专利名称：基于HiSeq测序技术检测乙型肝炎病毒分型和耐药基因的方法
技术领域：
本发明属于基因组学和分子生物学中有机生物分子领域，具体而言涉及HBV核酸样本突变位点类型的检测方法、PCR引物、标签弓I物及其试剂盒。
背景技术：
乙型肝炎病毒(HBV)感染是严重的全球公共卫生问题之一，全球约3. 5-4亿人感染HBV，每年大约有100万人死于HBV感染所致的肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌。目前，用于HBV治疗的主要有两种药物干扰素和核苷酸类药物。随着核苷酸类似物在临床上广泛应用于治疗慢性乙型肝炎，HBV的耐药问题日益凸显，已经成为临床上制约抗病毒疗效的重要 原因。而且感染不同的HBV型别其临床表现和预后也有所不同，所以对乙肝患者进行HBV分型和耐药基因的检测对指导临床用药有重要意义。然而，目前对乙肝患者进行HBV分型和耐药基因的检测手段仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个方面，提出了一种确定HBV核酸样本中突变位点类型的方法，包括下列步骤使用第一引物组，对所述HBV核酸样本进行扩增，以便得到第一扩增产物；对第一扩增产物进行测序，以便得到测序结果；以及基于测序结果，确定HBV核酸样本中是否存在突变，其中，第一引物组包含第一引物和第二引物，第一引物具有SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列，第二引物具有SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列，第一引物的5’端进一步包含第一标签序列(即正向标签)，第一标签序列具有选自如SEQ ID NO :5-52至少之一所不的核苷酸序列，第二引物的5’端进一步包含第二标签序列(即反向标签)，第二标签序列具有选自如SEQ ID NO :53-100至少之一所示的核苷酸序列。由此，能够有效地确定HBV核酸样本中突变位点的类型，并且能够同时对多种核酸样本进行分析。根据本发明的另一个方面，本发明还提供一组PCR引物，其包含第一引物和第二引物，其中第一引物具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，第二引物具有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列，其中，第一引物的5’端进一步包括第一标签序列(即正向标签)，第一标签序列具有选自如SEQ ID NO 5-52至少之一所示的核苷酸序列，第二引物的5’端进一步包含第二标签序列(即反向标签)，第二标签序列具有选自如SEQ ID NO :53-100至少之一所示的核苷酸序列。根据本发明的实施例，上述引物组还进一步包括第三引物和第四引物，第三引物具有如SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列，第四引物具有如SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列。利用根据本发明实施例的引物组，能够有效地实施前述确定HBV核酸样本中突变位点的类型的方法，进而能够用于有效地确定HBV核酸样本中突变位点的类型，并且能够同时对多种核酸样本进行分析。根据本发明的另一方面，本发明还提供一组分离的寡核苷酸，由SEQ ID NO :5-100所示的寡核苷酸构成。利用这些寡核苷酸可以作为标签，可以有效地用于高通量测序，从而能够有效地利用高通量测序平台，同时对多种样本进行测序，并通过预知的标签的核苷酸序列对所得到测序结果的来源进行区分。根据本发明的另一方面，本发明还提供一种试剂盒，其包括上述引物组或寡核苷酸组，同时，本发明还提供该试剂盒在检测HBV基因的核苷酸突变中的用途。利用根据本发明实施例的试剂盒，能够有效地实施前述确定HBV核酸样本中突变位点的类型的方法，进而能够用于有效地确定HBV核酸样本中突变位点的类型，并且能够同时对多种核酸样本进行分析。根据本发明的另一方面，本发明还提供一种确定HBV核酸样本中突变位点类型的系统。根据本发明的实施例，该系统包括扩增装置，所述扩增装置中设置有前述的一组PCR引物，用于对所述HBV核酸样本进行扩增，以便得到第一扩增产物；测序装置，所述测序装置与所述扩增装置相连，并且适于对所述第一扩增产物进行测序，以便得到测序结果；以及分析装置，所述分析装置与所述测序装置相连，用于对基于所述测序结果，确定所述HBV核酸样本中是否存在突变。利用根据本发明实施例的确定HBV核酸样本中突变位点类型的 系统，能够有效地实施前述确定HBV核酸样本中突变位点的类型的方法，进而能够用于有效地确定HBV核酸样本中突变位点的类型，并且能够同时对多种核酸样本进行分析。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中图I是根据本发明一个实施例的确定HBV核酸样本中突变位点类型的方法的流程示意图；以及图2是根据本发明一个实施例的确定HBV核酸样本中突变位点类型的系统的结构示意图。发明详细描述下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。核酸标签根据本发明的一个方面，本发明提供了一组核酸标签(在本文中有时也称为“分离的寡核苷酸”)。根据本发明的实施例，这些核酸标签分别为SEQ ID NO :5-100所示。在本说明书中，这48对核酸标签分别被命名为PI-N，其中N=l-48中的任意整数，其序列如下表I
表I标签引物的序列
权利要求
1.一种确定HBV核酸样本中突变位点类型的方法，其特征在于，包括下列 使用第一引物组，对所述HBV核酸样本进行扩增，以便得到第一扩增产物； 对所述第一扩增产物进行测序，以便得到测序结果；以及 基于所述测序结果，确定所述HBV核酸样本中是否存在突变， 其中，所述第一引物组包含第一引物和第二引物，所述第一引物具有SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列，所述第二引物具有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列， 所述第一引物的5’端进一步包含第一标签序列，所述第一标签序列具有选自如SEQIDNO 5-52至少之一所不的核苷酸序列， 所述第二引物的5’端进一步包含第二标签序列，所述第二标签序列具有选自如SEQIDNO :53-100至少之一所不的核苷酸序列。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述HBV核酸样本是从HBV的宿主中分离的。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述HBV核酸样本是从乙肝患者血清样本中分离的。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，使用第一引物组，对所述HBV核酸样本进行扩增，以便得到第一扩增产物进一步包括 使用第二引物组，对所述HBV核酸样本进行扩增，以便得到第二扩增产物；以及 使用第一引物组，对所述第二扩增产物进行扩增，以便得到所述第一扩增产物， 其中， 所述第二引物组包括第三引物和第四引物，所述第三引物具有如SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列，所述第四引物具有如SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，进一步包括通过选自琼脂糖凝胶电泳、磁珠纯化和纯化柱纯化的至少一种分离纯化所述第一扩增产物。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，对所述第一扩增产物进行测序，以便得到测序结果进一步包括 针对所述第一扩增产物，构建测序文库；以及 对所述测序文库进行测序，以便得到所述测序结果。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，利用选自Hiseq2000、S0LID、454和单分子测序装置的至少一种进行所述测序。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，针对所述第一扩增产物，构建测序文库进一步包括 将所述第一扩增产物片段化，以便得到DNA片段； 对所述DNA片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的DNA片段； 对所述经过末端修复的DNA片段进行3’端添加碱基A，以便获得3’末端添加碱基A的DNA片段； 将所述3’末端添加碱基A的DNA片段与接头相连，以便获得连接产物； 对所述连接产物进行PCR扩增，以便获得第三扩增产物；以及 将所述第三扩增产物进行纯化回收，以便获得回收产物，所述回收产物构成所述测序文库。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，通过选自化学打断方法和物理打断方法的至少一种将所述第一扩增产物片段化，其中所述化学方法包括酶切方法，所述物理打断方法包括超声波打断方法和机械打断方法。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述末端修复是利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行的，所述Klenow片段具有5’ -3’聚合酶活性和3’ -5’外切酶活性，但缺少5’ -3’外切酶活性。
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，利用Klenow(3’ -5’ exo-)对所述经过末端修复的DNA片段进行3’端添加碱基A。
12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将所述3’末端添加碱基A的DNA片段与接头相连是利用T4DNA连接酶进行的。
13.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，通过琼脂糖凝胶电泳、磁珠纯化和纯化柱纯化的至少一种纯化回收所述第三扩增产物。
14.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，基于所述测序结果，确定所述HBV核酸样本中是否存在突变进一步包括 将所述测序结果与参照序列进行比对，以便确定所述HBV核酸样本中是否存在突变。
15.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述突变为选自rtL80I/V、rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181T/V、rtN236T、rtT184G/S/A/I/L/F, rtA194T、rtS202I/G、rtM204V/I 和 rtM250V/I/L 的至少一种。
16.一组PCR引物，其特征在于，包含第一引物和第二引物，所述第一引物具有SEQIDNO :1所示的核苷酸序列，所述第二引物具有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列， 所述第一引物的5’端进一步包括第一标签序列，所述第一标签序列具有选自如SEQIDNO 5-52至少之一所不的核苷酸序列， 所述第二引物的5’端进一步包含第二标签序列，所述第二标签序列具有选自如SEQIDNO :53-100至少之一所不的核苷酸序列。
17.根据权利要求16所述的一组PCR引物，其特征在于，进一步包括第三引物和第四引物，所述第三引物具有如SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列，所述第四引物具有如SEQ IDNO 4所示的核苷酸序列。
18.—组分离的寡核苷酸，其特征在于，由SEQ ID NO :5-100所示的寡核苷酸构成。
19.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求16或17所述的一组PCR引物。
20.权利要求19所述的试剂盒在检测HBV基因的核苷酸突变中的用途。
21.根据权利要求20所述的用途，其特征在于，所述突变为选自rtL80I/V、rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181T/V、rtN236T、rtT184G/S/A/I/L/F, rtA194T、rtS202I/G、rtM204V/I 和 rtM250V/I/L 的至少一种。
22.一种确定HBV核酸样本中突变位点类型的系统，其特征在于，包括 扩增装置，所述扩增装置中设置有权利要求16或17所述的一组PCR引物，用于对所述HBV核酸样本进行扩增，以便得到第一扩增产物； 测序装置，所述测序装置与所述扩增装置相连，并且适于对所述第一扩增产物进行测序，以便得到测序结果；以及 分析装置，所述分析装置与所述测序装置相连，用于基于所述测序结果，确定所述HBV核酸样本中是否存在突变。
23.根据权利要求22所述的系统，其特征在于，进一步包括 核酸分离装置，所述核酸分离装置适于从HBV的宿主分离HBV核酸样本。
24.根据权利要求22所述的系统，其特征在于，所述测序装置为选自HiSeq2000、SOLID,454和单分子测序装置的至少一种。
25.根据权利要求22所述的系统，其特征在于，所述分析装置进一步包括比对单元，所述比对单元中存储有参照序列，用于将所述测序结果与参照序列进行比对，以便确定所述HBV核酸样本是否存在突变。
全文摘要
提供了HBV核酸样本突变位点类型的检测方法、PCR引物、标签引物及其试剂盒。其中，确定HBV核酸样本中突变位点类型的方法包括使用第一引物组，对所述HBV核酸样本进行扩增，以便得到第一扩增产物；对所述第一扩增产物进行测序；基于测序结果，确定HBV核酸样本中是否存在突变，其中，所述第一引物组包含第一引物和第二引物，所述第一引物具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，所述第二引物具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列，所述第一引物的5’端进一步包含第一标签序列，所述第二引物的5’端进一步包含第二标签序列。利用该方法能够有效确定HBV核酸样本中是否存在突变。
文档编号C12Q1/68GK102758026SQ20121022262
公开日2012年10月31日 申请日期2012年6月29日 优先权日2012年6月29日
发明者刘涛, 张印新, 梅严花, 汪建, 王玉琦, 韩颖鑫 申请人:深圳华大基因研究院, 深圳华大基因科技有限公司