抗玻勒虹彩病毒的单克隆抗体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗玻勒虹彩病毒的单克隆抗体及其应用。该抗玻勒虹彩病毒单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC?No.8555的小鼠杂交瘤细胞株分泌产生的。该抗玻勒虹彩病毒的单克隆抗体可用于检测细胞培养中玻勒虹彩病毒。本发明还公开了一种检测玻勒虹彩病毒的ELISA试剂盒。
【专利说明】抗玻勒虹彩病毒的单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于免疫学领域，具体涉及一种抗玻勒虹彩病毒的单克隆抗体，杂交瘤细胞株，及其应用。
【背景技术】
[0002]玻勒虹彩病毒(Bohle virus, BIV)属于虹彩病毒科娃病毒属的确定成员。娃病毒属以蛙病毒3型(FV3)为代表种，确定成员除了玻勒虹彩病毒(Bohle virus, BIV)外还有欧鮰病毒(European catfish virus, ECV)、欧鲇病毒(European sheatfish virus, ESV)和桑蒂库帕娃病毒(Santee-Cooper ranavirus)等。娃病毒的病毒颗粒较大(150~180nm),呈二十面体立体对称。基因组为150~170kb的双链DNA，在胞核和胞质中均可进行复制。
[0003]该病毒的宿主范围很广泛，包括鱼类、两栖类、爬行类和一些易感染的其他动物种类。为了及时防止在水环境中玻勒虹彩病毒危害性的扩大，需要进一步了解其宿主的范围，这就要求尽快发展一种有效的检测技术。
[0004]目前，病毒分离和PCR方法是应用于玻勒虹彩病毒诊断的常用方法。但病毒分离法耗时较长，不易作为快速诊断；PCR方法，虽然用时较短，但是成本较高，不易作为大规模调查。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种抗玻勒虹彩病毒的单克隆抗体、应用该单克隆抗体的检测玻勒虹彩病毒的ELISA试剂盒，以及体外检测玻勒虹彩病毒的方法。
[0006]为解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案:
[0007]本发明所提供的抗玻勒虹彩病毒的单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCCN0.8555的杂交瘤细胞株分泌产生的。该小鼠杂交瘤细胞株已于2013年12月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址是中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，其保藏编号为CGMCC N0.8555，分类命名为玻勒虹彩病毒的杂交瘤细胞株。
[0008]保藏编号为CGMCC N0.8555的小鼠杂交瘤细胞株也属于本发明的保护范围。
[0009]本发明还提供了一种检测玻勒虹彩病毒的ELISA试剂盒，该试剂盒包括已包被本发明所述的单克隆抗体的固相载体。优选地，还包括羊抗玻勒虹彩病毒的多克隆抗体，和酶标抗羊的抗体。所述酶为辣根过氧化酶。
[0010]本发明采用商业化购买的酶标抗羊的抗体，是因为一方面，若标记本发明中表述的单克隆抗体或者是多克隆抗体，过程比较复杂。即使成功，都可能影响抗体的效价或者抗体的其他方面，使整个试剂盒研发更加繁琐，耗力，耗时。而应用商业化酶标抗羊的抗体，则不存在这个问题；另一方面，若标记本发明中的单克隆抗体或者是多克隆抗体，整个试剂盒的成本费用就很高，对于试剂盒推广应用是不可行的。应用商业化酶标抗羊的抗体(sigma)，每1ml费用是1000元左右，降低了试剂盒的成本。
[0011] 进一步地，为了便于检测，本发明试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，以及ELISA反应所需的酶联免疫检测试剂。其中，所述阳性对照为玻勒虹彩病毒溶液，阴性对照为鱼类细胞悬液或者是正常组织匀浆液。所述酶联免疫检测试剂，均为常规的酶联免疫检测试剂，包括但不限于，酶的底物反应液、洗漆液和反应终止液。
[0012]本发明所述的羊抗玻勒虹彩病毒的多克隆抗体的制备过程如下:用玻勒虹彩病毒作为抗原，多点注射免疫山羊，分别是每I周免疫一次，共免疫4次，取血清，即为羊抗玻勒虹彩病毒的多克隆抗体。
[0013]本发明还提供了一种检测玻勒虹彩病毒的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤:
[0014](I)将待测样品加样于包被有权利要求1所述的单克隆抗体的固相载体；
[0015](2)将羊抗玻勒虹彩病毒的多克隆抗体加样于步骤(1)获得的固相载体；
[0016](3)将酶标抗羊的抗体加样于步骤(2)获得的固相载体；
[0017](4)检测酶标记物，确定待测样品中玻勒虹彩病毒的存在与否或存在的量，从而确定玻勒虹彩病毒的存在与否。
[0018]本发明的有益效果如下:
[0019]1.分泌本发明所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株增殖后可制备大量所需的特异抗体。杂交瘤细胞注射小鼠后，产生的腹水单抗ELISA效价为1:1X 106。杂交瘤细胞株活性高，液氮中冻存8-10个月后，仍能快速复苏并保持良好活性。在所述的单克隆抗体的制备中，细胞融合率为97.6%,阳性率为98.0 %。
[0020]2.免疫小鼠的抗原是根据免疫耐受的原理，以简单的差速离心方法粗提纯浓缩的病毒悬液作为免疫原，免疫小鼠。该免疫方法经多次实验数据已证实其主要优势是即保证了细胞融合后的阳性效果，又简化了抗原的制备方法。
[0021 ] 3.在筛选过程中，应用了间接ELISA方法，在这种方法中包埋板子采取一次性包埋了大量ELISA板子，保证整个实验的统一性，进而保证了获得制备抗玻勒虹彩病毒的单克隆抗体的准确性。
[0022]4.建立的检测玻勒虹彩病毒的夹心ELISA方法，能够准确的检测出细胞悬液中的病毒存在与否。该检测方法，对于进出口检验检疫机构在检验检疫玻勒虹彩病毒方面提供了有利的条件。
【具体实施方式】
[0023]为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
[0024]实施例1抗玻勒虹彩病毒的单克隆抗体的制备
[0025]1.抗原的制备
[0026] 以差速离心的方法粗提纯的玻勒虹彩病毒(Bohle virus, BIV) (J Pallister1AGould,D Harrison, A Hyatt, J Jancovich and H Heinel.Development of real-timePCR assays for the detection and differentiation of Australian and Europeanranaviruses, Journal of Fish Diseases2007，30，427-438)悬液，即先 8000r/min，离心35min 后，24000r/min，离心 2hr，收集沉淀，用 0.5ML 的 0.01mol/L 的 PBS 重悬，_80°C保存。[0027]2.免疫小鼠
[0028]免疫用的小鼠为SPF级5周龄雌性BALB/c小鼠。每只小鼠以上述纯化的病毒悬液为抗原进行腹腔注射基础免疫，病毒悬液与弗氏完全佐剂1:1混合，腹腔注射0.2ML ;2周后加强免疫，病毒悬液与弗氏不完全佐剂1:1混合，腹腔注射0.1ML ;之后每隔I周加强免疫I次，腹腔注射，病毒悬液0.2ML ;第4次免疫后第3天，将小鼠脱颈椎处死，无菌取脾脏用于细胞融合。
[0029]3.细胞融合
[0030] 常规的细胞融合技术:取免疫小鼠的脾脏和SP2/0骨髓瘤细胞进行融合后，加入小鼠的胸腺细胞与融合细胞在HAT培养系中共培养。
[0031]所述技术中应用的HAT培养基的配制:将50倍浓缩的HAT (2ml，GIBCO公司)及特级胎牛血清(20ml，杭州四季青生物工程材料有限公司)加入到改良型RPMI1640培养基(80ml, hyclone公司)中混匀。
[0032]4.杂交瘤细胞的筛选与克隆
[0033]融合细胞培养10天后，收取细胞培养上清，以梯度离心纯化的玻勒虹彩病毒作为抗原进行间接ELISA检测。筛选出的阳性杂交瘤细胞株有限稀释法进行克隆。其中阳性的小鼠杂交瘤细胞株(BIV-3A4)已于2013年12月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址是中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏编号为 CGMCC N0.8555。
[0034]5.腹水的诱生
[0035]取6~8周龄雌性Balb/C小鼠，腹腔内注射无菌的液体石蜡0.5ml/只；1周后，腹腔内注射阳性杂交瘤细胞；接种杂交瘤细胞后7~10天，见小鼠腹部明显膨大，抽腹水，离心后收集上清，_80°C冻存备用。
[0036]实施例2:抗玻勒虹彩病毒的单克隆抗体的特性鉴定
[0037]1.单克隆抗体的腹水效价鉴定
[0038]方法:采用间接ELISA法对单克隆抗体的腹水效价进行鉴定。
[0039]结果:本发明所述的单克隆抗体腹水效价为1:1X 106，表明杂交瘤细胞株具有分泌高滴度抗体的能力。
[0040]2.单克隆抗体的亚型鉴定
[0041]方法:应用美国的SouthernBiotech 的分型试剂盒(SBA Clonotyping?System/HRP)，依照其说明书对本发明所述单克隆抗体的Ig亚型进行鉴定。
[0042]结果:本发明所述单克隆抗体的亚型为IgG2b型k链。
[0043]3.单克隆抗体的特异性分析
[0044]方法:采用间接ELISA方法，检测单克隆抗体分别与玻勒虹彩病毒(BIV)、鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus, SVCV)、病毒性出血败血症病毒(Viralhaemorrhagic septicaemia virus, VHSV)和传染性造血器官坏死病毒(Infectioushematopoietic necrosis virus, IHNV)反应。结果显示单克隆抗体特异性好,仅与玻勒虹彩病毒发生反应，与其他病毒株以及细胞均不发生反应。
[0045]表1单克隆抗体的特异性分析(P/N值)
[0046]
【权利要求】
1.一种抗玻勒虹彩病毒的单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC N0.8555的杂交瘤细胞株分泌产生的。
2.分泌产生抗玻勒虹彩病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCCN0.8555。
3.权利要求1所述的单克隆抗体在检测玻勒虹彩病毒中的应用。
4.权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求2所述的杂交瘤细胞株在制备检测玻勒虹彩病毒试剂盒中的应用。
5.一种检测玻勒虹彩病毒的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括已包被权利要求I所述的单克隆抗体的固相载体。
6.根据权利要求5所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括羊抗玻勒虹彩病毒的多克隆抗体，和酶标抗羊的抗体。
7.根据权利要求6所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述酶为辣根过氧化酶。
8.根据权利要求5或6所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照。
9.根据权利要求8所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括底物反应液、洗涤液和反应终止液。
10.一种检测玻勒虹彩病毒的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: (1)将待测样品加样于包被有权利要求1所述的单克隆抗体的固相载体； (2)将羊抗玻勒虹彩病毒的多克隆抗体加样于步骤(1)获得的固相载体； (3)将酶标抗羊的抗体加样于步骤(2)获得的固相载体； (4)检测酶标记物，确定待测样品中玻勒虹彩病毒的存在与否或存在的量，从而确定玻勒虹彩病毒的存在与否。
【文档编号】C12N5/20GK103910795SQ201410169309
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年4月25日 优先权日:2014年4月25日
【发明者】景宏丽, 王娜, 张旻, 林祥梅, 吴绍强 申请人:中国检验检疫科学研究院