专利名称：检测方法
技术领域：
本发明涉及代谢综合征或生活习惯疾病的检测方法、以及代谢综合征或生活习惯疾病的检测试剂盒。
背景技术：
近年来，动脉硬化症、高脂血症、糖尿病、高血压和中心性肥胖等生活习惯疾病明显以共同的代谢异常为基础而发病，作为这些疾病的基础的代谢异常表现为代谢综合征。在厚生劳动省令第一百五十七号“关于特定健康诊查和特定保健指导的实施的基准(2007年12月28日)”中，规定了对40 74岁的保险者进行特定健康诊查的义务，而对代谢综合征的诊断基准即腹围、血压、血清甘油三酯(中性脂肪)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)量、血 糖进行检查，自2008年4月起实施。由于对代谢综合征诊断者也进行保健指导，可提高国民对健康的意识，积极推动对生活习惯疾病的预防。以往，作为动脉硬化症的发病风险标记物，已知有高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)量、小粒子LDL(sdLDL)、载脂蛋白A、脂联素、CRP(C-reactive
Protein :C反应性蛋白)和AIP (Atherogenic Index of Plasma :血清动脉硬化指标)
坐寸οsdLDL是富含中性脂肪的LDL，与通常的LDL相比粒子尺寸小。较LDL易被氧化，动脉硬化诱发性高。载脂蛋白A是构成HDL的蛋白质，促进从细胞内排出胆固醇。脂联素是由脂肪细胞分泌的激素，具有增加胰岛素敏感性、抑制动脉硬化和抗炎症的作用。另外，血中浓度与内脏脂肪量负相关。CRP是发生体内炎症反应时生成的蛋白质，作为有慢性血管炎症这方面的动脉硬化的标记物而被关注。AIP是由血清中性脂肪量和HDL-C量计算的〔log (中性脂肪/HDL-C量)〕血清动脉硬化指标。另外，认为LDL的氧化是最有助于动脉硬化的发病原因。由于胆固醇的代谢、运输的异常而被氧化的LDL会导致巨噬细胞的泡沫化，另外还诱发由嗜中性细胞产生超氧化物，由此引起在血管内皮下的进一步脂质过氧化、脂质的蓄积等，促进疾病的发展。因此，抑制LDL的氧化对抑制动脉硬化的发病是极为有效的。另一方面，缩醛磷脂是甘油磷脂的一种，在甘油骨架的sn-Ι位上具有烯烃基链(乙烯基醚键)，在sn-2位上具有酰基链，在sn-3位上具有结合了碱的磷酸。天然存在的缩醛磷脂的主要烯烃基键的碳原子数为16 18，主要酰基链是碳原子数16 22的脂肪酸。另外，该磷酸所结合的主要的碱是胆碱和乙醇胺，分别称为胆碱型缩醛磷脂(以下有时称为CP)、乙醇胺型缩醛磷脂(以下有时称为EP)，例如，已知在哺乳类的心脏、骨骼肌中CP的比率高，在其脑、肾脏中EP的比率高。在人血浆中存在2 3mM的磷脂，它们是脂蛋白的构成成分。该总磷脂的60 75%是胆碱甘油磷脂，2 5%是乙醇胺甘油磷脂，10 20%是鞘磷脂。血浆中的缩醛磷脂浓度为O. I O. 3mM，其中约40%为CP，约60%为EP。S卩，约5%的胆碱甘油磷脂、约60%的乙醇胺甘油磷脂为缩醛磷脂。具有其他碱的缩醛磷脂在血中几乎不存在。作为缩醛磷脂的生理作用，报告有参与细胞融合、分泌作用的膜融合作用，参与信息传递、向生物大分子运输，作为易被氧化的多元不饱和脂肪酸的存储体的作用，和作为内源性抗氧化物质的作用等。另外，报告有人的遗传性缩醛磷脂缺乏呈现重度的精神发育迟滞、副肾功能障碍、白内障、听觉障碍或发育不全等病状，或阿尔茨海默氏症患者和老年人中血清缩醛磷脂的量 减少，暗示缩醛磷脂在生物体内发挥非常重要的作用(非专利文献I)。另外，已知在生成血中脂蛋白时，缩醛磷脂被优先导入，并且，由于其内源性的抗氧化能力，认为可作为LDL的氧化防御因子发挥作用。在专利文献I中，公开了如下内容，测定包括高脂血症者的中老年人组(148名，平均年龄65. 2岁)的血液的胆碱型缩醛磷脂和乙醇胺型缩醛磷脂量，CP/EP比与空腹时甘油三酯(指“中性脂肪”)和LDL尺寸(指“sdLDL”)分别显示显著的相关性(相关系数-O. 359和O. 402)，从而将CP/EP比用作预防生活习惯疾病的检查法。另外，非专利文献I进一步公开了总CP量或总EP量与HDL-C、载脂蛋白A-I和载脂蛋白A-II分别相关(相关系数> O. 28)。但是，专利文献I中记载的CP/EP比与空腹时甘油三酯(中性脂肪)和LDL尺寸(sdLDL)的相关，并且非专利文献I中记载的总CP量或总EP量与HDL-C、载脂蛋白A-I和载脂蛋白A-II的相关并不高，并不足以作为检测生活习惯疾病的标记物。现有技术文献 专利文献
专利文献I :日本特开2007-33410号公报 非专利文献
非专利文献I \ 一于卟才歹了七口 7夕口一夕7 T > K 卜口 >水7(Journal of Atherosclerosis and Thrombosis)，，2007 年，(日本)第 14 卷，ρ· 12-18。
发明内容
发明要解决的技术问题
在专利文献I中，记载了对有无冠状动脉狭窄、耐糖量异常、显著狭窄、年龄、性别、CAG、0GTT、高脂血症、耐糖量异常、身高、体重、ΒΜΙ、吸烟(根数/天、期间)、家族史、高血压症、痛风等检查项目，和血浆缩醛磷脂浓度、尿酸值、TC、空腹时TG、HDL、LDL、FBS、HbAlc,TC_2、TG_2、HDL_2、LDL_2、载脂蛋白A-I、载脂蛋白A-II、载脂蛋白B、载脂蛋白C-II、载脂蛋白C-III、载脂蛋白E、LP (A)、LP-F_PGR、脂蛋白a (HDL)、脂蛋白β (LDL)、前β脂蛋白(VLDL)、RLP-C, S_0’、S_120’、IRI_0’、IRI_120’、IRI_0’、IRI_120’、H0MA_IR、LPL、脂联素、MDA_LDL、LPL后、ApoB48前、ApoB48后、LDL_尺寸、磷脂浓度、胆碱型缩醛磷脂(CP)、乙醇胺型缩醛磷脂(EP)、CP/EP等检查项目进行测定，调查各项目间的相关性。并且，记载了空腹时甘油三酯(TG)、HDL2, CP/EP各值与LDL尺寸间具有显著的相关性，以及如前所述在CP/EP和空腹时甘油三酯(TG)之间具有显著的相关，但是没有记载其他检查项目间具有相关性。如前所述，在专利文献I中，在CP/EP比和空腹时甘油三酯(中性脂肪)，以及CP/EP比和sdLDL间可得到显著相关，但是相关系数稍低，分别为-O. 359和O. 402。另外，在非专利文献I中，总CP量与HDL-C、载脂蛋白A-I和载脂蛋白A-II的相关也并不高，分别为O. 308,0. 435 和 O. 241。其原因认为是，在专利文献I和非专利文献I中，作为测定血液中缩醛磷脂浓度的检查法，使三碘化物离子与提取脂质反应，使放射性碘特异地结合到脂质成分中的缩醛磷脂上，由于采用将其通过色谱法对CP和EP分别进行定量的方法，因而使用了放射性碘时的衰减率的影响等方面导致精度并不充分是一个原因。进而，在专利文献I和非专利文献I的缩醛磷脂测定方法中，由于未使用内标物质，测定间、测定日间或测定者间具有偏差，认为可能得不到充分的相关。因此，本发明的目的是提供在包括40 74岁的特定检诊对象人的宽范围的被试验者中，与代谢综合征或生活习惯疾病的现有标记物有闻相关的标记物，和提供代谢综合征或生活习惯疾病的有效的检测方法。进而，提供可显示代谢综合征或生活习惯疾病的风险或严重程度的标记物，进而提供代谢综合征或生活习惯疾病的风险或严重程度的分析方法。
用于解决技术问题的方法
本发明人等为了解决前述技术问题，首先，对于缩醛磷脂的分析方法，深入研究了更高精度的定量血液中缩醛磷脂的方法，结果获得下述见解在上述专利文献I中记载的检查法中，作为内标物质，使用I-烯基环状磷脂酸(1-alk-l’ -enyl-sn-glycerol-2, 3-cyclicphosphate(以下称为cAP))，由此可以形成精度进一步提高的分析法。并且，进而使用合成胆碱型缩醛磷脂作为内标物质，利用液相色谱串联质谱仪(以下称为LC-MS/MS)分析缩醛磷脂，由此能以高水平的精度进行结合于CP的sn-2位的脂肪酸的分析(CP的分子种类的分析)。利用前述使用内标物质的2种分析方法，将除严重疾病患者外的20 60岁的被试验者451人作为对象进行调查时，与总血清缩醛磷脂量进行比较，确认到CP量，特别是结合于sn-2位的脂肪酸为油酸的CP (以下称为C18 1CP)含量、或结合于sn_2位的脂肪酸为亚油酸的CP (以下称为C18 2CP)含量与HDL-C、中性脂肪、sdLDL、以及腹围、脂联素、AIP等动脉硬化症关联因子闻度相关。另外，发现总磷脂量和总CP量之比(以下称为“CP/PL”)和仅CP量相比，与前述动脉硬化症关联因子显示更高的相关。进而，发现总CP量和体重(以下称为“CP/体重”)之比，或总CP量和中性脂肪之比(以下称为“CP/中性脂肪”)与仅总CP量相比，也与前述动脉硬化症关联因子显示更高的相关。前述的测定项目与专利文献I中所示的标记物即CP/EP相比，各项目间的相关系数更高，与更多的项目相关，特别是，与肥胖症的关联因子即腹围、脂联素也相关，因此可知他们作为全面反应脂质代谢异常的标记物，有效性高。SP，本发明涉及
[1]代谢综合征或生活习惯疾病的检测方法，其特征在于，包括测定待检试样中的胆碱型缩醛磷脂浓度的步骤；
[2]根据[I]所述的代谢综合征或生活习惯疾病的检测方法，其中，前述胆碱型缩醛磷脂浓度是在sn-2位具有油酸的胆碱型缩醛磷脂，或在sn-2位具有亚油酸的胆碱型缩醛磷脂的浓度；[3]根据[I]或[2]所述的代谢综合征或生活习惯疾病的检测方法，其中，进一步包括测定选自待检试样中的磷脂的浓度磷脂浓度、待检试样中的中性脂肪浓度和被检者的体重中的值的步骤，和计算前述胆碱型缩醛磷脂浓度的测定值，与前述待检试样中的磷脂浓度的测定值、待检试样中的中性脂肪浓度的测定值、或被检者的体重的测定值之比的步骤；
[4]根据[1]_[3]中任一项所述的代谢综合征或生活习惯疾病的检测方法，其中，前述生活习惯疾病选自脂质异常症、高血压症和动脉硬化症；
[5]根据[1]_[3]中任一项所述的代谢综合征或生活习惯疾病的检测方法，其用于预防代谢综合征或生活习惯疾病的发病或用于监测治疗效果；
[6]根据权利要求1-5中任一项所述的代谢综合征或生活习惯疾病的检测方法，其中，作为缩醛磷脂的分析用内标物质，使用选自下述通式(I)(式中，R3是碳原子数4 26的烷基或烯基，M是氢原子或平衡阳离子)所示的I-烯基环状磷脂酸，
[化I]
权利要求
1.代谢综合征或生活习惯疾病的检测方法，其特征在于，包括测定待检试样中的胆碱型缩醛磷脂浓度的步骤。
2.根据权利要求I所述的代谢综合征或生活习惯疾病的检测方法，其中，所述胆碱型缩醛磷脂浓度是在sn-2位具有油酸的胆碱型缩醛磷脂、或在sn-2位具有亚油酸的胆碱型缩醛磷脂的浓度。
3.根据权利要求I或2所述的代谢综合征或生活习惯疾病的检测方法，其中，进一步包括测定选自待检试样中的磷脂的浓度磷脂浓度、待检试样中的中性脂肪浓度和被检者的体重中的值的步骤，和 计算所述胆碱型缩醛磷脂浓度的测定值与所述待检试样中的磷脂浓度的测定值、待检试样中的中性脂肪浓度的测定值、或被检者的体重的测定值之比的步骤。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的代谢综合征或生活习惯疾病的检测方法，其中，所述生活习惯疾病选自脂质异常症、高血压症和动脉硬化症。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的代谢综合征或生活习惯疾病的检测方法，其用于预防代谢综合征或生活习惯疾病的发病或用于监测治疗效果。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的代谢综合征或生活习惯疾病的检测方法，其中，作为缩醛磷脂的分析用内标物质，使用选自下述通式(I)所示的I-烯基环状磷脂酸和通式(2)所示的化合物中的化合物的至少一种， [化I]
7.代谢综合征或生活习惯疾病的检测试剂盒，其特征在于，作为缩醛磷脂的分析用内标物质，包含下述通式(I)所示的I-烯基环状磷脂酸， [化3]
8.代谢综合征或生活习惯疾病的检测试剂盒，其特征在于，作为缩醛磷脂的分析用内标物质，包含通式(2)所示的化合物，
全文摘要
提供在包括40～74岁的特定诊察对象的宽范围的被试验者中，与代谢综合征或生活习惯疾病的以往标记物有高相关的标记物，和提供代谢综合征或生活习惯疾病的有效的检测方法。前述课题可通过代谢综合征或生活习惯疾病的检测方法解决，该方法的其特征在于，包括测定待检试样中的胆碱型缩醛磷脂浓度的步骤。
文档编号G01N33/92GK102947708SQ20118002755
公开日2013年2月27日 申请日期2011年6月3日 优先权日2010年6月4日
发明者前场良太, 原博, M.西向, 山崎裕也, 根津亨 申请人:学校法人帝京大学, 国立大学法人北海道大学, 株式会社艾迪科