一种检测人HEV IgM及IgG的免疫层析试纸及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于体外诊断技术领域，尤其是涉及一种一种检测人HEV IgM及IgG的免疫层析试纸及其制备方法。
【背景技术】
[0002]目前，临床上对戊型肝炎病毒IgM抗体的诊断主要采用酶联免疫法(ELISA)、放免法(RIA)和化学发光法等。最普及的方法仍是酶联免疫法(ELISA)。放免法(RIA)因其标记物有效期短和有放射性污染物而被市场逐步淘汰。化学发光法(CLIA)，它是在化学发光反应的基础上与免疫反应相结合建立的新技术，它不仅具有免疫反应的特异性，而且具有化学发光反应的高灵敏性。采用化学发光测量仪，具有灵敏度高、稳定性好、快速、准确和简便等优点，无放射性污染，但所用试剂和自动化分析仪均为国外产品，价格昂贵尚难全面普及；EIA法，须经孵育、洗涤、显色、判读等步骤，过程较为繁琐，检测时间长。
[0003]戊型肝炎病毒(HEV)感染的诊断主要依赖于抗HEV IgG及IgM的检测，单独检测一项指标用于戊肝诊断均存在一定的局限性，易发生漏检现象。
【发明内容】
[0004]为了克服现有技术的不足，本发明提供一种漏检率低的检测人HEV IgM及IgG的免疫层析试纸及其制备方法。
[0005]本发明的目的之一是提供一种检测人HEV IgM及IgG的免疫层析试纸，所述试纸包括样品垫、金标抗原结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板；
所述硝酸纤维素膜在所述底板的中部，在所述硝酸纤维素膜沿底板的一端依次为金标抗原结合垫、样品垫，在所述硝酸纤维素膜沿底板的另一端为吸水垫，且每相邻两者之间部分叠合；
所述硝酸纤维素膜包含包被有抗人IgM抗体及包被有抗人IgG抗体的检测区和包被有抗兔IgG抗体的质控区；所述硝酸纤维素膜靠近吸水垫一端为质控区，另一端为检测区；所述检测区设有检测线(T1、T2线)，所述质控区设有质控线(C线)；
所述的金标抗原结合垫2上包被有胶体金标记的HEV抗原及胶体金标记的兔IgG抗体或乳胶标记的HEV抗原及乳胶标记的兔IgG抗体或胶体硒标记的HEV抗原及胶体硒标记的兔IgG抗体。
[0006]优选，样品垫为亲水性微孔结构材料。
[0007]优选，所述亲水性微孔结构材料为无纺布或玻璃纤维。
[0008]优选，质控区设有一个质控线(C线)。
[0009]优选，所述抗人IgM的宿主为:鼠、羊、兔、鸡、马等；抗人IgG的宿主为:鼠、羊、兔、
鸡、马等；抗兔IgG抗体的宿主为:鼠、羊、兔、鸡、马等；HEV抗原为:基因工程重组抗原或天然培养抗原。
[0010]优选，所述硝酸纤维素膜上包被有抗人IgM抗体及包被有抗人IgG抗体的检测区的检测区在包被有抗IgG抗体的质控区的下方。
[0011]优选,所述试纸宽度为2mm-6mm。
[0012]本发明的另一发明目的是提供一种检测人HEV IgM及IgG的免疫层析试纸的制备方法，包括以下步骤:
a)准备样品垫、吸水垫；
b)准备金标抗原结合垫
1)HEV金标抗原:用碱性溶液将胶体金溶液pH调至至7.0-10.0,混合HEV抗原与胶体金溶液，然后加入蛋白保护剂，再采用高速冷冻离心的方法对所得金标抗原进行纯化，并用胶体金悬浮液进行复溶得到HEV金标抗原；
2)兔IgG金标抗体:用碱性溶液将胶体金溶液pH调至至7.0-10.0,混合兔IgG与胶体金溶液，然后加入蛋白保护剂，再采用高速冷冻离心的方法对所得金标抗原进行纯化，并用胶体金悬浮液进行复溶得到兔IgG金标抗体；
3)将所得HEV金标抗原及兔IgG金标抗体按一定比例混合后喷点到金标抗原结合垫上，干燥后即为金标抗原结合垫；
c)准备硝酸纤维素膜
在硝酸纤维素膜辅料的一侧喷点抗人IgM抗体作为Tl检测线，中间喷点抗人IgG抗体作为T2检测线，另一侧喷点抗IgG抗体作为质控线(C线)；
d)顺次将所述样品垫、金标抗原结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫相互搭接在底板上，并用切刀机切割成所需宽度的试纸条。
[0013]优选，所述胶体金溶液的制备方法为:将10ml 0.01%的HAuClyK溶液加热至沸腾，在剧烈搅拌下迅速加入0.5-10ml的柠檬酸三纳溶液，保持沸腾状态反应3-30min后停止加热，然后冷却。
[0014]抗人IgM抗体及抗人IgG抗体分别包被于硝酸纤维素膜的检测区的检测线(Tl线和T2线)，抗IgG抗体包被于质控区的质控线(C线)，当样本中含有抗HEV IgM时，抗HEVIgM能与胶体金标记HEV抗原结合形成复合物，该复合物在层析过程中又与Tl线区的抗人IgM抗体结合形成紫红色沉淀条带，当样本中不含抗HEV IgM时,胶体金标记的HEV抗原无法与Tl线区的抗人IgM抗体结合。当样本中含有抗HEV IgG时，抗HEV IgG能与胶体金标记HEV抗原结合形成复合物，该复合物在层析过程中又与T2线区的抗人IgM抗体结合形成紫红色沉淀条带，否则不显色，无论样本中是否含有抗HEV IgM，C线区的抗IgG抗体都会与胶体金标记的HEV抗原结合形成一条紫红色对照C线。C线的显色是判定是否有足够样本，层析过程是否正常的标准，同时也作为该试剂的内控标准。
[0015]本发明的有益技术效果:
利用免疫层析法原理，采用胶体金标记技术，本申请人研制出HEV IgM及IgG抗体检测试纸，它采用高度特异性的抗原抗体反应、免疫层析技术及胶体金标记技术，可快速检测人血液样本中的HEV IgM及IgG抗体，适合于戊型肝炎的早期特异性诊断。HEV感染人体后，人的免疫系统会产生针对该病毒的特异性抗体，主要为IgM及IgG抗体，经研究发现这两种抗体的产生及存在有如下几个特点:(I)在非肝炎患者或健康人群中可以出现抗HEV IgG和IgM阳性，前者为既往HEV隐性感染，后者为新近隐性感染；(2)急性戊肝早期抗-HEV IgG和IgM均可阳性，抗-HEV IgG的活性和阳性率均高于IgM,而IgM的A值比IgG下降快，故抗-HEV IgM可作为急性戊肝的确诊依据。但若IgM阴性时，结合临床表现、肝功能检查等，抗HEV IgG阳性同样具有急性戊肝的确诊价值。本发明所提供的HEV IgM及IgG抗体检测试纸，可同时检测HEV IgM及IgG抗体，相比较单一检测HEV IgM抗体的产品临床阳性检出率更高，可避免因为HEV IgM阴性或滴度较低而造成漏检的情况发生，为戊型肝炎的确诊提供更好的依据。
【附图说明】
[0016]图1为本发明的结构示意图；
图2为本发明硝酸纤维膜的结构示意图；
图3为本发明的检测结果判断示意图。
[0017]附图标记:
1-样品垫；2_金标抗原结合垫；3_硝酸纤维素膜；4_吸水垫；5_底板。
【具体实施方式】
[0018]下面结合具体实施为例，进一步阐述本发明，应注意，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0019]实施例1
结合附图1、2:检测人HEV IgM及IgG的免疫层析试纸，所述试纸包括样品垫1、金标抗原结合垫2、硝酸纤维素膜3、吸水垫4和底板5 ;所述硝酸纤维素膜3在所述底板5的中部，在所述硝酸纤维素膜3沿底板的一端依次为金标抗原结合垫2、样品垫I，在所述硝酸纤维素膜3沿底板的另一端为吸水垫4，且每相邻两者之间部分叠合；所述硝酸纤维素膜3靠近吸水垫4 一端为质控区，另一端为检测区；硝酸纤维素膜3包含包被有抗人IgM抗体(设为Tl线)及包被有抗人IgG抗体(设为T2线)的检测区和包被有抗IgG抗体的质控区；硝酸纤维素膜3靠近吸水垫4 一端为质控区，另一端为检测区；所述检测区设有检测线(Tl、T2线)，所述质控区设有质控线(C线);金标抗原结合垫2上包被有胶体金标记的HEV抗原及胶体金标记的兔IgG抗体。
[0020]实施例2
与实施例1的不同之处在于，金标抗原结合垫2上包被有乳胶标记的HEV抗原及乳胶标记的兔IgG抗体。
[0021]实施例3
与实施例1的不同之处在于，金标抗原结合垫2上包被有胶体硒标记的HEV抗原及胶体硒标记的兔IgG抗体。
[0022]以下实施例4-5为检测人HEV IgM及IgG的免疫层析试纸的制备方法实施例4
a)准备样品垫、吸水