专利名称：多发性骨髓瘤的分子分类的制作方法
技术领域：
本发明属于分子诊断学领域，并涉及用于对从被诊断患有多发性骨髓瘤的患者获得的样品进行分类的方法。本发明还涉及用于确定被诊断患有多发性骨髓瘤的个体的预后的方法，以及用于预测被诊断患有多发性骨髓瘤的个体对治疗的响应的方法。
背景技术：
已经出版了几份讨论在新诊断患有丽的患者中基于RNA微阵列技术来确定基因表达情况的研究报告。η已开发了两种主要的遗传分类系统，即易位和周期蛋白D (TC)分类以及 UAMS (阿肯色医科大学(University of Arkansas for Medical Science))骨髓瘤分子分类。TC分类根据被初始IgH易位和周期蛋白D基因的转录活化解调控的基因的过表达，区分出8个亚类。7UAMS骨髓瘤分子分类鉴定出7个以独特基因表达情况为特征的肿瘤组，包括易位组群 MS (t(4;14))、MF (t(14;16)/t(14;20)WPCD-l/2 (t(ll;14)和t(6; 14))，以及超二倍体组群、HY、具有增殖相关基因的组群(PR)以及没有显著标志但以低 百分率的骨病为特征的组群(LB)。5将具有已确定的多发性骨髓瘤诊断的患者分类成不同组群是重要的，因为已发现，这些组群中的患者可能对疗法具有不同响应和/或具有更好的预后。
发明内容
从主要为北欧高加索人对象诊断多发性骨髓瘤时获得的320个样品的无监督分层聚类，产生了 10个组群的亚类，而不是现有技术中公开的7个或8个组群。本发明提供了三个新的组群，已发现它们适合于多发性骨髓瘤患者的分类，即组群 NF κ B、CTA 和 PRL3。一方面，本发明涉及将被诊断患有多发性骨髓瘤的患者分类到NF κ BXTA或PRL3中的至少一个组群的方法，所述方法包括测定从所述患者分离的样品中某些基因的表达水平的步骤，其中如果选自CDC42、BCL10、IL8、GADD45B、NFKBIE和MIRN155的至少两个基因过表达，则所述患者被分类到组群NF κ B中，或者如果选自HIST1H2BG、GINSl、CDC2、MAGEA3、BIRC5、MAGEA6、MAGEAl2, PAGEl、PTTGl和GAGE的至少两个基因过表达，则分类到组群CTA中，或者如果选自PRL3、PTPRZ1、S0CS3和SMYD3的至少两个基因过表达，则分类到组群PRL3中。选自上述组的基因的表达水平显示在表I至3中。本文中鉴定的新组群包含具有改进的预后和/或对疗法具有更有利响应的患者。因此，本发明还涉及通过将被诊断患有多发性骨髓瘤的患者分类到NF κ B、CTA或PRL3中的至少一个组群中，来确定所述患者的疾病结果或预后的方法，所述方法包括测定从所述患者分离的样品中某些基因的表达水平的步骤，其中如果选自⑶C42、BCL10、IL8、GADD45B、NFKBIE和MIRN155的至少两个基因过表达，则所述患者被分类到组群NF κ B中，或者如果选自 HIST1H2BG、GINS1、CDC2、MAGEA3、BIRC5、MAGEA6、MAGEA12、PAGE1、PTTGl 和 GAGE 的至少两个基因过表达，则分类到组群CTA中，或者如果选自PRL3、PTPRZ1、S0CS3和SMYD3的至少两个基因过表达，则分类到组群PRL3中。此外，本发明涉及通过将被诊断患有多发性骨髓瘤的患者分类到NFK B、CTA或PRL3中的至少一个组群中，来确定和/或预测对疗法的响应的方法，所述方法包括测定从所述患者分离的样品中某些基因的表达水平的步骤，其中如果选自CDC42、BCL10、IL8、GADD45B、NFKBIE和MIRN155的至少两个基因过表达，则所述患者被分类到组群NF κ B中，或者如果选自 HIST1H2BG、GINSl、CDC2、MAGEA3、BIRC5、MAGEA6、MAGEAl2, PAGEl、PTTGl 和GAGE的至少两个基因过表达，则分类到组群CTA中，或者如果选自PRL3、PTPRZU S0CS3和SMYD3的至少两个基因过表达，则分类到组群PRL3中。根据本发明的特定实施方案，来自于所述患者的样品包含浆细胞。根据本发明的其他实施方案，来自于所述患者的样品包含经筛选表达⑶138的浆细胞。 当在本文中使用时，术语过表达涉及某些基因的表达水平，其用从该基因转录的RNA的量表示。过表达的基因比正常对象中的相应基因产生更多的RNA。优选情况下，过表达的基因是与正常对象相比表达至少2倍、优选超过3倍、例如4、5、6、7、10、15或甚至超过20倍量的RNA的基因。对于鉴定本文所述组群的基因的表达水平，参见表I至3。已发现，测定选自上述组的至少两个基因的表达，足以有效地将患者分类到新鉴定的组群之一中。然而，当选自如上定义的组的三个以上基因、例如4或5或6个基因的表达水平被测定时，方法提供了更加可靠的结果。当选自如上定义的组的所有基因的表达水平被测定时，获得了甚至更可靠的结果。NF κ B组群以参与NF κ B途径的基因的明显差异表达为特征。许多其他基因也过表达，然而它们似乎在NFkB组群分类中不是必需的。NFkB组群中高表达的非必需基因是例如 TNFIPl、NFKBIZ、IL2RG、CD40 和 CD74。NF κ B信号传导在骨髓瘤的疾病发生中是关键的8’9，所述骨髓瘤的疾病发生涉及主要引起非典型NF κ B途径的组成性激活的失活和激活突变8’9。对应于NF κ B基因⑶74、IL2RG和TNFAIP3的探针组具有高表达值的病例，显示出对硼替佐米的较好响应，但是无进展存活期(PFS)没有变化，而具有低TRAF3表达的患者显示出对硼替佐米的较好应答和延长的PFS9。在我们的NF κ B组群中，基于⑶74、IL2RG和TNFAIP3的NF κ B指数明显更高。与此一致的是，NFk B信号传导的负调控子显示出降低的表达，例如TRAF3，而参与刺激NF κ B活性的基因例如⑶40，则被发现增加了。本文观察到的第二个独特的新亚组是CTA组群。这类似于PR组群，其涉及不良预后标志物例如CTA基因、具有极高风险指数的患者的最高百分率，以及AURKA和BIRC5的过表达。尽管增殖相关基因例如AURKA和BIRC5以及细胞周期基因例如⑶C2和⑶C42在CTA组群中排名靠前的过表达基因之中，但是CTA组群与PR组群相比显示出明显更低的增殖指数(ΡΙ)。一种解释可能是不存在代表PI的大量基因。可选地，CTA组群与其余组群之间存在的基因的倍率变化差异，低于PR组群与其余组群中的倍率变化差异。除了诸如较高的Iq获得百分率和明显更高的PI的特点之外，没有临床特点能够将CTA从PR组群中区分出来。选自PRL3、PTPRZU S0CS3和SMYD3的至少两个基因的过表达指示了 PRL3组群。值得注意的是，蛋白酪氨酸磷酸酶PRL3、PTPRZl和S0CS3在该组群中过表达的基因之中。在来自于新诊断患有单克隆丙种球蛋白病的患者的骨髓浆细胞中，与来自于健康供体的浆细胞中相比，发现了更高的PRL3表达，并且所述PRL3的表达在UAMS PR、LB和MS组中明显更高。通过siRNA沉默PRL3减少了 SDF-I诱导的丽细胞的迁移，但是没有观察到对细胞周期分配或细胞增殖的影响11。PTPRZl参与蛋白质磷酸化的调控，并在信号传导、细胞生长、分化和肿瘤发生中发
挥关键作用12’13。S0CS3是细胞因子可诱导的细胞因子信号传导的负调控子。该基因的表达受到各种不同细胞因子、包括IL6、IL10和Y-干扰素(IFN)的诱导。用S0CS3转染骨髓瘤细胞系显示出对IFN-α引起的生长抑制的保护作用。由IFN-a诱导的IL6可能在骨髓瘤细胞的生长和存活中发挥重要作用，由IL6引起的上调的S0CS3可能至少部分造成骨髓瘤细胞中IFN-a信号传导的IL-6介导的抑制14_16。据报道，哺乳动物细胞中PRL-3的过表达抑制血管紧张素-II诱导的细胞钙动 员并促进细胞生长。不存在不良预后因子例如17p丧失，与低的高风险指数、增殖指数和AURKA表达值相组合，表明该组群中的病例可能具有不太严重的疾病(P彡O. 001)。事实上，与其他组群中相比，该组群中ISS I的频率明显更高。与现有分类的比较证实了在UAMS分类中描述的7个组群，即⑶_1、⑶_2、MS、MF、HY、PR和LB5。此外，Zhan等报告了一组具有骨髓样特征的病例，其被排除在进一步分析之外5。该所谓的污染组群中的患者显示出较低的疾病活性并在治疗后表现较好，具有显著延长的EFS和OS。我们将这组具有骨髓样特征的患者保留在基因表达分析中。这些样品聚类在一起，以明显较低水平的骨髓浆细胞增多为临床特征。建立了分类器以确认组群。对于组群⑶-2、MS、MF和HY的分类器来说，发现了高的灵敏度(Sn)和特异性(Sp)值，其中Sn在84%至97%之间变化，Sp在91%至100%之间变化。对于组群⑶-I和PR的分类器观察到较低的Sn。由87个探针组构成的用于骨髓样组群的分类器产生最低的Sn和Sp。CTA、NF κ B和PRL3组群是新的组群，因此不能使用UAMS组群定义来确认。此外，通过将我们的样品和基因选择判据应用于代表新诊断MM病例的538个UAMS原始数据文件和代表复发MM病例的264个APEX/SUMMIT/CREST原始数据文件，我们确认了我们的分类的有效性。样品聚类在两个数据集中都导致证实了 7个组群⑶1，⑶2，MS，MF，HY, PR和骨髓样组群。此外，在两个集中，我们观察到组合的NFkB/LB组群，显示出参与NF κ B信号传导途径的基因以及PHACTR3、RASGRPK IL6R和MAF/MAFB的下游靶的过表达。在我们的聚类中，根据MAFB和c-MAF下游靶的表达，发现LB样品是MF组群的子组群。该LB子组群可能代表了对应于疾病较早阶段的亚类，正如由缺乏不良预后标志物例如血小板减少症和高LDH所表明的。观察到H0V0N65/GMMG-HD4NF κ B组群和LB子组群是两个不同的组群；除了高NFk B指数之外，在差异表达的基因或骨病变的百分率方面没有观察到重叠。基于NF κ B相关基因的较弱表达相对于LB组群基因和MAF/MAFB下游靶显示出较低的倍率变化，可能可以将这两个组群合并在独立的数据集中。然而，主要以NF κ B指数为特征的组群的存在是不可置疑的。基于在显示出最高倍率变化差异的前10个基因中至少PRL3，以及S0CS3、PTPRZl和/或PTPRZl的过表达，我们还证实了 PRL3组群。在APEX数据集中发现了 CTA样组群，其以与我们的CTA组群相比不同的CTA表达情况为特征。在UAMS数据集中没有检测到CTA组群；具有CTA特征的样品聚类在PR、HY、MS和骨髓样组群中。在UAMS分类中，PR、MS和MF组群被定义为高风险组，具有明显较低的PFS和OS5。与该报道一致，我们证实了组群PR、MS、MF、新组群CTA与不良预后因子例如增加的高风险指数和闻LDH之间的关联性。当在如上所述的方法中使用两个以上基因时，获得了特别有利的结果。更具体来说，当使用超过2个基因例如3个或3个以上基因，例如4或5或6或7或8或9或10或11或12或12个以上基因时，获得具有非常好的灵敏度和特异性的诊断方法。在用于将被诊断患有多发性骨髓瘤的患者分类到NFk B组群中的方法中获得了出色的灵敏度和特异性，所述方法包括测定从所述患者分离的样品中某些基因的表达水平的步骤，其中如果至少基因CDC42、BCL10、IL8、GADD45B、NFKBIE和MIRN155过表达，则所述患者被分类到组群NF κ B中。适用于将患者分类到NFKB组群中的探针组是例如214230_at (CDC42)、207574_s_at、209304_x_at、209305_s_at (所有这三个探针组都属于基因 GADD45B)、202859_x_at(IL8)、229437_at (MIRN155)和 203927_at (NFKBIE)(表 4)。当在APEX数据集中使用本发明的这个实施方案的方法时，获得O. 71的曲线下面积(AUC)以及 O. 0005 的置换 P-值。当向基因 CDC42、BCL10、IL8、GADD45B、NFKBIE 和MIRN155添加基因TNFAIP3时，这种方法甚至可以改进到AUC为O. 75。在用于将被诊断患有多发性骨髓瘤的患者分类到PRL3组群中的方法中，也获得了出色的灵敏度和特异性，所述方法包括测定从所述患者分离的样品中某些基因的表达水平的步骤，其中如果至少基因PRL3、PTPRZ1、S0CS3和SMYD3过表达，则所述患者被分类到组群PRL3中。适用于将患者分类到PRL3组群中的探针组是例如206574_s_at、209695_at(都适于 PRL3)、204469_at (PTPRZ1)、218788_s_at (SMYD3)和 227697_at (S0CS3)(表 4)。当使用本发明的这个实施方案的方法时，曲线下面积为O. 86，并且置换P-值〈1x10'当向基因PRL3、PTPRZl、S0CS3和SMYD3组成的基因集添加基因CCND2时，这种方法甚至能够进一步改进到AUC为O. 87，并且置换P-值为I. 10_5。表权利要求
1.一种通过将被诊断患有多发性骨髓瘤的患者分类到组群NFK B或PRL3的至少一个中，以确定所述患者的疾病结果或预后的方法，所述方法包括测定从所述患者分离的样品中某些基因的表达水平的步骤，其中如果选自⑶C42、BCL10、IL8、GADD45B、NFKBIE和 MIRN155的至少两个基因过表达，则所述患者被分类到组群NFk B中，或者如果选自PRL3、 PTPRZUS0CS3和SMYD3的至少两个基因过表达，则所述患者被分类到组群PRL3中，其中组群NF K B和PRL3与改进的预后和对疗法的独特响应有关。
2.权利要求I的方法，其中如果至少基因CDC42、BCL10、IL8、GADD45B、NFKBIE和 MIRN155过表达，则患者被分类到组群NF K B中。
3.权利要求I的方法，其中如果至少基因PRL3、PTPRZl、S0CS3和SMYD3过表达，则患者被分类到组群PRL3中。
4.权利要求2的方法，其中另外基因TNFAIP3过表达。
5.权利要求3的方法，其中另外基因CCND2过表达。
6.权利要求1-5的方法,其中所述样品包含衆细胞。
7.权利要求1-6的方法，其中所述生物学样品包含经筛选表达⑶138的浆细胞。
全文摘要
本发明属于分子诊断学领域，并涉及用于将从被诊断患有多发性骨髓瘤的患者获得的样品分类成三个新定义的组群的方法。本发明还涉及用于确定被诊断患有多发性骨髓瘤的个体的预后的方法，以及用于预测被诊断患有多发性骨髓瘤的个体对治疗的响应的方法。
文档编号G01N33/50GK102933965SQ201180026323
公开日2013年2月13日 申请日期2011年5月27日 优先权日2010年5月27日
发明者彼得·索内维尔德 申请人:鹿特丹伊拉斯姆斯大学医疗中心