专利名称：维生素d化合物的释放制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于释放与维生素D-结合蛋白结合的维生素D化合物的试剂组合物(reagent composition),用于检测维生素D化合物的体外方法,其中通过使用该试剂组合物，使得所述维生素D化合物从维生素D-结合蛋白释放，且还涉及以该方式获得的试剂混合物。本发明还涉及所披露的用于释放维生素D化合物的试剂组合物的用途以及用于检测维生素D化合物的试剂盒，其含有除常见检测试剂之外的用于释放维生素D化合物的试剂组合物。
背景技术：
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维生素D的充分供给是极其重要的，如术语“维他命(vitamin) ”早已暗示的那样。维生素D的缺乏导致严重的疾病诸如佝偻病或者骨质疏松。虽然在上个世纪的早期，维生素D仍然被看作一种单一物质，但是在过去的几十年内，维生素D系统已经变为一种维生素D代谢产物的复杂且多样的网络。如今，40种以上的不同的维生素D代谢产物是已知的(Zerwekh, J. E. , Ann. Clin. Biochem. 41 (2004) 272-281)。人类只能通过来自阳光的紫外线作用于皮肤上而产生D3维生素或者维生素D2(CalCiferols)。在血液中，维生素D3结合到所谓的维生素D-结合蛋白，并将其输送到肝脏中，在此通过25-羟基化作用将其转化为25-羟基维生素D3。除皮肤和肝脏之夕卜，许多其它组织目前已知涉及维生素D新陈代谢，而上述两个器官早已在下述文献中提及(Schmidt-Gayk, H. et al. (eds.), “Calcium regulating hormones, vitamin Dmetabolites and cyclic AMP^, SpringerVerlag, Heidelberg(1990)pp. 24-47) 25-轻基维生素D，更具体地说，25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3,就其数量而言，是人有机体中的重要存储形式。当需要时，这些前体可以在肾中转化而形成生物活性的Ia，25_ 二羟基维生素D，所谓的D激素。生物活性的维生素D调节从肠的钙摄取、骨矿化，并且影响许多其它代谢途径诸如胰岛素体系。测量维生素D水平本身是没有多少益处的，当测定患者的维生素D状况时，因为取决于食物摄取或者暴露于阳光，维生素D (维生素D2和维生素D3)的浓度变化很大。另外，在循环(24小时)中维生素D具有较短的生物半衰期，因此出于这种原因也不是合适的测定患者的维生素D状况的参数。同样也适用于生理活性形式的维生素D (1，25- 二羟基维生素D)。相比于25-羟基维生素D而言，这些生物活性形式同样以较小的且较大波动的浓度存在。由于全部这些原因，特别地，25-羟基维生素D的量化是一种合适的全面分析患者的总的维生素D状况的手段。维生素D代谢产物如25-羟基维生素D以高亲和性由维生素D-结合蛋白结合且也以受限的程度与白蛋白和一些脂蛋白结合。在正常情况下适于从维生素D-结合蛋白释放维生素D代谢产物的方法相比于从任何其它蛋白释放维生素D代谢产物而言将是非常适当的。25-羟基维生素D或者其它维生素D化合物对维生素D-结合蛋白的结合使得维生素D化合物的确定极大地复杂化。全部已知的方法要求待分析的维生素D化合物从其与维生素D-结合蛋白形成的复合物中释放或者分离。在下文中，为了简化的目的，这被称为从维生素D-结合蛋白中释放维生素D化合物，虽然当然其只能从维生素D化合物和维生素D-结合蛋白的复合物中，而不是单独地从维生素D-结合蛋白中被释放。维生素D-结合蛋白在酸性pH条件下为未折叠的，但在pH重新变为中性条件时，其具有正确重折叠且重新结合分析物的高趋势。因此，通常需要首先释放维生素D化合物，然后将所述维生素D-结合蛋白与待分析的维生素D化合物分离。由于2 5-羟基维生素D的高的临床价值，许多方法从文献中是已知的，这使得25-羟基维生素D可以或多或少被可靠地确定。 Haddad, J. G. et al.，J. Cl in. Endocrinol. Metab. 33 (1971) 992-995,和Eisman, J. A. et al. , Anal. Biochem. 80 (1977) 298-305 例如描述了使用高效液相色谱(HPLC)确定血液样品中25-羟基维生素D的浓度。其它确定25-羟基维生素D的方法尤其是基于使用维生素D-结合蛋白，如牛奶中存在的那些。因此，Holick, M. F. and Ray, R. (US 5, 981, 779)以及 DeLuca et al. (EP O583 945)描述了用于羟基维生素D和二羟基维生素D的维生素D测定，其基于这些物质结合到维生素D-结合蛋白，其中这些物质的浓度是通过竞争性测试程序确定的。然而，这种方法的先决条件是待确定的维生素D代谢产物首先需要从原始的血液或者血清样品中分离并且必需通过例如色谱进行纯化。Armbruster, F. P. et al. (W0 99/67211)教导了为通过乙醇沉淀法进行维生素D确定，应当制备血清或者血浆样品。在这种方法中，通过离心作用除去蛋白质沉淀物，并且乙醇(ethanolic)上清液包含可溶维生素D代谢产物。这些可以在竞争性结合测定中进行测量。可选择地，EP O 753 743教导了使用高碘酸盐，蛋白质可以和血液或者血清样品分离。在这种情况下，在获自用高碘酸盐处理的样品的不含蛋白质的上清液中确定维生素D化合物。在一些商业测试中，乙腈被推荐用于萃取血清或者血浆样品(例如，在DiaSorin的放射免疫测定中或者在“Immundiagnostik”公司的维生素D测试中)。最近几年中，许多不同的释放试剂被提出，其原则上应当适于从样品中存在的任何结合蛋白中释放维生素D化合物。然而,这种释放或者脱附(detachment)应当在相对温和条件下进行，使得能够在结合测试中直接使用用释放试剂处理的样品(参见例如WO02/57797和US 2004/0132104)。最近几年中虽然进行了很多努力，但是用于确定维生素D的所有可得的方法具有缺点，诸如费力的样品制备，差的标准化，测试程序间的差的一致性或者加料(spiked)维生素D的差的回收(就此特别参见Zerwekh, J. E.，见上文)。在US 7，087，395中，金属氢氧化物和环糊精及其衍生物以及金属水杨酸盐已经用于从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物，这导致了维生素D-结合蛋白或者其它血清蛋白的不可逆的变性。表面活性剂如Triton X100或者Tween-20已经用于防止维生素D化合物与变性后的样品中的脂质和蛋白进行非特异性结合。特别难以使维生素D化合物的测试自动化。自动化要求解决非常困难的问题，即钢丝行走生存(surviving a tightrope walk):一方面,必需在合适的释放试剂的帮助下从维生素D-结合蛋白中释放维生素D化合物，另一方面，条件必需被选择使得所述样品可以直接进行进一步的分析。这种直接进一步的分析的先决条件是，一方面，内源性维生素D-结合蛋白在这种分析期间没有结合或者不再显著地结合维生素D化合物并由此不妨碍这种分析，而另一方面，所用的释放试剂没有妨碍检测试剂诸如抗体或维生素D-结合蛋白的结合。另外，众所周知，维生素D-结合蛋白的不同的等位基因存在于人群中，其生物化学行为不同。维生素D化合物的释放和测量应当对于各种等位基因/表型是可比较的。因此，本发明的目的是开发一种用于维生素D化合物且特别是用于羟基维生素D化合物从样品中的维生素D-结合蛋白的释放的试剂组合物，其可以至少部分地解决现有技术的问题。在下文中描述了并且由所附权利要求涵盖了用于释放维生素D化合物的合适的试剂组合物、用于确定维生素D化合物的体外方法、试剂组合物的用途和使用该试剂组合物的用于确定维生素D化合物的试剂盒
发明内容
本发明涉及用于从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物的体外方法，包括以下步骤a)提供待研究的样品；以及b)使步骤(a)的样品与以下物质混合i)含有浓度为O. IM至2. OM的碳酸氢盐或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HC03_)的物质的试剂，ii)还原剂，和iii)碱化剂，由此从维生素D-结合蛋白释放所述维生素D化合物。在另外的实施方案中，本发明涉及用于测量维生素D化合物的体外方法，包括以下步骤a)提供待研究的样品；b)使步骤(a)的样品与以下物质混合i)含有浓度为O. IM至2. OM的碳酸氢盐或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCCV)的物质的试剂， )还原齐U，和iii)碱化剂，由此从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物；以及c)测量步骤(b)中释放的维生素D化合物。在另外的实施方案中，本发明涉及用于从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物的试剂组合物，包含浓度为O. IM至2. OM的碳酸氢盐或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO3O的物质，以及还原剂。在另外的实施方案中，本发明涉及试剂混合物，其包含待研究的样品、用于从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物的试剂组合物以及碱化剂，所述试剂组合物包含浓度为
O.IM至2. OM的碳酸氢盐或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HC03_)的物质，以及还原剂。在另外的实施方案中，本发明涉及用于从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物的试剂盒，其含有包含浓度为O. IM至2. OM的碳酸氢盐或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HC03_)的物质以及还原剂的试剂组合物。
具体实施例方式本发明涉及用于从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物的体外方法，包括以下步骤a)提供待研究的样品；b)使步骤(a)的样品与以下物质混合i)含有浓度为O. IM至2. OM的碳酸氢盐或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HC03_)的物质的试剂， )还原剂，和iii)碱化剂，由此从维生素D-结合蛋白释放所述维生素D化合物。如本申请所使用，以下各术语具有与其在该部分相关的含义。本申请使用的冠词〃 一个〃和〃 一种〃是指一个或者多于一个(即至少一个)的合乎语法的物品对象(grammatical object of the article)。
表述“一个或者多个”是指I至50，优选I至20，也优选2、3、4、5、6、7、8、9、10、12
或者15。如果没有另外叙述，术语“维生素D化合物”将被理解为包括包含根据以下结构式I和II的维生素D2的主链或维生素D3的主链的所有化合物。式I
权利要求
1.用于从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物的体外方法，包括以下步骤 a)提供待研究的样品以及 b)使步骤(a)的样品与以下物质混合 i)含有浓度为O.IM至2. OM的碳酸氢盐或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HC03_)的物质的试剂， ii)还原剂，和 iii)碱化剂， 由此从维生素D-结合蛋白释放所述维生素D化合物。
2.权利要求I的方法，其中所述步骤(i)的试剂在用于从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物的适当条件下在水溶液中为可溶的。
3.权利要求I至2中任一项的方法，其中所述步骤(i)的试剂含有浓度为O.IM至2. OM的碳酸氢盐。
4.权利要求I至2中任一项的方法，其中所述步骤(i)的试剂含有浓度为O.IM至2. OM的能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO3-)的物质。
5.权利要求1、2和4中任一项的方法，其中能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCCV)的所述物质为环状或者非环状的碳酸酯或者其各自的羟基化或者卤化衍生物。
6.权利要求I至5中任一项的方法，其中所述样品为液体样品。
7.权利要求I至5中任一项的方法，其中所述样品为血液、血清或者血浆。
8.用于测量维生素D化合物的体外方法，包括以下步骤 a)根据权利要求I至7中任一项的方法从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物，以及 b)测量步骤(a)中释放的维生素D化合物。
9.权利要求8的方法，其中所述维生素D化合物选自25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、24，25- 二羟基维生素D2、24，25- 二羟基维生素D3和C3-表-25-羟基维生素D。
10.权利要求9的方法，其中确定了所述维生素D化合物为25-羟基维生素D2和/或者25-羟基维生素D3。
11.用于从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物的试剂组合物，包含选自以下的物质浓度为O. IM至2. OM的碳酸氢盐或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HC03_)的物质，以及还原剂。
12.权利要求11的试剂组合物，其特征在于所述还原剂选自2-巯基乙醇、2-巯基乙胺-HC1、TCEP、半胱氨酸-HC1、二硫苏糖醇(DTT)、N-甲基马来酰亚胺、Ellman试剂和1，2- 二硫杂环戊烷-3-羧酸。
13.权利要求11的试剂组合物，其特征在于所述还原剂选自2-巯基乙醇、2-巯基乙胺-HCl、TCEP、半胱氨酸-HCl和二硫苏糖醇(DTT)。
14.权利要求11至13中任一项的试剂组合物，其特征在于所述还原剂具有2mM至30mM的浓度。
15.试剂混合物，包含待研究的样品、权利要求11至14中任一项的试剂组合物以及碱化剂。
16.权利要求15的试剂混合物，其特征在于所述碱化剂选自NaOH、KOH、Ca(OH)2和LiOH。
17.权利要求11至14中任一项的试剂组合物以及碱化剂在将维生素D化合物从维生素D-结合蛋白释放中的用途。
18.用于从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物的试剂盒，其含有权利要求11至14中任一项的试剂组合物。
19.用于检测从维生素D-结合蛋白释放的维生素D化合物的试剂盒，其含有权利要求11至14中任一项的试剂组合物以及碱化剂。·
全文摘要
本发明涉及用于释放与维生素D-结合蛋白结合的维生素D化合物的试剂组合物，用于检测维生素D化合物的体外方法，其中通过使用该试剂组合物，使得所述维生素D化合物从维生素D-结合蛋白释放，且还涉及以该方式获得的试剂混合物。所使用的试剂含有浓度为0.1M至2.0M的碳酸氢盐或者能够在水解后释放碳酸氢根离子(HCO3-)的物质。本发明还涉及所披露的用于释放维生素D化合物的试剂组合物的用途以及用于检测维生素D化合物的试剂盒，其含有常见检测试剂之外的用于释放除维生素D化合物的试剂组合物。
文档编号G01N33/82GK102906570SQ201180024919
公开日2013年1月30日 申请日期2011年5月18日 优先权日2010年5月20日
发明者S.安东尼, C.沃格尔 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司