用于预测对白介素-6受体抑制性单克隆抗体药物治疗的响应的基因表达标记的制作方法

专利名称：用于预测对白介素-6受体抑制性单克隆抗体药物治疗的响应的基因表达标记的制作方法
用于预测对白介素-6受体抑制性单克隆抗体药物治疗的响应的基因表达标记
背景技术：
塔西单抗(Tocilizumab)是已经开发用于治疗类风湿关节炎的第一种人源化白介素-6受体(IL-6R)抑制性单克隆抗体。至于其他治疗，抗体在患者中表现一定范围的疗效。因此，需要确定更可能对塔西单抗治疗阳性响应的那些患者和/或可能对治疗不响应的患者。本发明解决了这一需要。发明概述
本发明，部分，基于对药物治疗的阳性治疗响应相关的基因表达的变化的发现，所述药物调节IL-6介导的信号转导，如抑制转导的抗IL-6抗体或IL-6R抑制性单克隆抗体如塔西单抗。因此，在一个方面，本发明提供了鉴定可能对塔西单抗治疗响应的类风湿关节炎患者；或者鉴定可能对塔西单抗治疗不响应的患者的方法；其中所述方法包括鉴定表1、表2或表3中所述基因的表达水平。可以使用各种技术，包括阵列探针组和扩增技术，来鉴定这种基因。然后将标记 基因的表达水平与使用的数据组中所示的表达水平相比较来建立相关性。在进一步的方面，本发明提供了用于预测类风湿关节炎患者对包括施用IL-6R抗体如塔西单抗的治疗方案的治疗响应的试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒还包括将来自患者的表1、表2或表3中所述的生物标记基因的标记基因表达水平与数据组进行比较的电子设备或计算机软件。用于评价治疗性反应的终点可以是任何类风湿关节炎的症状，例如，在实施例1中评价的终点。在一些实施方案中,标记基因是表I中所述基因的任一种。在一些实施方案中，标记基因是表I中所述的至少两种基因。因此，在一些实施方案中，是表I中所述的2_20、30、40、50、60、70、80或所有基因中的任一种。在一些实施方案中,标记基因是表2中所述基因的任一种。在一些实施方案中,标记基因是表2中所述的至少两种基因。因此，在一些实施方案中，是表2中所述的2_20、30、40、50、60、70、80或所有基因中的任一种。在一些实施方案中,标记基因是表3中所述基因的任一种。在一些实施方案中,标记基因是表3中所述的至少两种基因。因此，在一些实施方案中，是表3中所述的2_20、30、40、50、60、70、80或所有基因中的任一种。在一些实施方案中，确定生物标记基因的表达水平的步骤包括测定标记基因表达的RNA水平。可以，例如，使用扩增区域反应如qPCR，或者通过使用探针阵列测定表达的RNA的量。例如，可以使用形成核酸阵列的探针组来检测生物标记基因的表达的RNA。通常通过测定从患者分离的RNA的转录的cDNA的水平确定RNA表达水平。可以使用已知探针组来确定RNA表达水平从而定量表达水平。正如本领域中已知的，这种探针组可以包括与感兴趣的目标序列杂交的多条探针。或者，可以通过测定由基因编码的蛋白的表达水平而确定标记基因的表达。
将表达水平与标准对照数据，例如，实施例1和2中产生的表达数据组进行比较。可以通过统计学模型确定标记基因的表达水平的增加或生物标记基因的表达水平的降低，用于确定生物标记基因的表达是否表明患者对IL-6R抗体如塔西单抗的治疗的治疗响应。在一些情况下，本发明提供了使用统计学模型来确定治疗响应的可能性的电子设备或计算机软件。在一些实施方案中，评价表5中所述基因的表达水平以鉴定可能对IL-6R拮抗剂如塔西单抗的治疗响应或不响应的类风湿关节炎患者。在典型的实施方案中，分析C列、D列、E列、F列、G列、H列、I列或J列中2-10、20、30、40、50、60、70、80或90，或所有基因中任何基因以确定治疗响应的可能性。发明的详细描述
如本文所用，“阳性的治疗响应”或“治疗益处”是指类风湿关节炎的任何症状的改善和/或发作的延迟。如本文所用，“阴性的治疗性响应”是指类风湿关节炎的一种或多种症状的改善的缺乏。“白介素-6受体(IL-6R)抑制性抗体”是指针对IL-6受体的抗体，其中所述抗体结合IL-6受体并拮抗(即，抑制)IL-6受体活性。这种抗体的一个例子是用于治疗类风湿关节炎的塔西单抗，一种人源化的IL-6R单克隆抗体(见,例如,Sato等,Caflcer Res 1993;53:851-6 ;和美国专利号7479543)。在本发明中，“表I中所述基因”是指对应于表I中注释的探针组的基因。类似地，表2、3或5 “中所述基因”是指对应于各自表中注释的探针组的基因。对于表1_3，“代表性的公共ID”被列为表I登 录号。“代表性的公共ID”是代表性序列的登录号。对于基于共有的探针组，代表性序列是用于构建实施例中使用的探针组中的共有序列的数条序列(序列子蔟)中的仅仅一条，它不直接用于衍生探针序列。在阵列设计期间选择代表性序列作为与被探针组询问(interrogate)的转录区域最相关的序列。如本领域中所理解的，对于许多基因序列有天然存在的多态性。作为用于本发明的目的自然存在的等位基因变异的基因是由相同基因位点编码的那些基因。表1、表2或表3中所述的基因的等位基因变异编码的蛋白通常彼此具有至少95%的氨基酸序列同一性，即，表1、表2或表3中所述的基因的等位基因变体通常编码的蛋白产物与该表中所示的该基因的登录号所注释的核苷酸序列编码的氨基酸序列具有至少95 %同一性，经常至少96 %，至少97 %，至少98 %，或至少99 %，或更高的同一性。例如，编码Eph受体B2的基因(基因:EPHB2，代表性登录号AF025304)的等位基因变体与根据登录号AF025304获得的序列编码的Eph受体b2蛋白通常具有至少95 %同一性，经常至少96 %，至少97 %，至少98 %，或至少99 %或更高。在两种或更多种核酸或蛋白的上下文中的术语“相同的”或“ 100 %同一性”是指作为相同序列的两种或更多种序列或子序列(subsequences)。当如使用已知序列比较算法，例如使用默认参数的BLAST，或者通过手工比对和目视检查所测定的在比较窗口或指定区域比较并比对最大对应时，如果两条序列具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即，在指定区域，或者，当不指定时，在整个序列，70%同一性，任选75%，80%，85%，90%，或95%同一性)，两条序列是“基本上相同的”或具有特定百分比的同一性。在本发明的上下文中的“基因产物”或“基因表达产物”是指由该基因编码的RNA或蛋白。在患有类风湿关节炎的患者中的术语“评价生物标记”是指确定表1、表2、表3或表5中所列的基因或该基因的等位基因变体编码的基因产物的表达水平。典型地，确定RNA表达水平。介绍
本发明，部分，基于特定基因/转录本的鉴定，该基因/转录本的基因表达水平，在给药前或给药后8周，与对塔西单抗的响应相关。因此，本发明涉及在患者接受药物之前测定生物标记的表达水平。在一些实施方案中，可以在诊断装置的形式中应用检测这种转录本的探针来预测哪些类风湿关节炎患者将对IL-6受体拮抗剂如IL-6受体拮抗性抗体，例如，塔西单抗，响应或不响应。也可以测定转录本以预测哪些RA患者在后面的时间点将对塔西单抗响应。而且，可以使用蛋白/代谢产物和/或相关的转录本和相关产物(其通过通路或细胞类型或组织表达与本文的实施例部分中鉴定的转录本相联系)的鉴定作为用于测定对塔西单抗的响应的额外生物标记。可以测定表1、表2或表3中所述基因之一的任何基因表达产物的表达水平，但是，典型地评价多个基因的表达。可以使用本领域已知的任何数量的方法测定基因表达水平。在典型的实施方案中，该方法涉及测定RNA的水平。可以使用任何方法，例如，采用定量扩增方法如qPCR，定量RNA表达。在其它实施方案中，该方法采用基于阵列的检测。在其它实施方案中，可以检测蛋白产物。使用来自患者的全血或外周血淋巴细胞样品测定基因表达模式。在一些实施方案中，可以定量与表1、表2或表3中所示的生物标记在相同的通路中的基因编码的基因产物，典型地RNA。在一些实施方案中，用来评价以鉴定作为塔西单抗的治疗的候选的类风湿关节炎患者的至少一种生物标记选自JAM3、CD41、CD61和ehrin受体B2。在一些实施方案中，选择用于评价的至少一种生物标记是JAM3、⑶41、⑶61，评价的第二种生物标记是ephrin受体B2。在一些实施方案中，在患者中评价的生物标记是炎性体(inflammasome)的组分、半胱天冬酶1、半胱天冬酶5、IL_1受体或CARD16。在一些实施方案中，评价的至少一种生物标记是丝氨酸棕榈酰转移酶长链基亚基2或鞘氨醇-1-磷酸酯(SlP)、神经酰胺或相关的神经鞘脂类。在一些实施方案中，本发明的方法包括分析表5的在C-J列中一列所示的具有高于“0”的值的两个或更多个生物标记的基因表达产物。可以组合使用这种生物标记来预测类风湿关节炎患者对IL-6R拮抗剂如塔西单抗的治疗的响应的可能性。因此，例如，可以组合使用在C列中具有高于“0”的值的至少两个生物标记，优选三个，四个，五个或最高达100的任何数量的生物标记物的基因表达水平的分析来预测对塔西单抗治疗的响应。类似地，可以分析来自D列的具有高于“0”的值的至少两个生物标记，优选三个，四个，五个或更多个，或全部生物标记的表达水平以鉴定可能对IL-6R拮抗剂如塔西单抗的治疗响应或不响应的类风湿关节炎患者。在典型的实施方案中，评价具有更低数量的那些基因的那些表达水平。因此，例如，在C列中具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10的值的基因，例如，通常被包括在基因表达的分析中。在一些实施方案中，本发明的方法包括分析在C列中两个或更多个基因的表达水平；以及分析在D列中两个或更多个基因，或在E列中两个或更多个基因等的表达水平，等等。
在表5中，“ID”列是指对应基因的探针组(表5B)。本领域技术人员理解，可以通过在此分析中使用的芯片的标记的数据库(Affymetrix)获得表5B中的探针组注释和表5A的L列。定量RNA的方法
可以根据本领域已知用于定量RNA的任何方法容易地确定表I中所述的基因编码的RNA的量。可以使用涉及扩增反应和/或其中探针被连接至固体支持物并用于定量RNA的反应的各种方法。或者，可以将RNA连接至固体支持物并使用针对感兴趣的序列的探针定量。从外周血淋巴细胞获得本发明中分析的“RNA核酸样品”。“RNA核酸样品”包括RNA,但不必是纯的RNA，例如，DNA也可以存在于样品中。从外周血淋巴细胞获得RNA样品的技术是本领域中公知的。在一些实施方案中，首先逆转录目标RNA并定量得到的cDNA。在一些实施方案中，使用RT-PCR或其它定量扩增技术来定量目标RNA。用PCR的cDNA扩增是公知的(见美国专利 4，683，195 和 4，683，202; PCR PROTOCOLS:A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS(Innis 等.，eds, 1990))。例如，美国专利号 6，180，349; 6，033，854;和 5，972，602，以及在例如 Gibson 等，Genome Research 6:995-1001 (1996) ; DeGraves 等，Biotechniques34(1):106-10, 112-5 (2003) ; Deiman B,等，Mol Biotechnol.20 (2): 163-79 (2002)中公开了定量扩增的方法。用于测定样品中感兴趣的mRNA水平的其它方法可能涉及其它核酸扩增方法如连接酶链式反应(Barany (1991) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 88:189-193)、自我维持的序列复制(Guatelli 等.(1990) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 87:1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh 等.(1989) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 86:1173-1177)、Q-β 复制酶(Lizardi 等.(1988) Bio/Technology 6:1197)、滚环复制(美国专利号 5，854，033)或任何其它的核酸扩增方法，随 后使用本领域技术人员公知的技术检测扩增的分子。通常，定量扩增基于在扩增(例如，PCR)反应的循环中代表模板的拷贝的信号(例如，探针的荧光)的监测。用于检测扩增产物的一种方法是5’-3’核酸外切酶“水解”PCR检测(也被称为TaqMan 测定)(美国专利号5，210，015和5，487，972 ；Holland等，PNASUSA 88:7276-7280 (1991) ;Lee 等，M/chic Acids Res.21:3761-3766 (1993))。这种测定检测通过杂交的特定PCR产物的累积以及在扩增反应期间双标荧光探针("TaqMan 〃探针)的裂解。荧光探针由荧光报告染料和淬灭染料同时标记的寡核苷酸组成。在PCR过程中，当且仅当该探针与被扩增的区段杂交时，该探针被DNA聚合酶的5’ -核酸外切酶活性裂解。探针的裂解产生了报告染料的荧光强度的增加。依靠使用能量传递检测扩增产物的另一种方法是Tyagi和Kramer, Na tureBiotech.14:303-309 (1996)描述的“信标探针”方法，这也是美国专利号5，119,801和5，312，728的主题。该方法采用可以形成发夹结构的寡核苷酸杂交探针。在杂交探针的一个末端上(5’或3’末端)，有供体突光团,在另一末端上,有受体部分。在Tyagi和Kramer方法的情况下，这种受体部分是淬灭剂，即，受体吸收供体释放的能量，但然后本身不发荧光。因此，当信标是开放的构象时，供体荧光团的荧光是可检测的，而当该信标是发夹(闭合的)构象时，供体荧光团的荧光被淬灭。当用于PCR中时，与PCR产物的链之一杂交的分子信标探针是“开放的构象”并且检测到荧光，而剩下未杂交的那些不会发荧光(Tyagi和Kramer, Nature Biotechnol.14:303-306 (1996))。因此，荧光的量将随着 PCR 产物的量增加而增加，因此可被用作PCR的进程的量度。本领域技术人员将认识到也可以获得其它定量扩增方法。用于进行核酸的定量扩增的各种其它技术也是已知的。例如，一些方法采用一条或多条探针寡核苷酸，其结构使得当寡核苷酸与目标核酸杂交时产生荧光的变化。例如，一种这种方法涉及双荧光团方法，其利用荧光共振能量转移(FRET)，例如，LightCycler 杂交探针，其中两条寡核苷酸探针与扩增子退火。设计寡核苷酸以便以头-尾方向与以容许有效的能量转移的距离分隔的荧光团杂交。设计为当与核酸结合或掺入延伸产物时释放信号的结构的标记的寡核苷酸的其它例子包括=Scorpions探针(例如，Whitcombe等，Nature Biotechnology 17:804-807, 1999,和美国专利号 6，326，145)、Sunrise (或Amplifluor )探针(例如，Nazarenko 等，Nuc.Acids Res.25:2516-2521，1997,和美国专利号.6，117，635)以及形成在没有淬灭剂的情况下信号降低并且当与目标杂交时发射增加的信号的二级结构的探针(例如，Lux probes )。在其它实施方案中，可以使用当嵌入双链DNA时产生信号的嵌入剂(intercalating agents)。示例性的试剂包括SYBR GREEN 和SYBR GOLD 。由于这些试剂不是模板特异性的，假定该信号是基于模板特异性的扩增产生的。可以通过监测作为温度的函数的信号而验证这一点，因为模板序列的熔点通常远高于，例如，引物二聚体等。在其它实施方案中，例如，在斑点印迹或Northern格式中，将mRNA固定在固体表面上，并与探针接触。在另外的实施方案中，例如，在基因芯片阵列中，将探针固定在固体表面上，并将mRNA与探针接触。本领域技术人员可以容易地调整已知的mRNA检测方法用于检测编码生物标记或其它感兴趣的蛋白的mRNA的水平。在一些实施方案中，采用，例如，微阵列。DNA微阵列提供了用于同时测定大量基因的表达水平的方法。每个阵列由连接于固体支持物的捕获探针的可再生模式组成。标记的RNA或DNA与阵列上的互补探针杂交，然后通过激光扫描检测。测定阵列上的每个探针的杂交强度并转换为代表相对的基因表达水平的定量值。见，美国专利号6，040, 138,5, 800, 992和6，020, 135,6, 033，860和6，344，316。高密度寡核苷酸阵列尤其可用于测定样品中大量RNA的基因表达谱。例如，美国专利号5，384，261中描述了使用机械的合成方法用于这些阵列的合成的技术。虽然经常采用平面阵列表面，可以在几乎任何形状的一个表面或者甚至多个表面上制造阵列。阵列可以是珠子、凝胶、聚合表面、纤维如光纤、玻璃或任何其它适当的基质上的肽或核酸，见美国专利号 5，770，358,5, 789，162,5, 708，153,6, 040，193 和 5，800，992。阵列可以以允许包括一切的装置的诊断或其它操作的方式包装。可以使用公知的技术选择用于扩增并检测感兴趣的目标序列的引物和探针。在本发明的上下文中，“测定感兴趣的RNA的表达水平”包括本领域中已知的任何用于定量感兴趣的RNA的方法。蛋白水平的检测 在一些实施方案中，例如，其中测定表I中所述的生物标记基因编码的蛋白的表达水平。经常，可以使用免疫检测进行这种测定。尽管可以使用细胞样品如外周血淋巴细胞样品测定蛋白表达水平，但是通常使用血清样品测定蛋白表达。
适用技术的总体概述可见Harlow & Lane, Antibodies:A Laboratory Manual(1988)和Harlow & Lane, Using Antibodies (1999)。产生与等位基因变体特异性反应的多克隆和单克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的(见，例如，Coligan, CurrentProtocols in Immunology (1991) ; Harlow & Lane, 同上;Goding, MonoclonalAntibodies:Principies and Practice (第二版.1986);和Kohler & Milstein, Nature256:495-497 (1975))。这种技术包括通过从在噬菌体或类似载体中的重组抗体的文库选择抗体，以及通过免疫兔或小鼠制备多克隆和单克隆抗体的抗体的制备(见，例如，Huse等.，Science 246:1275-1281 (1989); Ward 等.，Nature 341:544-546 (1989))。可以通过各种免疫测定方法检测多态性等位基因。对于免疫学和免疫测定方法的综述，见and Clinical Immunology (Stites & Terr eds.,第 7 版.1991)。而且，可以以万似7膨 Immunoassay (Maggio, ed., 1980);和 Harlow & Lane,同上中广泛综述的任何数种配置进行免疫测定。对于通用免疫测定的综述，还可见，JfciAoife in CellBiology:Antibodies in Cell Biology,第37卷(Asai, ed.1993) ; Basic and ClinicalImmunology (Stites & Terr, eds.,第 7 版.1991)。常用的测定包括非竞争性测定，例如，夹心测定和竞争性测定。通常，可以使用测定如ELISA测定。可以通过进行定量分析测定多肽变体的量。可以使用其它检测技术，例如，MALDI，来直接检测与治疗结果相关的蛋白的存在。装置和试剂盒
在进一步的方面，本发明提供了用于鉴定与类风湿关节炎患者对拮抗IL-6受体信号的治疗性药物如IL-6R抗体，例如，塔西单抗的改善的响应相关的基因表达产物的诊断装置和试剂盒。在一些实施方案中，诊断装置包括检测至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、50、60、70、或80、或所有的表I中所述基因表达产物的探针。在一些实施方案中，本发明提供了连接于固体支持物如阵列玻片或芯片上的寡核苷酸探针，例如，如DNA MicroarraysiAMolecular Cloning Manual, 2003, Eds.Bowtell 和 Sambrook, Cold Spring HarborLaboratory Press中所述的。这种装置的构建是本领域中公知的，例如，在美国专利和专利公开美国专利号5，837，832; PCT申请W095/11995;美国专利号.5，807，522;美国专利号.7，157，229，7,083,975，6,444,175，6,375,903，6, 315, 958, 6,295,153，和 5， 143，854， 2007/0037274， 2007/0140906， 2004/0126757， 2004/0110212，2004/0110211, 2003/0143550, 2003/0003032，和 2002/0041420 中所述的。以下参考文献中也综述了核酸阵列 dioiecAffoJ Annu Rev 8:85-101 (2002) ; Sosnowski 等，Psychiatr Genet 12 (4):181-92 (Dec.2002); Heller, Annu Rev Biomed Eng 4:129-53(2002) ; Kolchinsky 等,Hum.Mutat 19(4):343-60 (Apr.2002);和 McGail 等,AdvBiochem Eng Biotechnol 77:21-42 (2002)。阵列可以由大量固定至固体支持物上的独特的、单链多核苷酸，通常是合成的反义多核苷酸或cDNA的片段组成。典型的多核苷酸优选长度为约6-60个核苷酸,更优选长度为约15-30个核苷酸，最优选长度为约18-25个核 苷酸。对于某些类型的阵列或其它检测试剂盒/系统，可以优选使用长度仅为约7-20个核苷酸的寡核苷酸。在其它类型的阵列中，如结合化学发光检测技术使用的阵列中，优选的探针长度可以是，例如，长度为约15-80个核苷酸，优选长度为约50-70个核苷酸,更优选长度为约55-65个核苷酸,最优选长度为约60个核苷酸。本领域技术人员将认识到，基于已知的序列信息，可以开发检测试剂并用于测定表1、表2和表3中所述的任何基因表达产物，可以将这种检测试剂并入试剂盒。在生物标记检测试剂的上下文中的如本文所用的术语“试剂盒”意在是指这种物质如多种生物标记检测试剂的组合，或一种或多种生物标记检测试剂组合一种或多种其它类型的元件或组分(例如，其它类型的生化试剂、容器、包装，如用于商业销售的包装，生物标记检测试剂连接的基质，电子硬件组分，等)。因此，本发明进一步提供了生物标记检测试剂盒和系统，包括但不限于，包装的探针和引物组(例如，TaqMan探针/引物组)、核酸分子的阵列/微阵列，其中所述阵列/微阵列包括检测生物标记转录本的水平的探针和包含用于检测本发明的一种或多种生物标记的一种或多种探针、引物或其它检测试剂的珠子。试剂盒可以任选地包括各种电子硬件组分；例如，由各种制造商提供的阵列(“DNA芯片”)和微流体系统(“芯片上的实验室(lab-on-a-chip)”系统)，通常包括硬件组分。其它试剂盒(例如，探针/引物组)可能不包括电子硬件组分，但是可以由，例如，一个或多个容器中包装的一种或多种生物标记检测试剂(连同，任选的，其它生化试剂)组成。在一些实施方案中，生物标记检测试剂盒典型地包含对于实施测定或反应如用于检测生物标记转录本的水平的扩增所必需的一种或多种检测试剂和其它组分(例如，缓冲液、酶，如DNA聚合酶)。试剂盒还可以包含用于测定目标核酸的量的装置，和用于比较所述量与标准的装置，并且可以包括用于使用试剂盒以检测感兴趣的生物标记核酸分子的说明书。在本发明的一个实施方案中，提供了试剂盒，该试剂盒包含实施检测本文公开的一种或多种生物标记物的一种或多种测定所必需的试剂。在本发明的一个实施方案中，生物标记检测试剂盒/系统的形式为核酸阵列或区室化的试剂盒，包括微流体/芯片上的实验室(lab-on-a-chip)系统。

生物标记检测试剂盒/系统可以包含，例如，与表1、表2或表3中所述基因编码的核酸分子杂交的一种或多种探针或探针的对或组。在一些实施方案中，可以在一次测定中同时评价多于一种生物标记物的存在。例如，在一些实施方案中，将针对不同生物标记的探针或探针组固定为阵列或固定在珠子上。例如，相同的基质可以包含用于检测至少1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、15、或20、或更多的表1、表2或表3中所述生物标记的生物标记探针。使用这种阵列或其它试剂盒/系统，本发明提供了在测试样品中鉴定本文所述生物标记的方法。这种方法典型地涉及将从患者的外周血淋巴细胞获得的核酸试验样品以及包含与表1、表2或表3中所述基因编码的核酸选择性杂交的一种或多种探针孵育。将生物标记检测试剂(或采用一种或多种这种生物标记检测试剂的试剂盒/系统)与测试样品孵育的条件可以变化。孵育条件取决于这些因素，如测定中采用的格式，采用的检测方法和测定中使用的检测试剂的类型和性质。本领域技术人员将认识到，可以容易地调整常用的杂交、扩增和阵列测定格式中任一项以检测表1、表2和表3中所述生物标记。本发明的生物标记检测试剂盒可以包括用于从测试样品制备核酸以用于随后的生物标记核酸分子的扩增和/或检测的组分。基因表达水平与治疗响应的关联
本发明提供了确定基因表达产物的水平来评价类风湿关节炎患者将对IL-6R拮抗剂如塔西单抗的治疗的响应的可能性的方法。可以分析女性或男性类风湿关节炎患者的基因表达水平。与治疗效果的改善相关的某些标记，例如，表I中基线表达标记的存在，表明预期表现出对IL-6R抗体如塔西单抗的治疗的阳性治疗响应的患者。典型地，阳性治疗响应的可能性随着基因表达标记的量的增加而增加。类似地，患者可能具有与阴性治疗效果相关的基因表达标记，例如，表I中所述标记的基线表达。因此，这种患者不可能对IL-6R抗体，例如，塔西单抗，响应。典型地，阴性治疗响应的可能性随着生物标记的量的增加而增加。在表1、2和3中，“系数(co-efficient) ”列代表通过DAS28评分的变化测定的基因表达值对响应的作用，所述DAS28评分对于基线DAS进行调整(表3中的数据也对于基线血小板(platelet)数进行调整)。系数的符号代表作用的方向。例如，_1.6的系数意味着更高的表达与更好的响应相关。基因表达值的每2倍增加对应DAS评分进一步减少1.6单位。同样，正系数表明更高的表达与更差的响应相关(更高的DAS28评分)。表I显示某种生物标记，其中生物标记的基线表达(即，在经历IL-6R抗体如塔西单抗的治疗之前的水平)预测治疗响应。因此，例如，可以在从类风湿关节炎患者获得的外周血样品中测定表I中所述基因编码的基因表达产物的水平。用基因表达水平的阈值定义生物标记阳性/阴性组。可以使用本领域中公知的算法确定每个标记的准确阈值，该阈值取决于使用的特定平台和检测以及检测的期望的性能参数，例如，灵敏度、特异性。例如，如果表I中的生物标记的表达水平高于(预测表现出阳性治疗响应)或低于(预测不表现出阳性治疗响应)阈值，确定患者可能对IL-6拮抗剂，例如，塔西单抗，表现出治疗响应或不表现出治疗响应。表2中所述基因的表达水平的测定还提供测定在后来的时间点患者对IL-6-R拮抗剂，例如，IL-6R抗体如塔西单抗的治疗响应的可能性的能力。例如，在基线和，例如，在治疗后8周时进行表2中所述基因的表达的测定。使用两个测定值之间的基因表达的变化来计算在后面的时间点如16或24周时响应的可能性。这里再次，可以应用响应的变化的阈值。
或者，可以在治疗开始后，例如，在第8周时，进行测定，可以使用观察的基因表达水平针对预定值“均一化”结果作出响应预测。也可以评价表5中列出基因的基因表达。表5的A-J列中每一列代表对于列标题注明的临床响应分析的基因。对于具有>0等级的ACR的前100个基因列于表中。如果该值是0，对于ACR不选择该基因。对于每列，可以分析具有〉0值的指明的至少两个，通常大部分或所有基因。为了预测说明书中实施例部分中概述的涉及表5的“类型指数”的临床响应的分类，使用作为来自多个基因的表达信号的线性组合的基因表达值。通过本领域已知的分类算法如支持向量机(SVM)(见,例如，Vapnik, The Nature of StatisticalLearning, Springer, NY, 1995; Cristianini & Shawe-Taylor, An Introduction toSupport Vector Machines, Cambridge University Press, Cambridge, UK, 2000.)来石角定这些基因表达水平的线性组合的截止值。本发明的方法通常涉及在用IL-6R抗体如塔西单抗治疗的类风湿关节炎患者中记录与有益的治疗结果或阴性的治疗结果相关的基因表达产物的水平。可以以计算机可读的形式保存此信息。这种计算机系统通常包括主要子系统如中央处理器、系统存储器(通常是RAM)、输入/输出(I/O)控制器，外部设备如经由显示适配器的显示屏幕、串行端口、键盘、经由存储接口的固定磁盘驱动器和可操作以接收软盘的软盘驱动器和可操作以接收CD-ROM的CD-ROM(或DVD-ROM)设备。可以连接许多其它设备如经由串行端口连接的网络接口。也可以将计算机系统连接至网络，该计算机系统包括经由数据链接如以太网电缆(同轴电缆或IOBaseT)、电话线路、ISDN线路、无线网络、光纤或其它合适的信号传输介质链接的多个计算设备，借此至少一种网络设备(例如，计算机、磁盘阵列等)包括由编码从本发明的测定获得的数据的比特模式构成的磁场域(例如，磁盘)和/或电荷域(例如，DRAM单元格的阵列)的模式。计算机系统可以包括用于解释评价表I中注明的基因编码的一种或多种基因表达产物的基线水平的表达分析的结果的代码。因此，在示例性实施方案中，将表达分析结果提供至计算机，其中中央处理机执行计算机程序用于确定对于IL-6受体抗体的治疗的治疗响应的倾向。本发明还提供了计算机系统如上面所述的计算机系统的用途，其包括:(1)计算机(2)编码通过本发 明的方法获得的表达结果的存储的比特模式，其可以被存储在计算机中；(3)，和，任选地，(4)用于确定阳性的治疗响应的可能性的程序。 本发明进一步提供了基于患有类风湿关节炎的患者中基因表达广物的检测广生报告的方法。这种报告基于与阳性的或阴性的治疗结果相关的表I中所述基因编码的基因表达产物的检测。具有对IL-6R抗体的治疗阳性的治疗响应的增加的可能性的患者具有至少一种与阳性的治疗响应相关的在表I中的基因表达产物。通常，这种患者具有表达模式，其中确定表I中所述基因编码的至少两种产物。在一些实施方案中，可以评价患者的表I中所述的3、4、5、6、7、8、9、或10个或更多的基因编码的产物的表达水平。
实施例实施例1.塔西单抗治疗的类风湿关节炎患者的基因表达谱的分析。用于与对DAS28评分的变化的响应的关联性的基因表达数据的分析。在基线和在给药后第8周时收集从在AMBITION研究(Jones,等.，Ann Rheum Dis
269:88-96, 2010)中用作为单一治疗的8 mg/Kg塔西单抗给药的患有活跃RA的患者收集的 RNA 样品。通过使用 Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array, 209份样品(113份基线样品和96份“第8周”样品)进行基因表达谱分析。在基因表达数据的许多质量控制步骤后，强调具有更低质量的2份样品，207份样品进行进一步分析。使用Affymetrix RMA算法以产生均一化的基因表达数据用于进一步分析。仅仅包括具有高表达水平(最大值〉4)的探针组和具有更大动态范围(最大值-最小值>2)的那些。对所有样本采集最大值和最小值。进行线性回归用于后续分析。在所有分析中，使用在第16周时(CDAS28)疾病活动评分28 (Disease Activity Score 28，DAS28)的变化作为响应终点。选择第16周，因为它是在大多数塔西单抗临床试验中对于逃避治疗的最早时间点)。在所有分析中使用基线DAS作为协变量，因为它对于cDAS有重要影响。1.基线基因表达比CDAS28。在分析中包括111位受试者。2.以LASSO变量选择(LASSO Variable Selection)用基线表达数据的线性回归。这是多变量分析方法，该方法包括模型中的所有探针组，将对探针组的系数的 LI 罚分加入目标函数。(Tibshirani, R.(1996).J.Royal.Statist.Soc B.,Vol.58(1):267-288))。通过模型选择探针组的亚组。通过模型选择的探针组的数量取决于罚分的水平。使用10倍交叉验证确定罚分的最佳水平，其随后确定选择用来获得最佳预测的探针组的最佳数量。3.在第8周时基因表达比CDAS28的变化。在分析中包括94位受试者。4.以LASSO变量选择用基因表达的变化的线性回归。5.基线基因表达比CDAS28，对于基线血小板(platelet)进行调整。分析(I)鉴定了一些代表激活血小板(platelet)表达的基因的探针组，例如ITGA2B (⑶41)、ITGB3(⑶61)、JAM3存在于根据p_值排序的数据的列表的顶部(见表I)。这些基因的表达与CDAS28存在相关性。该观察结果促使了基线血小板(platelet)数对DAS28中变化的回归分析。分析表明了与基线血小板(platelet)数的适度但统计学显著的联系。通过ITGA2B、ITGB3、JAM3与CDAS28的相关性表明了强得多的作用大小，表明血小板(platelet)激活的标记是比单独的血小板(platelet)计数更好的响应 的预测。根据分析⑴确定，EPHB2 (Ephrin受体B2)的基线表达水平具有与cDAS28的关联性。EPHB2转导调节细胞粘附和迁移的信号，其在RA中的滑膜成纤维细胞和渗出物淋巴细胞中以比来自OA的那些更高的水平表达。其配体，EphrinBl，在RA外周血淋巴细胞(PBL)中以比健康对照更高的水平表达。重组EphrinBl刺激正常PBL表现出增强的迁移和TNF产生并刺激RA滑膜细胞产生IL-6。这些结果表明，它对于预测对塔西单抗的响应也是有用的生物标记。我们推理，在分析(I)中观察的血小板(platelet)表达的基因与cDAS的高相关性可以“掩蔽”其它重要的响应信号的鉴定。因此，进行回归模型中的血小板(platelet)数量的基线校正。根据该分析，鉴定了以P-值排序的NALPl炎性体的4种组分中的3种。炎性体是介导促炎性半胱天冬酶的激活的多蛋白胞质复合物。NALPl炎性体激活半胱天冬酶I和半胱天冬酶5。半胱天冬酶I将前-1L-1 β切割IL-Ιβ，还激活IL-18和可能的IL-33。我们还鉴定了 CARD16，一种半胱天冬酶I的负调节因子的基线表达和IL-1受体的基线表达与cDAS的相关性。也可以将IL1B/IL-18/IL-33的血清水平和上面鉴定的转录本的基因表达信号作为预测对塔西单抗的响应的生物标记。根据分析(3)，已经通过来自塔西单抗施用的8周基因表达的变化鉴定了可以用于预测响应的多种转录本。(表2)。这些包括半胱天冬酶1，与IL-1 β / IL-18/IL-33通路的联系(见上面(4))，丝氨酸棕榈酰转移酶，长链基地亚基2，与分子如神经酰胺和鞘氨醇-1-磷酸酯(SlP)的重新神经鞘脂合成的联系，和血小板(platelet)表达的基因，如CD41，CD61 和 JAM3。Lasso变量选择多变量方法(分析2和4)允许为响应的预测各自贡献不同的‘组分’的转录本的鉴定。通过10倍交叉验证确定探针组的最佳数量(分别为n=12和n=13)。该分析鉴定了可以被用作预测性生物标记的一些基因。这些分析鉴定的探针组/基因的列表如表I中所示。表I cDAS比bExp包含了探针组/基因，其基线表达可以预测塔西单抗治疗的响应。该列表由95个探针组组成，其中12个没有绘制，将剩余的探针组绘制至72个独特的基因符号。在探针组中，通过单变量线性回归(分析I)鉴定了 88个，使用多变量LASSO分析(分析2)鉴定了 12个，用两种分析同时鉴定了 5个探针组。表2 cDAS比cEXP(cDASvs.cEXP)包含了从基线到第8周探针组/基因表达的变化，其可以预测塔西单抗治疗的响应。该列表由104个探针组组成，其中6个没有绘制，将剩余的绘制至92个独特的基因符号。在探针组中，通过单变量线性回归(分析3)鉴定了97个，使用多变量LASSO分析(分析4)鉴定了 13个，用两种分析同时鉴定了 6个探针组。表3(对于血小板进行调整的 cDAS 比 bEXP(cDASvs.bEXP.AdjustforPlatelet))包含了探针组/基因，其基线表达，结合基线血小板(platelet)计数，可以预测塔西单抗治疗的响应。该列表由81个探针组组成，其中10个没有绘制，将剩余的绘制至61个独特的基因符号。通过单变量线性回归分析(分析5)鉴定所有探针组。单变量地或在多变量模型中组合地使用所有生物标记。实施例2具有对塔西单抗的极端响应的预测倌.的探针组的组的鉴定
还进行了分析以鉴定具有对塔西单抗的极端响应(即ACR响应和EULAR响应)的预测值的探针组的组。从塔西单抗治疗的患者产生209份CEL文件(Affymetrix表达数据文件)。由于技术原因从数据组排除两份CEL文件。剩余的207份CEL文件中的111份是用于基线的样品。将本实施例聚焦在数据组Nlll。

我们考虑了四种类型的美国风湿病学会(ACR)反应，如表4中所示。表4
^ij1iilACB20RCR50|AC^
_1...........................石一g............................Q
g 1 O O:
3 I " 1 O*.....1f...........................1t..................τ.......1t我们还考虑了在第16周时的3种类型的欧洲抗风湿联盟(EULAR)响应(第I种无响应，第2种中度的，第3种良好的响应)。还评价了最初的DAS28和在第16周时DAS28的变化(“dDAS28”或“CDAS28”)以及在第16周时DAS28。在DAS28中有一个丢失的数据点，因此，我们具有在第16周时的DAS28和CDAS28的数据组N110。对于在第16周时的DAS28，我们将Cl定义为DAS28值x >= 4 (未响应的)的类型，将C2定义为具有2.6-4的范围内的X的类型，将C3定义为X < 2.6(良好的响应)的类型。对于ADAS28，我们将Cl定义为ADAS28值y <= 2.5 (响应较差)的类型，将C2定义为具有2.5-3.6的范围内的y的类型，将C3定义为y > 3.6 (良好的响应)的类型。在所有上述类型分配中，Cl代表响应较差的组，C4 (ACR)或C3 (其它指标)为良好的响应。C2 (或对于ACR的C2和C3)是中度响应的类型。探针组选择的方法
对于每个指标(ACR、EULAR、Δ DAS28和在第16周时的DAS28)，我们使用Dn3表达信号(见Liu等，J.Theortical Biol 243:273-278，2006;和正在申请的美国专利申请12/578,417)和两种不同的分组方式。一种分组是较差的响应类型比其它(良好和中度的响应类型)。其它分组是只使用极端类型(较差的响应类型比良好的响应类型)。之前给出对于第一种分组方法的样本大小，Nlll或N110。对于极端类型的分组的样本大小是N62(ACR)、N45 (EULAR)、N70 (在第 16 周时的 DAS28)和 N80 ( A DAS28)。Dn3信号(用完美匹配与不匹配强度的差异改善MAS5)对于分类结果是典型地强健的。为了完整性，我们还包括了用Pn3信号选择的探针组(仅使用完美的匹配强度，在某种意义上与RMA相似)。对于每种分组方法，我们计算了 t_统计量的绝对值并选择具有最高的t_统计量的绝对值的前100个探针组。对于4种不同的指标、2种不同的信号和2种不同的分组方法(共8组)的它们的集合包含628个探针组，如表5中所列。(对于“4种不同的指标的集合，4种不同的指标(或4种不同类型的响应)是ACR、EULAR、DAS和cDAS。集合是在不计算重复的探针组的情况下所有探针组的组合。例如，如果组I是{1，3，5，7，9}，组2是{1，2，3，4}，组 3 是{3，5}，组 4 是{9，10，11}，则这 4 组的集合是{1，2，3，4，5，7，9，10，11})。表5说明
在表5中，第一列“附:54630”列出了在邪-仍33 Plus 2.0微阵列上在针对人基因的54630个探针组的列表中的基于I的指数(1-based indices)。第二列“ID”列出了Affymetrix 探针组 ID。接下来8列提供了 8组探针组的等级和探针组是否在特定组中选择的信息。列名是指标名称，样本大小和信号(Dn3)。值0意味着在特定组中没有选择探针组。1-100的值给出了选择的探针组的等级，其中I为最高(最显著的)的一个。列“平均评分” 提供了对于前面8列的概要的评分。值0对评分没有贡献(即评分为O)。对于所有其它值(1-100)，我们计算(101-值)(所以差异在1-100的范围中，但是以相反的顺序，最大的差异，100，对应最显著的等级I)。我们计算了 8列的平均评分，并在列中列出了所有平均评分。通常，评分越高，探针组对于所有组越显著。列“基因符号”和“基因名称”提供了来自Affymetrix网站对选择的探针组的注释。为了如0080-0084行中“类型指数”的描述中所述预测临床反应，对于表5，可以使用表5的C-J列中鉴定的每组基因来形成来自多个基因的表达信号的一种或多种线性组合。通过分类算法如支持向量机(SVM, The Nature of Statistical Learning,Springer, NY, 1995; Cristianini 和 Shawe-Taylor, An Introduction to SupportVector Machines, Cambridge University Press, Cambridge, UK, 2000)来确定这些基因表达水平的线性组合的截止值。对于表5，每个指标显示一个数，可以使用(在相同列内)具有大于0的数的至少两个基因的表达。下面的实施例3和4提供了如何使用两个和三个基因转录本来预测对IL-6R拮抗剂如IL-6R抗体，例如塔西单抗的治疗的患者响应。正如本领域中理解的，也可以采用多变量模型，该模型涉及本文鉴定的额外的基因，例如，对应于表1、表2或表3中所述的那些的探针组。实施例3.组合3个探针组用于预测响应水平使用Affymetrix人基因组U133 plus v2阵列测定患者基线血液样品中的基因转录本。原始数据文件针对来自一组衍生算法的参照样品的数据进行均一化。在本实施例中，对于在三个探针组12345_at，12346_at和12347_at (表示为el，e2和e3)，提取在基因转录本水平的表达(RMA型数据)，并在线性模型中使用以得到第24周离基线DAS28评分的变化(cDAS)，如果患者接受与氨甲喋呤(MTX)组合的8mg/kg塔西单抗(TCZ)的治疗。对于TCZ 治疗:cDAS = a0 * DAS_ 基线 + al * el + a2 * e2 + a3 * e3 取决于基线DAS和el，e2和e3的基因表达值，患者DAS的预测的平均变化将为I至_7。
如果患者接受单独的MTX治疗，DAS的预测的平均变化表示如下:
对于MTX治疗:cDAS = b0 * DAS_基线
仅仅取决于患者基线DAS，DAS的预测的平均变化将为O至-3。然后，基于这些预测的差异，为每位患者作出治疗选择。例如，如果患者A对塔西单抗具有-4.5以及对MTX具有-2的预测的DAS变化，医生可能推荐TCZ治疗。患者B对TCZ具有-3以及对MTX具有-2.5的预测的DAS变化，医生可能推荐MTX治疗，因为小的额外的治疗效果可能不值得额外成本和潜在风险。实施例4.组合两个转录本以预测患者对治疗的响应
使用定量PCR(qPCR)测定患者基线血液样品中的表达水平。通过ACT表示相对表达水平。如下定义生物标记组:
阳性:al*ACTl + a2*ACT2 >= 2.1 阴性:al*ACTl + a2*ACT2〈 2.I。在塔西单抗治疗下，与生物标记阴性患者相比，生物标记阳性患者可能具有更好的响应，(55%比38%的ACR50响应率)，而当氨甲喋呤治疗时，两组都具有相似的响应率与，ACR50响应率为35%。应当理解，此处描述的实施例和 实施方式只是用于说明性目的，而且根据其的各种修饰或变化将被暗示给本领域技术人员，并包括在本申请的精神和范围以及所附的权利要求的范围内。
权利要求
1.鉴定作为用人白介素-6受体抗体治疗的候选的类风湿关节炎患者或者应当从治疗中排除的类风湿关节炎患者的方法，所述方法包括: 提供从患者的外周血淋巴细胞获得的RNA核酸样品； 确定表1、表2或表3中所述基因编码的至少一种基因产物的表达水平，所述基因与对IL-6受体抗体治疗的治疗响应相关；其中，当所述水平超过阈值时，生物标记的水平表明患者是用人白介素-6受体抗体治疗的候选；或者患者应当从治疗中排除。
2.权利要求1的方法，其中所述方法包括检测表1、表2或表3中所述基因中的至少两个、三个、四个、五个、六 个、七个、八个、九个、十个、二十个、三十个、四十个或更多个编码的基因产物的表达水平。
3.权利要求1的方法，其中所述确定表达水平的步骤包括扩增反应。
4.权利要求3的方法，其中所述扩增反应是定量RT-PCR。
5.权利要求1的方法，进一步包括记录SNP的存在与对IL-6受体抗体的治疗阳性响应的相关性。
6.权利要求5的方法，进一步包括将IL-6受体抗体施用于患者。
7.鉴定作为用人白介素-6受体抗体治疗的候选的类风湿关节炎患者或者应当从治疗中排除的患者的方法，所述方法包括: 提供来自患者的血液样品或来自外周血淋巴细胞的包含蛋白的样品； 确定表1、表2或表3中所述基因编码的至少一种基因产物的表达水平，所述基因与对IL-6受体抗体治疗的治疗响应相关。
8.诊断装置，包括用于检测表1、表2或表3中所述的两个或更多个生物标记的RNA表达水平的连接至固体表面的两个或更多个核酸探针。
9.权利要求8的诊断装置，其中所述装置包括用于检测表1、表2或表3中所述生物标记中的至少三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、二十个、三十个、四十个或更多个的RNA表达水平的探针。
10.鉴定作为用人白介素-6受体抗体治疗的候选的类风湿关节炎患者或者应当从治疗中排除的类风湿关节炎患者的方法，所述方法包括: 提供从患者的外周血淋巴细胞获得的RNA核酸样品； 确定表5的C列中具有> 0的值的至少两种基因产物的表达水平，或表5的D列中具有> 0的值的至少两种基因产物的表达水平，或表5的E列中具有> 0的值的至少两种基因产物的表达水平，或表5的F列中具有> 0的值的至少两种基因产物的表达水平，或表5的G列中具有> 0的值的至少两种基因产物的表达水平，或表5的H列中具有> 0的值的至少两种基因产物的表达水平，或表5的I列中具有> 0的值的至少两种基因产物的表达水平，或表5的J列中具有> 0的值的至少两种基因产物的表达水平； 其中超过阈值的至少两种基因产物的表达水平的线性组合表明患者是用人白介素-6受体抗体治疗的候选；或者患者应当从治疗中排除。
全文摘要
本发明提供了关于基因产物生物标记的方法、组合物和试剂盒，所述生物标记的基因表达水平与类风湿关节炎患者对IL-6受体拮抗剂如IL6抗体的治疗的治疗响应相关。可以使用本发明的方法、组合物和试剂盒来鉴定可能或不可能对IL-6受体拮抗剂治疗响应的类风湿关节炎患者。
文档编号G01N33/50GK103119176SQ201180027953
公开日2013年5月22日 申请日期2011年6月6日 优先权日2010年6月7日
发明者A.普拉特, J.王, G.雷, L.埃西欧克斯, W-m.刘, M.威廉斯 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司