用于免疫检验的病毒样颗粒、用于所述免疫检验的封闭剂、及包含它们的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[000?] 本发明涉及用于免疫检验的病毒样颗粒(virus-like particle)、用于该免疫检 验的封闭剂(blocking agent)、及包含该病毒样颗粒和该封闭剂的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 使用各种颗粒作为免疫检验传感器（immunoassay sensors)的方法是已知的（专 利文献1~8)。例如，专利文献1或专利文献2中公开了利用荧光半导体纳米颗粒或二氧化硅 颗粒作为免疫检验中的检测元件的方法，该方法是利用纳米颗粒发射的荧光进行免疫检验 的方法。
[0003] 专利文献8中公开了一种纳米颗粒缀合物(nanoparticle conjugate)，所述纳米 颗粒缀合物包含作为核心的金属材料、磁性材料或半导体材料以及缀合至其上的各种肽。
[0004] 具有乙型肝炎病毒表面抗原、且在位于该抗原的N末端的Pre-si及Pre-S2区域以 串联的方式插入有2个源自蛋白质A的与抗体的Fc区域对应的结合结构域(Z标签)的病毒样 颗粒（下文中有时称为ZZ-BNC)，是在使用酵母经基因重组而制造的L型乙型肝炎病毒颗粒 的Pre-Si及Pre-S2区域插入有2个源自蛋白质A的与抗体的Fc区域对应的结合结构域(Z标 签)的病毒样颗粒(专利文献9)。专利文献10中公开了上述病毒样颗粒的制造方法及其作为 药物传递系统的有用性。
[0005] 着眼于该BNC-ZZ所具有的作为传感器元件的高性能，专利文献3的实施例中公开 了使用酶标记抗体和BNC-ZZ的组合的方法、利用经荧光标记的BNC-ZZ的抗体检测方法、在 免疫检验中利用BNC-ZZ的方法。专利文献6中公开了将BNC-ZZ用于经阵列固定的抗体来提 高灵敏度的方法。专利文献4中公开了将生物素化的BNC-ZZ应用于免疫检验的方法，其在实 施例中显示，与未经生物素化的BNC-ZZ相比，经由链亲和素而结合有生物素化HRP酶或生物 素化抗体的生物素化BNC-ZZ的灵敏度增高。
[0006] 专利文献5中公开了一种方法，用于制造并利用包含不具有Pre-s区域的蛋白质分 子和具有ZZ标签的蛋白质分子的杂合(hybrid)型颗粒，以通过提高BNC-ZZ颗粒所具有的抗 体结合能力来提高免疫检验的灵敏度。此外，专利文献7的实施例中公开了通过将抗体较弱 地交联于经荧光标记的BNC-ZZ上来同时检测多种抗原的方法。
[0007] 现有技术文献
[0008] 专利文献
[0009] 专利文献1:日本特表2006-517985号公报
[0010] 专利文献2:日本特表2002-544488号公报
[0011 ] 专利文献3:日本特开2007-127626号公报
[0012] 专利文献4:日本特开2008-191143号公报
[0013] 专利文献5:日本特开2010-096677号公报
[0014] 专利文献6:日本特开2007-121276号公报
[0015] 专利文献7:日本特开2010-210444号公报
[0016] 专利文献8:日本特表2007-506084号公报 [0017] 专利文献9:日本特开2001-316298号公报 [0018] 专利文献10:日本特开2004-002313号公报 [0019]非专利文献
[0020] 非专利文献 1: Vaccine 19,3154-3163,2001
【发明内容】
[0021] 在免疫分析中，为了提高灵敏度，通常采用以下方法中的任一种：（1)利用对检测 元件的检测对象物质具有高亲和性的检测元件；（2)增强与检测对象物质结合后的检测元 件所产生的信号强度。在将如上所述的BNC-ZZ用作检测元件时，其对检测对象物质的亲和 性恒定。因此，增强产生的信号强度是最有效的手段。
[0022]但是，在公开了利用BNC-ZZ的方案的专利文献4中，作为利用生物素化BNC-ZZ的方 法，仅仅公开了利用已为人们所熟知的生物素与链亲和素的特异性结合能力、使HRP结合量 升高从而增强信号的方法，并没有对BNC-ZZ进行研究。
[0023] ZZ-BNC具有源自蛋白质A的抗体结合部位，与免疫检验中的重要抗体(小鼠 IgGi、 大鼠 IgG、绵羊IgGi、山羊IgGi、人IgG3等）的结合弱，使用方法、使用范围受到很大限制。进 而，由于ZZ-BNC与各种IgG结合，所以在存在多种抗体的环境下，例如在抗体夹心ELISA (antibody-sandwich ELISA)中、或在对存在多种抗体的血清等的评价中，会发生与目标以 外的抗体的结合，因此，难以进行抗体特异性检测。
[0024] 此外，考虑到实用化时，由于BNC-ZZ、经标记的BNC-ZZ和经修饰的BNC-ZZ为脂蛋 白，因此会非特异地结合于玻璃、塑料。非特异性吸附不仅给免疫分析带来很大影响，而且 在经稀释溶液的长时间保存中也将造成严重的问题。
[0025] 为了解决上述课题，本申请的发明人进行了锐意研究，结果发现当利用生物学活 性分子、通过病毒样颗粒中包含的具有自组织能力（self-organization ability)的蛋白 质的特定部位对病毒样颗粒进行标记时，所得到的病毒样颗粒可合适地用于免疫检验。
[0026] 进而，本申请的发明人还发现在使用上述病毒样颗粒的免疫检验中，特定的封闭 剂可发挥优异的封闭效果。
[0027] 本发明是基于上述发现而完成的，包括下述广泛的技术方案。
[0028] 项1.免疫检验用病毒样颗粒，所述颗粒包含具有自组织能力的蛋白质，所述颗粒 在该具有自组织能力的蛋白质的至少1个半胱氨酸残基上经由其一个或多个巯基而被生物 学活性分子修饰。
[0029] 项2.如上述项1所述的病毒样颗粒，其中，所述具有自组织能力的蛋白质为HBsAg 蛋白质。
[0030] 项3.如上述项1的病毒样颗粒，所述具有自组织能力的蛋白质含有序列号1所示的 氨基酸序列。
[0031] 项4.如上述项1~项3中任一项所述的病毒样颗粒，其中，所述具有自组织能力的 蛋白质具有抗体结合结构域。
[0032]项5.如上述项1~项4中任一项所述的病毒样颗粒，其中，所述生物学活性分子为 选自由酶、抗体结合结构域、生物素、荧光染料、发光染料及亲和素化合物（avidin compound)组成的组中的至少1种。
[0033]项6.如上述项5所述的病毒样颗粒，其中，所述酶为碱性磷酸酶及/或过氧化物酶。
[0034] 项7.如上述项4或项5所述的病毒样颗粒，其中，所述抗体结合结构域为选自由蛋 白质A的抗体结合结构域、蛋白质G的抗体结合结构域及蛋白质L的抗体结合结构域组成的 组中的至少1种。
[0035] 项8.如上述项4或项5所述的病毒颗粒，其中，所述抗体结合结构域由序列号3~5 中任一个所示的氨基酸序列构成。
[0036] 项9.如上述项5所述的病毒样颗粒，其中，所述亲和素化合物为选自由亲和素、链 亲和素、中性亲和素蛋白（neutravidin)、AVR蛋白质、Bradavidin、Rhizavidin及 Ta mav i d i η ?组成的组中的至少1种。
[0037] 项10.上述项1~9中任一项所述的病毒样颗粒，其中，生物学活性分子为抗体结合 结构域，并且抗体结合于该抗体结合结构域。
[0038] 项11.封闭剂，其为使用上述项1~项10中任一项所述的病毒样颗粒的免疫检验用 封闭剂，该封闭剂包含选自由羟烷基纤维素、聚乙烯醇、环氧乙烷/环氧丙烷共聚物及2-甲 基丙稀酰氧基乙基磷酰胆碱（21161:1^(^71〇71(?5^1:117]^11〇8。11〇(311〇1;[116)的共聚物组成的 组中的至少1种。
[0039] 项12.如上述项11所述的封闭剂，其中，所述羟烷基纤维素为羟丙基甲基纤维素。
[0040] 项13.如上述项11所述的封闭剂，其中，所述聚乙烯醇的聚合度为200~5000。
[0041] 项14.如上述项11所述的封闭剂，其中，所述环氧乙烷/环氧丙烷共聚物为 Pluronic?。
[0042] 项15.如上述项11所述的封闭剂，其中，所述环氧乙烷/环氧丙烷共聚物为 _Plur o:nie?.F 12 7 和/或 P】u ro n i c? P1 〇 5。
[0043] 项16.如上述项11所述的封闭剂，其中，2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的共聚物 为.B.iolipidur.e?。
[0044]项17.如上述项11所述的封闭剂，其中，2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的共聚物 为 B i ο 丨 i p i du re? 2〇6 及/或 B i ο 1 i p i d u re? 8〇2。
[0045] 项18.免疫检验用试剂盒，包含上述项1~项10中任一项所述的病毒样颗粒和上述 项11~项17中任一项所述的封闭剂。
[0046] 本发明的病毒样颗粒能够以优异的检测灵敏度进行免疫检验。
[0047] 在使用本发明的病毒样颗粒进行的免疫检验中，本发明的封闭剂可发挥降低所得 数据的背景和/或使检测信号灵敏化的功能，由此显著提高S/N比。
[0048]根据使用本发明的试剂盒的免疫检验，能够显著提高所得到的数据的S/N比。
【附图说明】
[0049]图1是表示实施例5的结果的图。
[0050]图2是表示实施例6的结果的图。
[00511图3是表示实施例16的结果的图。
[0052]图4是表示实施例17的结果的图。
[0053]图5是表示实施例18的结果的图。
[0054]图6是表示实施例20的结果的图。
[0055]图7是表示实施例21的结果的图。
[0056]图8是表示实施例22的结果的图。
[0057]图9是表示实施例23的结果的图。
[0058]图10是表示实施例24的结果的图（抗GFP抗体）。
[0059]图11是表示实施例24的结果的图（HMG单克隆抗体）。
[0060]图12是表示实施例25的结果的图。
[0061]图13是表示实施例27的结果的图。
[0062]图14是表示实施例28的结果的图。
[0063]图15是表示实施例29的结果的图。
[0064]图16是表示实施例30的结果的图。
[0065]图17是表示实施例31的结果的图。
[0066]图18是表示实施例32的结果的图。
[0067]图19是表示实施例33的结果的图。
[0068]图20是表示实施例34的结果的图。
[0069]图21是表示实施例35的结果的图。
[0070]图22是表示实施例36的结果的图。
【具体实施方式】
[0071] <病毒样颗粒>
[0072] 本发明的病毒样颗粒用于免疫检验方法，并且包含具有自组织能力的蛋白质。具 有自组织能力的蛋白质在该蛋白质的至少一个半胱氨酸残基上经由其一个或多个巯基而 被生物学活性分子修饰。
[0073] 所谓具有自组织能力的蛋白质，是能够在生物体内（特别是细胞内）通过包入 (enclosing)脂双层膜（例如内质网腔（endoplasmic reticulum lumen)、细胞膜、核膜等） 而形成病毒样颗粒的蛋白质，该蛋白质没有特别限定，只要具有半胱氨酸残基即可，例如可 举出与具有包膜（envelope )的病毒的出芽（budding)功能有关的蛋白质、包膜蛋白 (envelope protein)、或它们的变异体等。
[0074]具有包膜的病毒没有特别限定，例如可举出乙型肝炎病毒(HBV)、鸭乙型肝炎病毒 等属于嗜肝DNA病毒(Hepadnaviridae)科的病毒；仙台病毒(HVJ)等属于副粘病毒科的病 毒;单纯疱疹病毒等属于疱疹病毒科的病毒;流感病毒等属于正粘病毒科的病毒;人免疫缺 陷病毒等属于反转录病毒(Retroviridae)科的病毒等。
[0075]具有自组织能力的蛋白质没有特别限定，例如可举出乙型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg)蛋白质（其是与HVB的出芽功能有关的蛋白质）、蛋白质F(其是与HVJ的出芽功能有 关的蛋白质）、血凝素神经氨酸酶蛋白质（hemagglutinin neuraminidase protein)、或它 们的变异体。其中，HBsAg蛋白质、蛋白质F、血凝素神经氨酸酶蛋白质、它们的变异体等是优 选的。
[0076]变异体没有特别限定，只要具有至少一个的半胱氨酸残基、并且发挥如上所述的 能够形成病毒样颗粒的作用即可。引入的突变的具体数量也没有特别限定，只要所得到的 变异体满足上述条件即可。通常，突变引入数可为使得得到的变异体与突变前的氨基酸序 列具有85%以上、优选90%以上、更优选95%以上、最优选99%以上的同一性的数量。
[0077]需要说明的是，此处所谓的突变，包括取代、缺失、插入等。作为具体的突变引入方 法，可以不受特别限制地采用已知的方法，例如要进行取代时，可采用保守取代 (conservative substitution)技术。术语"保守取代技术"是指，氨基酸残基被具有相似侧 链的氨基酸残基所取代。
[0078] 保守取代技术包括例如具有赖氨酸、精氨酸、组氨酸等碱性侧链的氨基酸残基彼 此之间的取代。作为保守取代技术的其他例子，包括:具有酸性侧链的氨基酸残基(例如天 冬氨酸和谷氨酸)彼此之间的取代;具有非带电性极性侧链的氨基酸残基(例如甘氨酸、天 冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)彼此之间的取代;具有非极性侧链的 氨基酸残基(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸） 彼此之间的取代;具有分枝侧链的氨基酸残基(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)彼此之间 的取代;具有芳香族侧链的氨基酸残基(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)彼此之间 的取代。
[0079] 术语"同一性"是指，2条以上可进行比较的氨基酸序列之间相同的氨基酸序列的 程度。因此，2条氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性高，这些序列的同一性或相似性就 高。对于氨基酸序列之间的同一性的水平，例如，使用序列分析工具FASTA，基于缺省参数 (default parameters)进行确定。这些分析方法的具体技术是已知的，可参照美国国家生 物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI)的网站 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
[0080] 作为HBsAg，没有特别限定，例如可举出含有序列号1所示的氨基酸序列的蛋白质 等，作为该HBsAg的变异体，例如可举出专利文献5、9中公开的HBsAg变异体等。作为蛋白质 F，没有特别限定，例如可举出由NCBI的网站上登记的登记号为NP_056877;版本：NP_ 056877.1GI :9627226所示的氨基酸序列构成的蛋白质等。作为血凝素神经氨酸酶蛋白质， 没有特别限定，例如可举出由NCBI的网站上登记的登记号为NP_056878;版本：NP_ 056878.1GI :9627227所示的氨基酸序列构成的蛋白质等。
[0081] 具有自组织能力的蛋白质具有半胱氨酸残基，通过半胱氨酸残基上的一个或多个 巯基而被生物学活性分子修饰。半胱氨酸残基没有特别限定，但优选为位于基于具有自组 织能力的蛋白质形成的病毒样颗粒的表面、且