专利名称：用于蛙虹彩病毒检测的标准阳性参考物质的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学检测技术领域，特别是涉及一种用于蛙虹彩病毒检测的标 准阳性参考物质。
背景技术：
甲鱼虹彩病毒(soft-shelled turtle iridovirus，STIV)是一种感染甲鱼等爬行 类水产的虹彩病毒，其发病死亡率超过40% (Chen etal.，1999，Virus Res. 63，147-151)。 目前针对甲鱼虹彩病毒的分子生物学检测方法(PCR，荧光定量PCR等)，主要使用根据该病 毒核衣壳蛋白(major capsid protein，MCP)基因中某段保守序列设计引物或探针，将阳性 核酸样品和检测样品分别在相同反应体系和反应条件下进行特异性扩增，反应结束后，对 照阳性核酸样品的目的基因或特殊信号曲线，判断检测样品是否为阳性。若无阳性核酸，检 测样品扩增出的目的基因或捕获的信号曲线便无法判断真伪。目前甲鱼虹彩病毒检测中使用的阳性核酸对照样品为从染病宿主器官或敏感细 胞系中提取的总DNA。也有报道将甲鱼虹彩病毒MCP扩增出连接入T载体，构建重组质粒 (Zhao et al. , 2007, VirusRes. 129，135-144)。但该重组质粒仅用于基因测序，未进行检测 方法相关的研究。目前甲鱼虹彩病毒检测中使用的阳性核酸对照样品有以下几个缺陷1.制备时间过长。需先人工感染宿主，或敏感细胞系，待5-7天，宿主组织器官充 分病变，或敏感细胞系CPE充分后，才可提取总DNA。2.总DNA包含大量宿主DNA，导致样品纯度差，病毒基因难以精确定量，且易出现 非特异性扩增。3.如果直接用全病毒作为对照，还存在病原扩散的风险。
发明内容
本发明的目的是提供一种标准阳性重组质粒，可在甲鱼虹彩病毒的分子生物学检 测中作为阳性参考物质。为达到上述目的，本发明的技术方案首先设计了一对可特异性扩增甲鱼虹彩病毒 核衣壳蛋白全基因的引物，其具有如SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2所示的核苷酸序列。用 其扩增出的甲鱼虹彩病毒核衣壳蛋白全基因，具有如SEQ ID N0. 3所示的核苷酸序列。然 后摸索出合适的PCR反应体系与反应条件，构建并筛选含有甲鱼虹彩病毒核衣壳蛋白全基 因的重组质粒，将其命名为pGEM-T-S。其可作为标准阳性参考物质用于甲鱼虹彩病毒核衣 壳蛋白基因(STIV MCP)、流行性造血器官坏死病毒核衣壳蛋白基因(EHNV MCP)或虎纹蛙虹 彩病毒核衣壳蛋白基因(TFV MCP)的分子生物学检测。所述分子生物学检测为PCR或荧光 定量PCR检测。本发明制备的标准阳性参考物质pGEM-T-S状态稳定，在4°C和_80°C皆可长期保 存，反复冻融也不易降解。
PGEM-T-S溶液本身不掺杂其他组织DNA，纯度高易定量，且不易产生分特异性扩 增。即可应用于PCR定性分析，也可用于荧光定量PCR制备标准曲线。pGEM-T-S结构包含STIV全MCP基因，可与所有根据MCP某段基因设计得引物特异 性结合，在分子生物学检测领域应用广泛。易于大量制备。将pGEM-T-S转化入感受态细胞后，涂平板进行兰白斑筛选。挑白 斑菌摇菌，再提取质粒即可大量制备。一般只需2-3天时间。由于STIV MCP基因与流行性造血器官坏死病毒(Epizootichaematopoietic necrosis virus, EHNV)和虎纹蛙虹彩病毒(Tiger frogvirus, TFV)的MCP基因同源性超 过97%，因此pGEM-T-S也可作为标准阳性参考物质用于EHNV和TFV MCP基因的分子生物 学检测。甲鱼虹彩病毒与流行性造血器官坏死病毒和虎纹蛙虹彩病毒同属蛙虹彩病毒属。
图1为本发明制备的标准阳性参考物质pGEM-T-S的结构示意图；图2为使用本发明的标准阳性参考物质pGEM-T-S，作为模板，使用不同病毒检测 引物进行PCR扩增的结果，其中M 分子量标准；-阴性对照；其他为相应的病毒MCP特异性 引物扩增结果；图3为使用本发明的标准阳性参考物质pGEM-T-S，作为模板，使用不同病毒检测 引物进行荧光定量PCR检测的结果，其中M 分子量标准；信号曲线从上到下依次为STIV引 物探针、TFV引物探针以及EHNV引物探针。
具体实施例方式下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式
作进一步详细描述。以下实施 例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1 本发明的标准阳性参考物质的构建1.特异性引物设计及目的基因PCR扩增根据甲鱼虹彩病毒(STIV)核衣壳蛋白(MCP)全基因序列设计并合成引物 SPl (如 SEQ ID NO. 1 所示)5' CGCATGTCTTCTGTAACTGG 和 SP2 (如 SEQ ID NO. 2 所示) 5' CGTTACAAGATTGGGAATCC。引物序列为发明人全新设计，具备以下特点特异性强，可特 异性扩增STIV MCP全基因序列；CG含量适中、两条因无TM值相近，不易形成发卡环的结构， 符合PCR使用要求；所扩增序列适合连接入T载体。目的基因长度为1397bp，序列如SEQ ID NO. 3所示。PCR体系为 20 μ 1 :STIV 总 DNA模板 0. 5ul,Buffer with Mg2+Ul,dNTP 0. 5ul，引物 (50pmol/ul)各0. 3ul，Taq DNA聚合酶0. 5ul。反应条件为94°C预处理3min，进行30个 循环，每个循环反应包括94°C 30s, 50°C 30s, 72°C lmin，循环完成后，72°C充分延伸lOmin。 使用引物SP1/SP2进行扩增。2.目的基因连接入pGem-T easy载体；标准阳性重组质粒pGEM-T-S的构建PCR扩增产物经0. 8 %琼脂糖凝胶电泳后，目的基因条带用TIANgel Midi Purification Kit(TIANGEN, China)试剂盒回收纯化。所纯化的目的基因连接入pGem_T esay 载体(Novigen)中，连接反应体系为 25ul 10*buffer 2. 5ul, pGem-T esay 载体0. 03pmol,目的基因0. 3pmol, T4DNA连接酶Iul，加双蒸水至25ul。反应条件:16°C，12-24 小时。3.连接产物转化连接产物转化入DH5ci感受态中进行蓝白斑筛选。①从-80°C取出DH5 α感受态细胞，室温迅速溶解后，立刻置于冰水上。②取100 μ 1感受态细胞加于10 μ 1连接混合物中，轻轻吹吸混勻。③静置冰水浴中，约30min。④42°C水浴热击90sec，立刻放于冰上冷却5min。⑤加900 μ 1 LB,置于 37°C温浴 60min。⑥在含氨苄青霉素(100 μ g/ml)的LB平板表面均勻涂抹7 μ IIPTG和40 μ 1 X-gal贮存液，置于37°C培养箱。⑦将温浴的感受态细胞，5000rpm离心3min，去上清，留约100 μ 1液体悬浮细菌， 均勻涂于LB/Amp/IPTG/X-gal平板上。⑧37°C温箱倒置培养过夜。4.重组质粒的提取与鉴定将白色单个阳性重组菌株接种于含Amp的LB液体培养液，37°C摇菌过夜，取1.0ml 菌液测序。目的基因成功连接的阳性菌液，以 TaKaRa MiniBEST PlasmidPurification Kit Ver 2. 0试剂盒提纯质粒，检测其浓度后换算成拷贝数浓度，梯度稀释后作为模板进行PCR 检测。扩增出目的基因的重组质粒命名为PGEM-T-S (见图1)，作为STIV检测用标准阳性参 考物质贮存。5.使用方法pGEM-T-S结构包含STIV全MCP基因，可与所有根据MCP某段基因设计得引物特异 性结合，可应用于STIV的PCR和荧光定量PCR检测。同时，由于STIV MCP基因与流行性造 血器官坏死病毒(Epizootic haematopoietic necrosis virus, EHNV)禾口虎纹娃虹彩病毒 (Tiger frog virus, TFV)的MCP基因同源性超过97%，因此pGEM-T-S也可作为标准阳性 参考物质用于EHNV和TFV MCP基因的分子生物学检测。病毒检测时，将pGEM-T-S与其他检测样品作为模板分别加入相同的反应体系中， 在相同的反应条件下扩增，反应结束后，对照PGEM-T-S的检测结果，若有相同的目的基因 或信号曲线，可判断检测样品为阳性。实施例2 使用实施例1构建的标准阳性参考物质pGEM-T-S，作为模板，使用不同病毒检测 引物进行PCR扩增，引物来源见表1。结果如图2所示，其中M 分子量标准；-阴性对照。 其他为相应的病毒MCP特异性引物扩增结果。如图2A所示，只有STIV，以及同为蛙虹彩病 毒属的EHNV和TFV有目的基因，如图2B所示，其他样品为阴性。结果表明本发明的标准阳 性参考物质pGEM-T-S不与非蛙虹彩病毒属病毒引物结合，特异性极好，适合在STIV、EHNV 和TFV的PCR检测中作为标准阳性对照。表1 :pGEM-T_S PCR特异性检测引物 实施例3 使用实施例1构建的标准阳性参考物质pGEM-T-S，作为模板，使用不同病毒检测 弓I物和探针进行荧光定量PCR检测，弓I物和探针来源见表2。引物和探针序列、反应条件和 反应体系根据相关参考文献设计。结果如图3所示，其中M 分子量标准；信号曲线从上到 下依次为STIV引物探针、TFV引物探针以及EHNV引物探针。结果表明本发明的标准阳性 重组质粒pGEM-T-S能与STIV、EHNV和TFV的MCP特异性引物探针结合，发出荧光信号，因 此适合在此3种病毒的荧光定量PCR检测中作为标准阳性对照。表2 :pGEM-T-S荧光定量PCR特异性检测引物 由以上实施例可以看出，本发明实施例通过设计特异性引物、摸索PCR反应体系 与反应条件、以及构建与筛选重组质粒，得到了一种本身不掺杂其他组织DNA，纯度高易定 量，且不易产生非特异性扩增的，用于多种蛙虹彩病毒检测的标准阳性参考物质。其可应用 于PCR定性分析，也可用于荧光定量PCR制备标准曲线。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。
权利要求
可特异性扩增甲鱼虹彩病毒核衣壳蛋白全基因的引物，其特征在于，具有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
2.甲鱼虹彩病毒核衣壳蛋白基因的全基因序列，其特征在于，具有如SEQID NO. 3所示 的核苷酸序列。
3.含有权利要求2所述全基因序列的重组质粒。
4.权利要求3所述的重组质粒作为标准阳性参考物质用于甲鱼虹彩病毒核衣壳蛋白 基因、流行性造血器官坏死病毒核衣壳蛋白基因或虎纹蛙虹彩病毒核衣壳蛋白基因的分子 生物学检测。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述分子生物学检测为PCR或荧光定量PCR 检测。
全文摘要
本发明首先设计了一对可特异性扩增甲鱼虹彩病毒核衣壳蛋白全基因的引物，其具有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。用其扩增出的甲鱼虹彩病毒核衣壳蛋白全基因，具有如SEQID NO.3所示的核苷酸序列。然后摸索出合适的PCR反应体系与反应条件，构建并筛选含有甲鱼虹彩病毒核衣壳蛋白全基因序列的重组质粒pGEM-T-S。其可作为标准阳性参考物质用于甲鱼虹彩病毒核衣壳蛋白基因(STIV MCP)、流行性造血器官坏死病毒核衣壳蛋白基因(EHNV MCP)或虎纹蛙虹彩病毒核衣壳蛋白基因(TFV MCP)的分子生物学检测。
文档编号C12Q1/68GK101921757SQ20101025630
公开日2010年12月22日 申请日期2010年8月17日 优先权日2010年8月17日
发明者张旻, 江育林 申请人:中国检验检疫科学研究院