氨酸磷酸化。存在于免疫沉淀物中的受体数量，用同一硝化纤维素过滤器进行自动射线照相术来检测(图2B)。
如图2A中的斑迹b和c所示，将EGF加入用含野生型EGF受体的病毒所感染的正常NIH 3T3细胞，诱导了170kDEGF受体显影带的强烈酪氨酸磷酸化。与未磷酸化的EGF受体相比，EGF受体在SDS-PAGE中的迁移速度因磷酸化而降低，正如由图2B中的斑b和c所看到的那样。野生型受体刺激EGF磷酸化的程度，就像通过NTK-HERCD-566病毒基因组编码那样，并不由于EGF受体的可溶性胞外结构域的共同表达而降低，即使胞外结构域的表达量比野生型受体过量4倍也然(图2A，斑d至f;图2B，斑d至f)。
相反，在一种类似的试验中，使用一种表达膜稳定EGF受体缺失突变HERCD-533的受体(图1)，对野生型EGF受体的EGF诱导磷酸化产生强烈剂量依赖性抑制作用(图2A，斑g至i)，尽管170kD EGF受体蛋白质含量保持不变(图2B，斑g至i)。酪氨酸磷酸化显影带的强度分别从100%降至71%和30%。在此条件下，EGF受体显示出同未磷酸化受体一样的电泳特性(图2B，斑i)，这与用mAb 5E2(图2A，斑i)所检测的其酪氨酸磷酸化的状况相一致。
当野生型受体与负激酶突变种HERK721A共同表达时，检测到120kD显影带的酪氨酸磷酸化加剧(图2A，斑k至m)。按照放射自显影术密度测定分析，受体酪氨酸磷酸化信号强度从251%分别提高到337%和450%。因为野生型受体和负激酶突变种一样大小，所以图2B的斑k至m中，170kD信号的增强，表示两种受体的磷酸化总和，在此种情况下，突变受体可被野生型受体转磷酸化。
EGF诱导细胞分裂率的抑制如Riedel，H.等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1988)85，1477-1481，以及Prgwes，R.等人在EMBO J.(1986)，2179-2190中所述，EGF能刺激表达EGF受体的NIH3T3成纤维细胞分裂。突变受体对EGF野生型受体所控制的细胞分裂产生的影响，借助于诱导DNA合成来测定。
这种DNA合成，在用NTK-HERc病毒和N2病毒对比组感染的细胞中，被选定为[3H]-胸苷掺入，而且此合成在2ng/mL EGF时刺激最大，在0.66ng/mL(图3)时，为半最大刺激(ED50)。类似于早先如Honegger，A.M.等人在EMBO J.，(1988)7，3045-3052中和Riedel，H.等人在Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，(1988)85，1477-1481中所述的结果，较高的EGF浓度导致较低的[3H]-胸苷掺入量，如图3所示。在用相应的病毒感染4次后，EGF受体与HERCD-533和HERR721A的共同表达，使剂量依赖性曲线明显地向高EGF浓度方向移动(图3A和B)。这表明，与HERc/N2细胞相比，该细胞对生长因子已不大敏感。不论缺失突变种HERCD-533，还是点突变种HERK721A(图1)，均对EGF野生型受体促成的细胞分裂信号显示类似影响，并且使ED50成10倍地增加到6.6ng/mL EGF。与此相反，用NTK-HERCD-566病毒进行的重复感染，对于用EGF刺激野生型的DNA合成，并没有显著影响(图3C)。
EGF受体突变种的抗致癌活性众所周知，EGF受体的重复表达，引起NIT 3T3细胞的EGF依赖性细胞转化，这正如Di Fiore，P.P.等人在Cell，(1987)51，1063-1070中，Velu，T.J.等人在Science，(1987)237，1408-1410中，以及Riecel，H.等人在Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，(1988)85，1477-1481中所述。为了检验重复表达的EGF受体转化潜力是否能被EGF受体突变种抑制，使EGF受体与受体突变种共同表达，并接着检查其在软琼脂中形成集落，或在单层细胞培养中形成空斑的能力。通过向培养基添加EGF，抑或通过用带有TGF-αDNA的病毒(ψ2TGFα)进行感染，来达到对过度表达EGF受体的刺激，以便产生一种自分泌(Autocrin)活化系(表1示出4次试验的平均值)。
在用NTK-HERc病毒和N2对照组感染之后，NIH 3T3细胞在有10ng/mL EGF存在的软琼脂中形成约250个集落。在其它条件完全相同的情况下，通过用ψ2TGFα病毒协同感染，则形成148个集落(见表1)。然而，当用EGF受体感染过的细胞以NTK-HER-K721A抑或NTK-HERCD-533病毒重复感染时，集落形成能力几乎被完全压抑。EGF受体与细胞外结构域HERCD-566的共同表达，在琼脂层中以10ng/mL EGF刺激时，使集落形成能力约降低50%，而在用ψ2TGFα病毒感染后，以自分泌TGF刺激时，则约降低33%。
以类似方法测定NIH 3T3单层培养中NTK-HERc病毒的空斑形成潜力，在10ng/mL EGF存在时，每106个病毒形成920个空斑，抑或在用ψ2TGFα病毒协同感染后，每106个NTK-HERc病毒形成430个空斑。用NTK-HERK721A或NTK-HERCD-533病毒重复感染，在用EGF进行刺激时，空斑数目约降低100%或90%，当用ψ2TGFα病毒刺激时，空斑数目降低约75%或71%(表2)。
共同表达EGF野生型受体和HERCD-566的细胞，显示同表达EGF受体并用对照病毒N2感染的细胞一样的空斑数目。不仅在用EGF刺激时，而且在用ψ2TGFα病毒刺激时，都观察到这种结果。
由上所述可见，EGF受体突变种不仅具有明确的抗增生潜力，而且也具有抗致癌的潜力，因此卓绝地适用于治疗癌症。
表1 软琼脂中集落的形成集落数目/106CFU感染+10ng/mL EGF+2TGFN2 0 0NTK-HERK721A 0 0NTK-HERCD-533 0 0NTK-HERCD-566 0 0NTK-HERc/N2 246 148NTK-HERc/NTK-HERK721A 8 2NTK-HERc/NTK-HERCD-533 6 4NTK-HERc/NTK-HERCD-566 128 1004周后点数集落。所示值为4次平行试验的平均值。CFU代表集落形成单位。
表2 NIH 3T3空斑形成空斑数目/106CFU细胞系+10ng/mL EGF+2TGFN2 0 0NTK-HERK721A 0 0NTK-HERCD-533 0 0NTK-HERCD-566 0 0NTK-HERc/N2 920 480NTK-HERc/NTK-HERK721A 40 18NTK-HERc/NTK-HERCD-533 90 14NTK-HERc/NTK-HERCD-566 910 50014-16天后点数空斑。所示值为4次平行试验的平均值。CFU代表集落形成单位。
权利要求
1.用作药物的突变生长因子受体。
2.权利要求1所述的突变生长因子受体，其特征在于，它不再具有野生型受体的酪氨酸激酶活力。
3.权利要求1或2中任一项所述的突变受体，其特征在于，它是野生型受体的一个点突变种。
4.权利要求1或2中任一项所述的突变受体，其特征在于，它在酪氨酸激酶结构域中具有一个缺失。
5.权利要求1、2或4中任一项所述的突变受体，其特征在于，它缺失胞质结构域，但存在跨膜区。
6.权利要求1至5中任一项所述的突变受体，其特征在于，它是一种突变的受体酪氨酸激酶。
7.权利要求6所述的突变受体，其特征在于，它是一种突变EGF受体。
8.权利要求7所述的突变受体，其特征在于，它在野生型受体序列的氨基酸位置721上有一个点突变。
9.权利要求8所述的突变受体，其特征在于，它在721位置上有一个丙氨酸基。
10.权利要求7所述的突变受体，其特征在于，野生型受体的533C-端部氨基酸缺失。
11.至少含有一种权利要求1至10中任一项所述突变生长因子受体和常用佐药与载体物质的药物。
12.权利要求11所述的药物，其特征在于，它含有一种或多种包封在脂质体中的所述受体。
13.权利要求11或12所述的药物，其特征在于，它含有一种或多种重组逆病毒载体形式的一种或多种所述受体，所述载体携有编码受体的核酸片段。
14.权利要求13所述的药物，其特征在于，它含有逆病毒载体pNTK-HER-K721A及/或pNTK-HERCD-533，这两种载体分别以编号DSM6678和DSM6679寄存在德国微生物保藏室。
15.权利要求11至14中至少一项所述、用于治疗癌的药物。
16.权利要求1至10中任一项所述突变受体用于治疗癌的应用。
17.权利要求16所述用于治疗癌类的应用，所述癌系由生长因子受体功能亢进所致。
18.权利要求17所述用于治疗乳房癌、卵巢癌和/或肺癌的应用。
全文摘要
本发明涉及适于作药物的突变生长因子受体。这类突变生长因子受体对治疗癌症特别有益，尤其对治疗生长因子受体在癌发生时功能亢进起作用的那类癌。本发明公开了作为治癌特效药的EGF受体突变种，其中野生型受体的酪氨酸激酶活力已为酪氨酸激酶结构域中的点突变或缺失所消除。
文档编号C07K14/485GK1071586SQ9211139
公开日1993年5月5日 申请日期1992年9月5日 优先权日1991年9月5日
发明者A·乌尔里克, N·H·雷德曼 申请人:马普科技促进协会