含戊型肝炎病毒rna片段的假病毒颗粒及其制备方法

含戊型肝炎病毒rna片段的假病毒颗粒及其制备方法
【专利摘要】本发明提供一种含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒及其制备方法，该假病毒颗粒是由MS2噬菌体外壳蛋白包裹戊型肝炎病毒RNA的一种RNA-蛋白复合体，RNA-蛋白复合体的形状为球状；设计并人工合成引物通过PCR的方法得到目的基因MS2，将其连接到质粒pET-28b(+)上得到重组质粒pET-28b/MS2/HEV重组质粒导入大肠杆菌进行原核表达，采用聚乙二醇法沉淀病毒样颗粒，所得病毒样颗粒即为含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒。本发明的假病毒颗粒可作为通用HEV基因I-IV型RT-PCR检测的标准品和质控品，无传染性，安全可靠、稳定性高，具有耐核糖核酸酶的特点。
【专利说明】含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及戊型肝炎病毒，具体说是一种含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒及其制备方法。
【背景技术】
[0002]戊型肝炎病毒Ofepatitis E virus，HEV)是经消化道、血液传播的一种肝炎病毒。该病毒感染谱十分广泛，目前已证实的感染宿主除人之外，还有其它多种动物，如猪、猴、鸡等。HEV有四个基因型，I型和IV型仅限于人际间传播，III型和IV型为人畜间交叉传播；人感染临床患者多为轻中型肝炎，常为自限性，但孕妇患戊型肝炎病情严重病死率可达20%，因此，世界卫生组织(WHO)将HEV确定为本世纪新发现的一种人畜共患病病原，其导致的全球公共卫生安全问题日益受到各国的关注。相应的开发各种HEV检测技术和方法也变得十分必要和紧迫。[0003]HEV是一种直径约为27nm的无包膜单股正链RNA病毒。HEV基因组全长约7.5kb，在5’和3’非编码区之间含有三个开放阅读框(ORF)，依次为0RF1、0RF2和0RF3。由于病毒核酸及其编码的氨基酸在具有高度同源性的基础之上有着广泛的地理分布和一定的遗传异质性等特点，一因此，在临床上的分子生物学检测中常常以ORFl、0RF2和0RF3为检测目标基因。
[0004]以HEV核酸检测为例，一般有以下三个主要步骤需要阳性参照:
[0005]1、从标本中提取HEV RNA，包括:病毒外膜、核衣壳打开或破碎，核酸释放。
[0006]2、HEV RNA 被逆转录为 cDNA。
[0007]3、cDNA与PCR反应液和DNA多聚酶混合，在PCR仪中扩增并得到信号。
[0008]现有的阳性参照，主要有下述几种来源:患者或被感染动物阳性血清；体内或体外转录RNA ;质粒或化学合成。
[0009]所有阳性参照中，最准确可靠的应该是含该HEV病毒的天然样本(如患者或被感染动物的血液、粪便处理液、细胞培养液)，同质性可充分保证其作为前述三个步骤的阳性参照，但其缺陷在于天然样本来源有限，且存在天然病毒散播的潜在危害性。
[0010]克服天然病毒来源少且具有传染性的缺点，一般可通过离体培养来解决，即将HEV导入合适的人工培养宿主细胞系，重组HEV颗粒即可从细胞中产生并分泌至培养上清。然而，该病毒感染谱窄感染滴度低且关键培养步骤只为少数实验室所拥有；另一方面，这种HEV生产方式可能尚存在若干缺陷，如成本高、病毒数量仍然较低、结构不天然、重复性差
坐寸ο
[0011]体外转录的HEV RNA，因为它与标本中待测指标一样，都是RNA，因此可以作为逆转录的阳性参照；但是，由于其不具备病毒外壳，因此不适合作为从标本中提取病毒RNA操作的阳性参照。
[0012]用质粒作为阳性参照，其优点是制备纯化容易，但由于质粒是闭合环状超螺旋双链形式，非单线性，不是RNA，因此它只能作为PCR参照，而无法作为RNA提取和逆转录的参照。
[0013]至于化学合成法制备RNA阳性参照，以目前技术成本非常高，还会因为没有核衣壳、膜的保护而容易降解，因此到目前为止尚无实际应用的报道。
[0014]人工假病毒是将目的RNA病毒基因的特定片断克隆至含有噬菌体基因的表达载体上，通过诱导表达产生被噬菌体衣壳蛋白包被的RNA片断，这种新的RNA质控制备技术又称装甲 RNA (Armored RNA)技术(Pasloske B Lj et al.Armored RNA technology forproduction of ribonuclease-resistant viral RNA controls and standards[J].J ClinMicrobiol, 1998, 36(12):3590-3594)。该技术解决了传统RNA质控品存在的诸多弊端问题(要么稳定性差、要么存在生物安全隐患、要么达不到监测核酸提取及反转录全过程的目的等。
[0015]目前构建假病毒颗粒的常用假病毒载体主要由可以编码MS2噬菌体外壳蛋白的基因序列和具有高效表达的表达载体组成。MS2噬菌体是单链正性RNA病毒，基因组全长3569碱基对，编码成熟酶蛋白、包膜蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白等四种蛋白质分子。一个噬菌体病毒颗粒是由180包膜蛋白单体、一分子成熟酶蛋白，包裹一分子基因组RNA组成的正二十面体(贾盘兴.噬菌体分子生物学-基本知识和技能[M].北京:科学出版社，2001,2-5) 0在MS2噬菌体外壳蛋白的研究中发现外壳蛋白与噬菌体复制酶5’端19碱基茎环结构RNA序列有特异性相互作用，这种作用可引发噬菌体外壳的组装，同时又将噬菌体基因组RNA包装到包膜内。研究人员发现在包装位点后引入非噬菌体基因序列也可以引发包装。因此，如果将外源基因克隆于MS2噬菌体外壳蛋白基因编码序列下游，并在其下游插入终止子，转录后得到带有噬菌体操纵子RNA序列的外源基因RNA转录本，诱导表达过程中噬菌体外壳蛋白得以表达并组装成蛋白外壳，并将携带有外源基因的噬菌体基因组包裹到包膜内，构成噬菌体病毒样颗粒。由于单独表达的外壳蛋白组装过程不成熟，不能得到耐RNase的病毒包膜，研究者将MS2噬菌体的成熟酶蛋白和外壳蛋白的基因编码序列以及其基因组部分包含基因调节元件序列的5’非编码序列相应的cDNA序列都连接到表达载体启动子下游，经过诱导表达得到成熟酶蛋白和外壳蛋白，在成熟酶以及噬菌体基因组RNA的协同作用下，外壳蛋白可组装为成熟的假病毒颗粒外壳，并具有耐RNase作用的特性(Walker Peach C R, et al.Ribonuclease resistant RNA controls(Armored RNA)forreverse transcription—PCR, branched DNA, and genotyping assays for hepatitis Cvirus [J], Clin Chem, 1999，45(12):2079-2085)。所以利用装甲 RNA (Armored RNA)技术所制备的人工假病毒在应用于核酸检测试剂阳性对照或核酸标准物质，具有特异性强，灵敏度高，稳定性强的优点。

【发明内容】

[0016]基于上述不足之处，本发明的目的在于提供一种含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒及其制备方法。
[0017]本发明的目的是通过如下方法实现的:
[0018]1、一种含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒，如序列表SEQ ID N0.1所示；
[0019]2、一种含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，具体制备步骤如下:
[0020](l)pET_28b/MS2重组质粒的构建[0021](l)pET_28b/MS2重组质粒的构建
[0022](1.1)设计PCR扩增MS2噬菌体的MS2基因的引物对，
[0023]上引物Pri_MS2F:如序列表Seq ID N0.2所示，
[0024]下引物Pr1-MS2R:如序列表Seq ID N0.3所示；
[0025]然后通过RT-PCR的方法扩增出MS2基因并克隆，如序列表SEQ ID N0.4所示；
[0026](1.2)采用限制性内切酶Nco I和BamH I分别双酶切MS2基因和质粒pET-28b (+)，纯化后进行连接，得到连接产物；
[0027](1.3)将步骤(1.2)所 得到的连接产物转化入大肠杆菌感受态DH5 α，提取质粒并进行PCR和双酶切鉴定，将鉴定正确的重组质粒于_20°C保存；
[0028](2) pET-28b/MS2/NV 重组质粒的构建
[0029](2.1)人工合成戊型肝炎病毒HEV 0RF2/3基因片段的PCR扩增引物对，
[0030]上引物Pr1-0RF2/3F:如序列表 SEQ ID N0.5 所示，
[0031]下引物Pr1-0RF2/3R:如序列表 SEQ ID N0.6 所示，
[0032]然后通过RT-PCR的方法扩增出部分0RF2/3基因并克隆，如序列表SEQ ID N0.7所示；
[0033](2.2)采用限制性内切酶BamH I和HindIII分别双酶切0RF2/3基因克隆质粒和质粒pET-28b/MS2，纯化后进行连接，得到连接产物；
[0034](2.3)将步骤(2.2)所制备的连接产物转化导入大肠杆菌感受态DH5 α，提取质粒并进行单双酶切鉴定，将鉴定正确的重组质粒命名为pET-28b/MS2/HEV ；
[0035](3)诱导表达与纯化
[0036]将步骤⑵中鉴定正确的重组质粒pET_28b/MS2/HEV的阳性菌落，接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，培养至0D600值为0.5-1.0时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mmol/L,继续培养5h，离心收集菌体；重悬于适量TE溶液中，加入溶菌酶至终浓度为10mg/L，混匀后37°C水浴作用30min，离心去除沉淀，向上清液中加入核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶I至终浓度均为lmg/L，37°C水浴作用lh。然后采用聚乙二醇沉淀法浓缩病毒样颗粒物，即为本发明含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒，将其溶解于TE缓冲液中，4°C保存；
[0037]3、如上所述一种含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，所述的MS2基因为可表达的MS2噬菌体成熟酶蛋白和包膜蛋白的基因及部分裂解蛋白和复制酶的基因编码序列。
[0038]4、如上所述一种含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，所述的HEV基因片段的序列为HEV G1-4型最保守的0RF2区与0RF3区交叠的5225-5510碱基处，如序列表SEQ ID N0.6所示。
[0039]5、如上所述一种含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，所述的HEV基因片段的序列为HEV G1-4型最保守的0RF2区与0RF3交叠的5225-5510碱基，并于其尾部人工设计引入了 24个T碱基，转录时产生的PolyA可作为通用引物Oligo (dT)的特异互补结合区。
[0040]6、如上所述一种含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒是由MS2噬菌体个壳蛋白包裹肝炎病毒RNA的一种RNA-蛋白复合体；其内含有HEV基因G1-4型0RF2保守序列区RNA序列，该RNA-蛋白复合体具有耐核糖核酸酶的特性。
[0041]本发明提供的假病毒载体pET_28b/MS2/HEV在用于制备HEV假病毒颗粒具有如下特点:
[0042]1、通用性好，为HEV基因型1-1V的核酸共同保守区、即0RF2与0RF3的交叠部分，因此，该HEV假病毒颗粒可在检测基因型1-1V的HEV时作为通用的阳性质控参照；另外，HEV假病毒颗粒包裹的HEV基因序列尾部人工引入的24个Poly-A多聚腺苷酸尾，可以模拟RNA病毒cDNA合成时Oligo(dT)引物的特异互补结合区，因此，当以Oligo (dT)引物进行RNA病毒反转录时具有很好的通用性。
[0043]2、稳定性好，耐核酸酶、易保存。由于HEV 0RF2基因组RNA包裹在假病毒的外壳蛋白之内，所以可以抵抗外界核酸酶的作用，不易被降解。在室温条件下可以保存一个月，低温条件下保存时间更长，解决了 RNA质控品在使用过程中的稳定性问题。
[0044]3、极大的仿真性，在核酸制备及鉴定的全程监控过程中，HEV假病毒颗粒的RNA-蛋白复合体结构与天然病毒相似，因此可以把病毒颗粒等同为病毒材料，一同经过RNA提取、反转录后进行PCR扩增，很好地对靶RNA病毒的检测过程进行了全程的质量监控，保证了试验数据的可靠性。
[0045]4、安全性高，HEV假病毒颗粒子仅具有类似病毒核衣壳，包裹核酸RNA不具有传染性，丧失了病毒的自我复制能力，所以HEV假病毒颗粒子无传染性，不会对实验人员构成伤害，也不会圣环境产生污染影响。
[0046]5、易于纯化，由于假病毒颗粒是在原核大肠杆菌中表达其产物为HEV RNA-蛋白质复合体，在细菌体裂解时可迅速释放到上清液中，简单离心之后即可将菌体碎片除去，提高了假病毒颗粒的纯化效率。
【专利附图】

【附图说明】
[0047]图1是HEV假病毒载体pET_28b/MS2/HEV的酶切鉴定结果，
[0048]其中:1为 DNA Markerlkbp Ladder ；2 为 pET_28b/MS2/HEV 重组质粒的单酶切结果；3 为 pET-28b/MS2/HEV 重组质粒 Nco 1、HindIII 的双酶切结果；4 为 pET_28b/MS2/HEV重组质粒BamH 1、HindIII双酶切结果；5为pET_28b/MS2/HEV重组质粒Nco 1、BamH I双酶切结果；6为pET-28b(+)质粒单酶切结果。
[0049]图2是HEV假病毒载体pET_28b/MS2/HEV结构模式图，从左至右的矩形框内分别代表以Nco I/BamH I双酶切插入到pET_28b载体中的MS2基因序列和以BamH I/HindIII双酶切的HEV 0RF2/3保守序列加24个Poly-A尾巴。
[0050]图3是HEV假病毒颗粒的RT-PCR鉴定结果，
[0051]其中:M为DNA MarkerlOObp Ladder ;1_7分别为IO4至101°倍稀释的纯化后HEV假病毒颗粒样本RT-PCR检测结果；8-9分别为ddH20为模板的RT-PCR和PCR对照检测结果；10-16分别为IO4至101°倍稀释的纯化后HEV假病毒颗粒样本的未经反转录直接PCR检测结果。
[0052]图4是HEV假病毒颗粒的核糖核酸酶(RNase A)抗性检测结果，
[0053]其中:M为 DNA MarkerlOObp Ladder ； 1-4 分别为经过 RNaseAI μ L/5 μ L/10 μ L/15 μ L处理过的HEV假病毒颗粒样本的RT-PCR检测结果；5为不加RNase A处理的HEV假病毒颗粒样本RT-PCR检测对照。
[0054]图5是HEV假病毒颗粒对温度的敏感性鉴定结果，
[0055]其中，M为 DNA MarkerlOObp Ladder ;1_6 道分别为每份 250 μ L 的 IO4 稀释纯化后的HEV假病毒颗粒样本置于下如下条件:60°C /lh、37°C /10h、25°C /10d、4°C /30d、-20°C /90d 和-80°C /180d 之后进行 RT-PCR 检测的结果。
【具体实施方式】
[0056]以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范
围。
[0057]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例中所用的生化试剂均为市售购买得到。
[0058]实施例1HEV前假病毒载体pET_28b/MS2的构建
[0059]1、人工合成GenBank数据库中的MS2噬菌体基因序列(NC_001417)并通过合成的序列设计装配蛋白和包膜蛋白基因的引物对Pr1-MS2F、Pr1-MS2R，并对其进行人工合成。
[0060]Pr1-MS2F:5’ -GGTCCATGGCCTTTCGGGGTCCTGCTCAACTT-3> (下划线表示引入的酶切位点为Nco I)
[0061]Pr1-MS2R:5’ -GGTGGATCCGCTGAGGGAATCGGGTTTCCATCTT-3> (下划线表示引入的酶切位点为BamH I)
[0062]2、PCR扩增，PCR产物连接至克隆T载体pMD18_T，构建pMD18_T/MS2质粒。
[0063]3、用快酶Nco I和BamH I分别双酶切重组质粒pMD18_T/MS2和pET28b (+)表达
载体(均为本实验室保存)。酶切体系如下:
[0064]
【权利要求】
1.一种含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒，其特征在于，如序列表SEQ ID N0.1所示；
2.一种含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，其特征在于，具体制备步骤如下: (1)pET-28b/MS2重组质粒的构建 (1.1)设计PCR扩增MS2噬菌体的MS2基因的引物对， 上引物Pr1-MS2F:如序列表Seq ID N0.2所示， 下引物Pr1-MS2R:如序列表Seq ID N0.3所示； 然后通过RT-PCR的方法扩增出MS2基因并克隆，如序列表SEQ ID N0.4所示； (1.2)采用限制性内切酶Nco I和BamH I分别双酶切MS2基因和质粒pET_28b (+)，纯化后进行连接，得到连接产物； (1.3)将步骤(1.2)所得到的连接产物转化入大肠杆菌感受态DH5ci，提取质粒并进行PCR和双酶切鉴定，将鉴定正确的重组质粒于_20°C保存； (2)pET-28b/MS2/NV重组质粒的构建 (2.1)人工合成戊型肝炎病毒HEV 0RF2/3基因片段的PCR扩增引物对， 上引物Pr1-0RF2/3F:如序列表SEQ ID N0.5所示， 下引物Pr1-0RF2/3R:如序列表SEQ ID N0.6所示， 然后通过RT-PCR的方法扩增出部分0RF2/3基因并克隆，如序列表SEQ ID N0.7所示；(2.2)采用限制性内切酶BamH I和HindIII分别双酶切0RF2/3基因克隆质粒和质粒pET-28b/MS2，纯化后进行连接，得到连接产物； (2.3)将步骤(2.2)所制备的连接产物转化导入大肠杆菌感受态DH5ci，提取质粒并进行单双酶切鉴定，将鉴定正确的重组质粒命名为pET-28b/MS2/HEV ； (3)诱导表达与纯化 将步骤⑵中鉴定正确的重组质粒pET-28b/MS2/HEV的阳性菌落，接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，培养至0D600值为0.5-1.0时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mmol/L，继续培养5h，离心收集菌体；重悬于适量TE溶液中，加入溶菌酶至终浓度为10mg/L，混匀后37°C水浴作用30min，离心去除沉淀，向上清液中加入核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶I至终浓度均为lmg/L，37°C水浴作用lh。然后采用聚乙二醇沉淀法浓缩病毒样颗粒物，即为本发明含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒，将其溶解于TE缓冲液中，4°C保存。
3.如权利要求2所述的一种含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，其特征在于:所述的MS2基因为可表达的MS2噬菌体成熟酶蛋白和包膜蛋白的基因及部分裂解蛋白和复制酶的基因编码序列。
4.如权利要求2所述的一种含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，其特征在于:所述的HEV基因片段的序列为HEV G1-4型最保守的0RF2区与0RF3区交叠的5225-5510碱基处，如序列表SEQ ID N0.6所示。
5.如权利要求2所述一种含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，其特征在于，所述的HEV基因片段的序列为HEV G1-4型最保守的0RF2区与0RF3交叠的5225-5510碱基，并于其尾部人工设计引入了 24个T碱基，转录时产生的Poly A作为通用引物Oligo(dT)的特异互补结合区。
6.如权利要求2所述一种含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，其特征在于，含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒是由MS2噬菌体个壳蛋白包裹肝炎病毒RNA的一种RNA-蛋白复合体；其内含有HEV基因G1-4型0RF2保守序列区RNA序列，该RNA-蛋白复合体具有 耐核糖核酸酶的特性。
【文档编号】C12N7/04GK103923887SQ201410168941
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月16日 优先权日:2014年4月16日
【发明者】高慎阳, 查恩辉, 周铁忠, 李丹丹, 董筱萍 申请人:辽宁医学院