一种鉴定白菜A09染色体上的抗病毒病QTL—BrTuA09的分子标记及其应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于生物技术领域，具体设及一种鉴定白菜A09染色体上的抗病毒病QTL-B巧UA09的分子标记及其应用，可用于病毒病TUMV-C4小种的抗性鉴定。
【背景技术】
[0002] 大白菜(Brassica rapa L.ssp.Pekinensis)是我国重要的经济作物之一，病毒病 严重威胁大白菜的产量和质量，平均每年可造成5 %~10 %的产量损失，流行年份发病率可 达80%，甚至绝收。目前尚无有效药剂及控制技术，培育抗病品种成为最有效的防治措施。 随着分子生物学和生物信息学的不断发展，发掘与分离不同来源的抗性主效QTL，并通过分 子设计育种进行高效聚合，选育稳定、持久抗病品种，成为保证大白菜安全无污染生产的有 效途径之一。
[0003] 病毒病对多种芸臺属作物危害严重，挖掘与抗性基因或QTL连锁的分子标记在加 速分子标记辅助育种方面极为重要。在国外RusholmeWDH群体为材料定位到两个QTL，位于 A6连锁群的TuRBCnb和位于R4连锁群的重6付01;化扣^^(2011)将化*1定位在46连锁群上； 近期Jin(2014)在A6连锁群上定位了一个抗TUMV-C4的QTk^RB07,并获得候选基因。国内 屈淑平（2008)在大白菜上检测到4个抗TUMV-C3的QTL位点；韩和平（2004)发现了一个与 TuMV-巧抗性相关的显性标记；张俊华等（2008)报道了4个抗TUMV-C3的9化；张晓伟等 (2009)发现3个抗TUMV-C4的QTL位点;Zhang( 2008)通过研究，在一张包含376个分子标记的 遗传图谱上，发现了 4个与大白菜抗TUMV-C4相关的QTL。
[0004] 研究表明分子标记在目标资源筛选，定位调控特定农艺性状的基因、基因聚合和 品种鉴定等方面的应用越来越广泛。SNP属于新一代分子标记，具有丰度高、检测易实现自 动化等特点。基于KASP(竞争性等位基因特异性PCR)的SNPline基因分型检测是英国LGC (Xaboratory of the Government Qiemist)有限公司开发的高通量SNP分型技术，其具有 准确、灵活、低成本、高通量的特点。该方案的核屯、是KASP技术，即Competitive Allele-Specific PCR。运项技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型W及检测InDels (Insedions and Deletions,插入和缺失），目前已经成为国际上SNP分析的主流方法之 〇
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个目的是提供了一种鉴定或辅助鉴定待测白菜品种对病毒病TuMV-C4小种抗性的方法。
[0006] 本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测白菜品种对病毒病TUMV-C4小种抗性的方法是 检测待测白菜的基因型是CC基因型还是TT基因型还是TC基因型，根据所述白菜的基因型确 定所述白菜品种对病毒病TUMV-C4小种的抗性:TT基因型的白菜品种对病毒病TUMV-C4小种 的抗性为感病，TC基因型的白菜品种和CC基因型的白菜品种对病毒病化MV-C4小种的抗性 为抗病；
[0007] 所述CC基因型为白菜A09染色体上第9805885位的核巧酸为C的纯合体；
[000引所述TT基因型为白菜A09染色体上第9805885位的核巧酸为T的纯合体；
[0009] 所述TC基因型为白菜A09染色体上第9805885位的核巧酸为C和T的杂合体。
[0010] 上述方法中，所述检测待测白菜的基因型是CC基因型还是TC基因型的方法为如下 A)或 B):
[00川 A)直接测序白菜的基因组DNA;
[0012] B)测序含有白菜A09染色体上第9805885位脱氧核糖核巧酸的PCR扩增产物；
[0013]所述PCR扩增产物所用的引物为如下1)或2):
[0014] 1)由序列表中序列2所示的单链DNA分子、序列表中序列3所示的单链DNA分子和序 列表中序列4所示的单链DNA分子组成的成套引物A;
[001引別由序列A所示的单链DNA分子、序列B所示的单链DNA分子和序列C所示的单链DNA 分子组成的成套引物B;
[0016] 所述序列A为将序列2删除或增加或改变一个或几个核巧酸，且与序列2具有相同 功能的核巧酸；
[0017] 所述序列B为将序列3删除或增加或改变一个或几个核巧酸，且与序列3具有相同 功能的核巧酸；
[0018] 所述序列C为将序列4删除或增加或改变一个或几个核巧酸，且与序列4具有相同 功能的核巧酸。
[0019] 上述方法中，病情指数在0-33.33范围内的白菜品种对病毒病TUMV-C4小种的抗性 为抗病;病情指数在33.34-100范围内的白菜品种对病毒病TUMV-C4小种的抗性为感病。
[0020] 本发明的第二个目的是提供检测白菜A09染色体上第9805885位的脱氧核糖核巧 酸的物质的新用途。
[0021] 本发明提供了检测白菜A09染色体上第9805885位的脱氧核糖核巧酸的物质在鉴 定或辅助鉴定待测白菜品种对病毒病TUMV-C4小种抗性中的应用。
[0022] 本发明还提供了检测白菜A09染色体上第9805885位的脱氧核糖核巧酸的物质在 制备鉴定或辅助鉴定待测白菜品种对病毒病TUMV-C4小种抗性的产品中的应用。
[0023] 本发明还提供了检测白菜A09染色体上第9805885位的脱氧核糖核巧酸的物质在 白菜育种中的应用。
[0024] 本发明还提供了检测白菜A09染色体上第9805885位的脱氧核糖核巧酸的物质在 制备白菜育种的产品中的应用。
[0025] 本发明还提供了检测白菜A09染色体上第9805885位的脱氧核糖核巧酸的物质在 选育抗病毒病TUMV-C4小种的白菜中的应用。
[0026] 本发明还提供了检测白菜A09染色体上第9805885位的脱氧核糖核巧酸的物质在 制备选育抗病毒病TUMV-C4小种的白菜的产品中的应用。
[0027] 本发明的第Ξ个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测白菜品种对病毒病TUMV-C4 小种抗性的产品。
[0028] 本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测白菜品种对病毒病TUMV-C4小种抗性的产品为 检测白菜A09染色体上第9805885位的脱氧核糖核巧酸的物质。
[00巧]上述应用或上述产品中，
[0030] 所述检测白菜A09染色体上第9805885位的脱氧核糖核巧酸的物质为如下1)或2) 或3)或4):
[0031] 1)由序列表中序列2所示的单链DNA分子、序列表中序列3所示的单链DNA分子和序 列表中序列4所示的单链DNA分子组成的成套引物A;
[0032] 2化序列A所示的单链DNA分子、序列B所示的单链DNA分子和序列C所示的单链DNA 分子组成的成套引物B;
[0033] 所述序列A为将序列2删除或增加或改变一个或几个核巧酸，且与序列2具有相同 功能的核巧酸；
[0034] 所述序列B为将序列3删除或增加或改变一个或几个核巧酸，且与序列3具有相同 功能的核巧酸；
[0035] 所述序列C为将序列4删除或增加或改变一个或几个核巧酸，且与序列4具有相同 功能的核巧酸；
[0036] 3)含有1)所述的成套引物A或2)所述的成套引物B的PCR试剂；
[0037] 4)含有1)所述的成套引物A或2)所述的成套引物B或3)所述的PCR试剂的试剂盒。
[0038] 本发明的第四个目的是提供一种选育抗病毒病TUMV-C4小种的白菜品种的方法。
[0039] 本发明提供的选育抗病毒病TUMV-C4小种的白菜品种的方法包括选择TC基因型的 白菜品种或CC基因型的白菜品种进行育种；
[0040] 所述TT基因型为白菜A09染色体上第9805885位的核巧酸为T的纯合体；
[0041] 所述TC基因型为白菜A09染色体上第9805885位的核巧酸为C和T的杂合体。
[0042] 上述方法或上述应用或上述产品中，所述白菜为带有抗病毒病QTL-化TuA09的白 菜;所述带有抗病毒病QTL-B巧UA09的白菜为带有抗病毒病QTL-B巧UA09的大白菜。
[0043] 本发明根据双亲基因组重测序信息，于目标QTl-^TuA09所在区间进一步开发出1 个与病毒病抗性紧密连锁的SNP标记，该分子标记可用于对白菜品种的病毒病TUMV-C4小种 的抗性鉴定。通过92个单株组成的BC1群体的验证显示：该标记的选择准确率均在93% W 上，可用于分子标记辅助育种，并为进一步定位和克隆基因奠定了良好的基础。
【附图说明】
[0044] 图1为化-A099805885 T/C对92个单株组成的BC1群体验证分型效果如图1所示。
【具体实施方式】
[0045] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0046] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0047] 下述实施例中的0.05M(PH = 7.0 )憐酸缓冲液配制方法：分别量取61 . OmL的 0.2mol/L Na抽P〇4母液和39. O