专利名称：单个b细胞培养方法
单个B细胞培养方法本文报导了得到由单个B细胞分泌的单克隆抗体的至少可变结构域的氨基酸序列的方法，所述单个B细胞是通过单细胞沉积和在饲养混合物存在下与饲养细胞共培养从来自实验动物的B细胞群中得到的。
背景技术：
为了得到分泌单克隆抗体的细胞,广泛使用Koehler和Milstein开发的杂交瘤技术。但是在杂交瘤技术中，只能融合和增殖从经免疫的实验动物中得到的B细胞的一部分。B细胞的来源通常是经免疫的实验动物的器官，例如脾。Zubler等人从1984年开始开发不同的方法用于得到分泌单克隆抗体的细胞(见例如 Eur. J. Immunol. 14(1984)357-63，J. Exp. Med. 160(1984) 1170-1183)。其中从经免疫的实验动物的血液中得到B细胞，并在包含细胞因子的饲养混合物的存在下与鼠EL-4B5饲
养细胞共培养。使用此方法，在共培养10-12天后可得到多达50ng/ml的抗体。ffeitkamp, J-H.，等人，(J. Immunol. Meth. 275(2003)223-237)报导了从用荧光病毒样颗粒选择的单个抗原特异性B细胞中生成针对轮状病毒的重组人单克隆抗体。在US2006/0051348中报导了生产针对多种同源抗原的多种分离的抗体的方法。在W02008/144763和W02008/045140中分别报导了针对IL-6的抗体及其用途，以及得到抗原特异性B细胞的克隆群的培养方法。在US2007/0269868中报导了得到抗原特异性B细胞的克隆群的培养方法。Masri等人(在Mol. Immunol. 44 (2007) 2101-2106中)报导了在大肠杆菌(E. coli)中克隆和表达功能性Fab片段，所述片段从针对炭疽毒素的单个人淋巴细胞中得到。在W02007/031550中报导了制备免疫球蛋白文库的方法。发明概沭本文报导了从具有特殊性质的B细胞群中分离B细胞的方法。首先，在实验动物第一次免疫后4周内已经可以分离诱导的抗体生产细胞，并可测定抗体的结合特异性。其次，可通过以下任一步骤提高抗体生产细胞的数量和/或质量(例如抗体生产/分泌能力)i)预孵育步骤，和/或ii)离心步骤，和/或iii)淘选步骤。第三，可通过加入IL-21，或IL-6，或SAC，或BAFF改善用于B细胞和饲养细胞共培养的饲养混合物。因此，在一个方面本文报导了选择B细胞的方法，所述方法包括以下步骤a)任选地标记B细胞群的B细胞，b)单独地共培养已沉积为单细胞的B细胞群的每个B细胞和饲养细胞，c)选择在步骤b)中增殖并分泌抗体的B细胞。在一个方面，本文还报导了得到B细胞克隆的方法，所述方法包括以下步骤a)从实验动物中得到B细胞，b)标记B细胞，c)将标记的B细胞沉积为单细胞，d)单独地共培养单细胞沉积的B细胞和饲养细胞，e)选择在步骤d)中增殖并分泌抗体的B细胞并因此得到B细胞克隆。在另一个方面，本文报导了生产特异性结合靶抗原的抗体的方法，所述方法包括以下步骤a)任选地用至少一种荧光染料标记B细胞群的细胞，b)在饲养细胞和饲养混合物的存在下培养已在单独的容器中沉积为单细胞的B细胞群的每个B细胞，以得到单独的B细胞克隆和培养物上清液，c)选择生产特异性结合靶抗原的抗体的B细胞克隆，d)培养含有编码特异性结合靶抗原的抗体的核酸的细胞，所述抗体由步骤c)中选择的B细胞克隆生产，或为其人源化变体，并从细胞或培养物上清液中回收抗体，从而生产抗体。在一个实施方案中，所述方法包括一个或多个以下步骤在步骤c)后cl)通过逆转录酶PCR测定编码抗体的可变轻链结构域和可变重链 结构域的核酸序列，在步骤Cl)后c2)用包含编码抗体可变轻链结构域和可变重链结构域的核酸序列的核酸转染细胞。在一个方面，本文还报导了生产抗体的方法，所述方法包括以下步骤a)提供(成熟的)B细胞群(从实验动物的血液中得到)，b)用至少一种荧光染料(在一个实施方案中用I至3种，或2至3种荧光染料)标记B细胞群的细胞，c)在单独的容器中沉积经标记的B细胞群的单个细胞(在一个实施方案中，容器是多孔板的孔)，d)在饲养细胞和饲养混合物的存在下培养沉积的各个B细胞(在一个实施方案中，饲养细胞是EL-4B5细胞，在一个实施方案中，饲养混合物是天然TSN，在一个实施方案中，饲养混合物是合成的饲养混合物)，e)测定在各个B细胞的培养基中分泌的抗体的结合特异性，f)通过逆转录酶PCR和核苷酸测序来测定特异性结合抗体的可变轻和重链结构域的氨基酸序列，并从而得到单克隆抗体可变轻和重链结构域的编码核酸，g)为了表达抗体，将单克隆抗体可变轻和重链可变结构域编码核酸引入表达盒，h)将核酸引入细胞，i)培养细胞并从细胞或细胞培养物上清液中回收抗体，并从而生产抗体。在本文报导的所有方面的一个实施方案中，所述方法包括在单细胞沉积以前，在共培养培养基中孵育B细胞群的步骤。在一个实施方案中，在约37° C进行孵育。在一个实施方案中，孵育进行O. 5至2小时。在特定的实施方案中，孵育进行约I小时。在一个实施方案中，在约37° C进行孵育约I小时。在本文报导的所有方面的一个实施方案中，所述方法包括在共培养以前离心单细胞沉积的B细胞的步骤。在一个实施方案中，离心进行约I分钟至约30分钟。在特定的实施方案中，离心进行约5分钟。在一个实施方案中，以约IOOx g至约1，OOOx g进行离心。在特定的实施方案中，以约300x g进行离心。在一个实施方案中，以约300x g离心约5分钟。在本文报导的所有方面的一个实施方案中，所述方法包括紧接标记步骤以前的以下步骤用固定的抗原淘选B细胞。
在本文报导的所有方面的一个实施方案中，通过密度梯度离心从动物血液中得到B细胞群。在本文报导的所有方面的一个实施方案中，在免疫后4天从实验动物血液中得到B细胞群。在另一个实施方案中，从在免疫后从4天到至少9天的实验动物血液中得到B细胞群。在进一步的实施方案中，从在免疫后从4天到9天的实验动物血液中得到B细胞群。在本文报导的所有方面的一个实施方案中，通过密度梯度离心分离B细胞群。在本文报导的所有方面的一个实施方案中，B细胞是成熟的B细胞。在本文报导的所有方面的一个实施方案中，用I至3种荧光染料进行标记。在特定的实施方案中，用2至3种荧光染料进行标记。
在本文报导的所有方面的一个实施方案中，B细胞的标记导致总B细胞群的O. 1%至2. 5%的细胞的标记。在本文报导的所有方面的一个实施方案中，B细胞是小鼠B细胞，或仓鼠B细胞，或兔B细胞。在本文报导的所有方面的一个实施方案中，在多孔板的孔中进行单细胞沉积。在本文报导的所有方面的一个实施方案中，饲养细胞是鼠EL-4B5细胞。在本文报导的所有方面的一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在本文报导的所有方面的一个实施方案中，标记是IgG+CD19+-B细胞，IgG+⑶38+-B细胞，IgG+CD268+-B 细胞，IgGTD138+_B 细胞，CD27+CD138+-B 细胞，或 CD3-CD27+-B 细胞。在本文报导的所有方面的一个实施方案中，所述B细胞是小鼠来源的，且标记是IgG+CD19+-B 细胞，和 / 或 IgGTD138+-B 细胞。在本文报导的所有方面的一个实施方案中，所述B细胞是仓鼠来源的，且标记是IgG+IgIT-B 细胞。在本文报导的所有方面的一个实施方案中，所述B细胞是兔来源的，且标记是IgG+-B 细胞和 / 或 CD138+-B 细胞，或 CD138+IgG+_B 细胞和 / 或 IgG+Igif-B 细胞。在本文报导的所有方面的一个实施方案中，所述共培养是在补充了 10% (v/v)FCS,包含青霉素和链霉素的1% (w/v)的200mM谷氨酰胺溶液，2% (v/v)的IOOmM丙酮酸钠溶液，和1% (v/v)的1Μ2-(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪)-乙烷磺酸(HEPES)缓冲液的RPMI1640培养基中。在另一个实施方案中，所述共培养培养基还包含O. 05πιΜβ-巯基乙醇。在本文报导的所有方面的一个实施方案中，B细胞与饲养细胞和饲养混合物共培养。在一个实施方案中，所述饲养混合物是天然的胸腺细胞培养物上清液(TSN)或合成的饲养混合物。在一个特定的实施方案中，所述饲养混合物是合成的饲养混合物。在一个实施方案中，所述合成的饲养混合物包含白介素-I β和肿瘤坏死因子a。在一个实施方案中，所述合成的饲养混合物包含白介素-2 (IL-2)和/或白介素-10 (IL-10)。在一个实施方案中，所述合成的饲养混合物还包含金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cowans菌株细胞(SAC)。在一个实施方案中，所述合成的饲养混合物包含白介素-21 (IL-21)。在一个实施方案中，所述合成的饲养混合物包含肿瘤坏死因子家族的B细胞活化因子(BAFF)。在一个实施方案中，所述合成的饲养混合物包含白介素-6 (IL-6)。在一个实施方案中，所述合成的饲养混合物包含白介素-4(IL-4)。
在一个实施方案中，在存在胸腺细胞培养物上清液作为饲养混合物时进行共培养。在特定的实施方案中，从年轻动物胸腺的胸腺细胞中得到胸腺细胞培养物上清液。在一个实施方案中，得到B细胞克隆的方法还包括以下步骤㈡通过逆转录酶PCR和核苷酸测序测定由步骤e)的选择的B细胞克隆生产的抗体的可变轻和重链结构域的氨基酸序列，并从而得到单克隆抗体氨基酸可变结构域序列。在一个实施方案中，所述实验动物选自小鼠、仓鼠和兔。发明详沭本文报导的方法允许快速表征从单独的B细胞克隆得到的单克隆抗体的结合特异性，即在实验动物的第一次免疫4周内可分离诱导的抗体生产细胞，并可测定从其生产的抗体的结合特异性，其中根据B细胞共培养物上清液中的抗体量/浓度可进行至少4种不同的实验。·免疮通常使用非人动物，例如小鼠、兔、仓鼠和大鼠作为评估基于抗体的疗法的动物模型。因此，经常需要提供结合非人动物抗原以及人抗原的交叉反应性抗体。本文报导的方法可用于提供交叉反应性抗体。在本文报导的方法中，可使用从例如小鼠、仓鼠和兔中得到的B细胞。在一个实施方案中，小鼠是NMRI-小鼠或balb/c-小鼠。在另一个实施方案中，仓鼠选自亚美尼亚仓鼠(灰仓鼠(Cricetulus migratorius))、中国仓鼠(黑线仓鼠(Cricetulus griseus))和叙利亚仓鼠(金黄仓鼠(Mesocricetulus auratus))。在特定的实施方案中，仓鼠是亚美尼亚仓鼠。在一个实施方案中，兔选自新西兰白(NZW)兔、齐默尔曼兔(ZIKA)、Alicia突变株兔、basilea突变株兔、具有人免疫球蛋白基因座的转基因兔、rblgM敲除兔，及其杂种。在一个实施方案中，选择进行免疫的实验动物，例如小鼠、仓鼠和兔不大于12周。B细胞的来源和分离实验动物的血液提供了高多样性的抗体生产B细胞。从中得到的B细胞分泌的抗体在⑶R内几乎不具有相同或重叠的氨基酸序列，因此显示了高多样性。在一个实施方案中，得到从免疫后4天直到免疫或最近的加强后至少9天的实验动物的B细胞，例如来自血液的B细胞。此时间跨度允许本文报导的方法中的高灵活性。在此时间跨度中，提供大部分亲族(affine)抗体的B细胞可能从脾迁移至血液(见例如 Paus, D.，等人，JEM203 (2006) 1081-1091 ；Smith, K. G. S.,等人，EMBOJ. 16(1997)2996-3006 ；fframmert, J.，等人，Nature453 (2008) 667-672)。可使用本领域技术人员已知的任意方法得到实验动物血液中的B细胞。例如，可使用密度梯度离心(DGC)或红血细胞裂解(裂解)。密度梯度离心相比低渗裂解提供了更高的总产量，即B细胞克隆数。另外，在通过密度梯度离心得到的细胞中，较多的细胞在共培养步骤中分裂和生长。分泌的抗体浓度相比用不同的方法得到的细胞也更高。因此，在一个实施方案中，通过密度梯度离心提供B细胞群。表I :通过密度梯度离心(DGC)或红细胞的低渗裂解得到细胞时，IgG生产孔/细胞克隆的数目I小 鼠，裂I仓鼠，I仓鼠，裂 __DGC 解__PGC 解_分离的细胞 1.7 士 0.2 1.6±0.1 2.1 士 0.2 0.9 ±0.1
数[X IO6]__(n= 2)__(η= 2)__(η= 2)__(η- 2)
HgG+-孔[%] I 22 I 12 I 76 —共培养以前的选择步骤可从外周血单核细胞(PBMC)中富集生产特异性结合抗原的抗体的B细胞。因此，在本文报导的所有方法的一个实施方案中，从外周血单核细胞(PBMC)中富集B细胞群。术语“特异性结合”及其语法等同形式表示抗体以IO-7M或更小，在一个实施方案中以10_8Μ至10_13Μ，在另一个实施方案中，以10_9Μ至10_13Μ的解离常数(Kd)结合其靶。此 术语还用于表示抗体不特异性结合存在的其他生物分子，即其以10_6Μ或更大，在一个实施方案中以KT6M至IM的解离常数(Kd)结合其他生物分子。在本文报导的所有方法的一个实施方案中，去除PBMC中的巨噬细胞。如下所述，这是有利的，例如在兔来源的B细胞的一个实施方案中，用于共培养步骤。可通过黏附至细胞培养板表面去除巨噬细胞(见预培养步骤)。在本文报导的方法的一个实施方案中，细胞来自用蛋白质免疫的动物，并在标记以前去除巨噬细胞。已发现，相比在从实验动物血液中分离和任选地富集B细胞群后直接单细胞沉积，在单细胞沉积以前在共培养培养基中孵育B细胞群提高了在单细胞沉积后得到的抗体分泌细胞的总数(以兔为例，见表2a和2b)。特别地，在EL-4B5培养基中在约37° C下孵育约I小时，例如使用细胞培养箱。表2a :在所有细胞的单细胞沉积以前，在EL-4B5培养基中孵育或没有孵育I小时的IgG阳性孔/细胞克隆(rb =兔).
新鲜的PBMC 孵育后的PBL* (0rblgG ELISA__(0 100-20 细胞)50-10 细胞)
rblgG+ 孑 L[n]__40__
28I75^~*去除巨噬细胞和单核细胞表2b :在B细胞单细胞沉积以前，在EL-4B5培养基中孵育或没有孵育I小时的IgG阳性孔/细胞克隆
来自血液的
来自新鲜的单个B细来自新鲜的来自脾的单个PBMC的单胞，孵育脾细胞的单B细胞，孵育rblgG ELISA__个 B 细胞 I h___个 B 细胞 I h_
孔—255652
[π] _________
rbigO 孑L^ηn II2133丨7_I31在本文报导的方法的一个实施方案中，从用经蛋白质免疫的动物中得到细胞并去除巨噬细胞。
通过使用淘选方法，可分别减少不产生结合抗原的抗体的细胞或同样地富集产生结合抗原的抗体的细胞。其中存在与表面结合的结合伙伴，如果进一步处理结合的细胞，则在细胞群中选择性富集与其结合的细胞，或如果进一步处理溶液中剩余的细胞，则在细胞群中减少与其结合的细胞。表3 :通过用各自的抗原淘选，富集分泌抗原特异性抗体的B细胞
权利要求
1.选择B细胞的方法，所述方法包括以下步骤 a)与饲养细胞共培养B细胞群的每个B细胞，所述每个B细胞已沉积为单细胞， b)选择步骤a)中增殖和分泌抗体的B细胞克隆。
2.生产与靶抗原结合的抗体的方法，所述方法包括以下步骤 a)在饲养细胞和饲养混合物的存在下共培养B细胞群的每个B细胞，所述每个B细胞已在单独的容器中沉积为单细胞， b)选择生产与靶抗原特异性结合的抗体的B细胞克隆， c)培养细胞，所述细胞含有编码由步骤b)中选择的B细胞克隆生产的抗体或其人源化变体的核酸，并从细胞或培养上清液回收抗体，并从而生产抗体。
3.根据前述权利要求任一项的方法，所述方法还包括在单细胞沉积以前在共培养培养基中孵育B细胞群的步骤。
4.根据权利要求3的方法，所述方法特征在于孵育为在约37°C进行约I小时。
5.根据前述权利要求任一项的方法，所述方法还包括在共培养以前离心单细胞沉积的B细胞的步骤。
6.根据权利要求5的方法，所述方法特征在于离心为以约300xg进行约5分钟。
7.根据前述权利要求任一项的方法，所述方法特征在于通过密度梯度离心分离B细胞群。
8.根据前述权利要求任一项的方法，所述方法特征在于B细胞是成熟的B细胞。
9.根据前述权利要求任一项的方法，所述方法特征在于用2或3种荧光染料进行标记。
10.根据前述权利要求任一项的方法，所述方法特征在于标记O.1%至2. 5%的总B细胞群的细胞。
11.根据前述权利要求任一项的方法，所述方法特征在于B细胞是小鼠B细胞，或仓鼠B细胞，或兔B细胞。
12.根据前述权利要求任一项的方法，所述方法特征在于饲养细胞是鼠EL-4B5细胞。
13.根据前述权利要求任一项的方法，所述方法特征在于在补充了10% (v/v)FCS，包含青霉素和链霉素的1% (w/v)的200mM谷氨酰胺溶液，2% (v/v)的IOOmM丙酮酸钠溶液，和1% (v/v)的1Μ2-(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪)_乙烷磺酸(HEPES)缓冲液的RPMI1640培养基中进行共培养。
14.根据权利要求1-10和12-13中任一项的方法，所述方法特征在于B细胞是小鼠来源的并且标记是IgG+⑶19+-B细胞，和/或IgG_CD138+-B细胞。
15.根据权利要求1-10和12-13中任一项的方法，所述方法特征在于B细胞是仓鼠来源的并且标记是IgG+IgM_-B细胞。
16.根据权利要求1-10和12-13中任一项的方法，所述方法特征在于B细胞是兔来源的并且标记是IgG+-B细胞和/或⑶138+-B细胞，或⑶138+IgG+-B细胞和/或IgG+IgM__B细胞。
17.根据前述权利要求任一项的方法，所述方法特征在于在合成的饲养混合物的存在下进行共培养，所述合成的饲养混合物包含白介素-I β和肿瘤坏死因子α，和白介素-2和白介素_10和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)Cowans菌株细胞。
18.根据权利要求1-16中任一项的方法，所述方法特征在于在合成的饲养混合物的存在下进行共培养，所述合成的饲养混合物包含白介素-I β和肿瘤坏死因子α，和白介素-2和白介素-10和白介素-21。
19.根据权利要求1-16中任一项的方法，所述方法特征在于在合成的饲养混合物的存在下进行共培养，所述合成的饲养混合物包含白介素-I β和肿瘤坏死因子α，和白介素-2和白介素-10和肿瘤坏死因子家族的B细胞活化因子(BAFF)。
20.根据权利要求1-16中任一项的方法,所述方法特征在于在作为饲养混合物的胸腺细胞培养上清液的存在下进行共培养。
21.根据权利要求20的方法，所述方法特征在于胸腺细胞培养上清液是从年轻动物胸腺的胸腺细胞得到的。
全文摘要
本文报导了得到B细胞的方法，其包括以下步骤a)标记B细胞，b)将标记的B细胞沉积为单细胞，c)和饲养细胞共培养单细胞沉积的B细胞，d)选择步骤c)中增殖和分泌IgG的B细胞并从而得到B细胞。标记可以是IgG+CD19+-B细胞、IgG+CD38+-B细胞、IgG+CD268+-B细胞、IgG-CD138+-B细胞、CD27+CD138+-B细胞或CD3-CD27+-B细胞。所述方法可包括在沉积步骤以前，在EL-4B5培养基中在37℃孵育1小时所述B细胞的步骤。所述方法还可包括在共培养以前离心所述单细胞沉积的B细胞的步骤。在共培养中，可使用包含白介素-1β和肿瘤坏死因子α和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cowans菌株细胞或BAFF或白介素-2和/或白介素-10和/或白介素-6和/或白介素-4的饲养混合物。
文档编号G01N33/50GK102918395SQ201180026559
公开日2013年2月6日 申请日期2011年5月26日 优先权日2010年5月28日
发明者J·恩德尔, N·舒马赫尔, S·奥夫纳, J·普拉策尔, B·西韦, I·托雷 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司