一种检测单碱基突变的方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，特别是设及一种检测单碱基突变的方法及应用。
【背景技术】
[0002] 单核巧酸变异（点突变)是指在DNA特定位置发生一个核巧酸的改变，广泛存在于 生物体遗传信息的编码中，当较少出现的等位基因频率大于或等于1%时，则称为单核巧酸 多态性(single nucleotide polymo巧hism，SNP)。对点突变的研究有助于深入认识高等生 物的遗传特性，解释个体的表型差异，掲示基因、信息、蛋白质的正常功能，变异的成因 W及 不同个体对环境变化的响应机制，对功能基因组学研究和建立分子标记都具有重要意义。
[0003] 随着基因组测序工作的开展，点突变的检测和筛选正成为人们关注的焦点，检测 方法也随之迅速发展;此外，当点突变所造成的基因理化特性改变比较微弱时，则使得点突 变的检测非常困难，运也使得人们从多方面探索和建立新的检测方法。
[0004] PCR-RFLP是最早用于分析已知点突变的方法。如果点突变正好发生在某种限制性 内切酶识别位点上，使酶切位点增加或者消失，利用PCR特异扩增的运段DNA经某一限制酶 消化后，再通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，即可确定是否存在点突变。运种检测具有较 高的特异性，重复性好，但仅适于设及到特定限制性内切酶识别位点的突变检测和突变频 率大于1 %的多态性检测，不能提供究竟是何种碱基的突变。
[0005] 依赖于DNA变性动力学的PCR技术和高分辨烙解曲线分析技术化igh-resolution melting analysis,HRM)也能用于SNP的检测。扩增片段内若存在点突变，则通过Tm值的差 异或变性过程中双链DNA饱和染料释放巧光信号强度的差异，可将存在错配碱基的双链DNA 与纯合的双链DNA相区分开来。它们可W用于SNP的快速检测，但只适合于对小片段的分析， 且不能确定具体的突变碱基与部位。
[0006] 单链DNA由于碱基序列的不同可W引起其构象差异，运种差异将造成相同或者相 近长度的单链DNA电泳迁移率的差别，即单链构象多态性（signle S化and conformation polymor地ism,SSCP)。因此，目标基因通过PCR扩增、变性及电泳后，突变所引起的DNA构象 差异则表现为电泳条带位置的差异而用于SNP的分析中。但是，单个碱基突变的检出率会随 着DNA片段的长度的增加而降低，同时，SSCP不能够确定所分析DNA片段中突变的类型及位 置并且耗时长。
[0007] 当DNA在一定梯度变性剂浓度的凝胶中电泳，即变性梯度凝胶中电泳(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)时，具有碱基差异的DNA片段会在不同的地方开始 解链，从而达到分离的目的。虽然DGGE检测的片段长度可W达到化b，但是它耗时较长、使用 条件较难优化并且不能确定所分析DNA片段中突变的类型和位置。
[000引 变性高效液相色谱（denaturing Μ曲 performance liquid chromatography， DHPLC)是一项在SSCP和DGGE基础上发展起来的一种检巧USNP的突变技术。带正电荷的流动 相可W吸附带负电的DNA分子，同时，因为同源双链与异源双链具有不同的退火溫度，因此 通过控制DHPLC的溫度，使系统维持在异源双链解链时的溫度时，即可W将其分离，SNP的有 无最终表现在色谱峰的峰形和数目上。虽然D册LC在寻找未知的SNP上有明显的优势，但是 对已知SNP不可能实现100%的检出，同时对每个DNA片段的分析则都需要优化相应的运行 溫度，不能确定突变的碱基。
[0009] 使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-T0F MS)技术也可W用于检测 SNP，但是它需要将目的片段转化为DNA/RNA镶嵌结构，并且在分析之前还需要用四种核酸 酶进行预处理，同时在费用上也不具有竞争优势。基因忍片技术将大量探针分子固定在支 持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样 品分子的数量和序列信息，可用于大规模检测基因突变、基因多态、基因表达水平W及测定 DNA序列，具有检测信息高通量和自动化程度高等特点，但费用较高，且容易漏检SNP。
[0010] 相对而言，酶学突变检测是一种较为简便、有效的点突变检测技术，它的建立依赖 于特异性核酸酶的发现和利用，如S1核酸酶、核糖核酸酶、T4内切核酸酶、MutY、绿豆核酸 酶、芹菜核酸酶CEL I等都已用于点突变的检测，能够确定突变的位置，但也不能确定具体 突变的碱基。通过DNA测序技术可直接获取目的片段的碱基序列，通过序列间的比较，可W 直观而有效的寻找SNP，是一种最为有效而且可靠的SNP检测方法，且可确定SNP的位置及突 变的碱基。虽然随着测序的自动化程度的提高及测序成本的降低，直接测序越来越多的应 用于SNP检测中，但需要重复测序和确认才能将杂合体从序列误差中区别出来，而且测序的 费用仍然很高、费时。
[0011] 由上所述可见，随着新技术、新材料和设备的不断涌现，点突变检测技术得到了迅 速的发展，但大多数不能确定具体的突变碱基，而能够确定突变碱基的方法(如测序法)贝。 需要专口的分析仪器，不仅价格昂贵，而且操作复杂、专业性强，在应用上受到了一定的限 审IJ。因此，开发简便和快速确定具体的突变碱基的新检测方法十分必要。
【发明内容】
[0012] 本发明提供了一种检测单碱基突变的方法及应用，该方法不但可W检测是否存在 单碱基突变及突变所在的位置，而且无需测序即可快速确定是哪种突变碱基。
[0013] -种检测单碱基突变的方法，包括W下步骤：
[0014] (1)针对待测样本与参照的目标区段设计引物对，PCR分别扩增；
[0015] (2)将两组扩增产物形成的异质双链产物用CEL I酶切，酶切产物经电泳检测确定 单碱基突变；
[0016] (3)回收CEL I酶所切开的两个片段，每个片段分别与带有A、T、G或C粘性末端的4 种人工接头连接；
[0017] (4)把基于人工接头序列设计的反向引物与扩增目标基因或DNA片段的上游引物 W及基于人工接头序列设计的正向引物与扩增目标基因或DNA片段的下游引物组成两对引 物，分别W每个连接产物为模板进行PCR扩增；
[0018] (5)对有所PCR产物进行电泳检测，所得结果与单碱基错配类型的对应关系如下：
[0019]
[0020] 其中表示有扩增。
[0021] 步骤(2)中确定单碱基突变样本的方法为:(EL I酶切产物的电泳结果，如果只有 一条目的基因条带，说明待测样本中不存在单碱基突变；除目的基因条带外还有2条新条 带，并且两者的长度之和与目的基因大小一致，说明存在单碱基突变。
[0022] 所述的异质双链产物片段是指一条链碱基正常而另一条含有单个突变碱基链。
[0023] 所述异质双链产物的制备方法为:将等质量的参照和待测样本扩增产物混合，再 进行高溫变性和降溫复性。
[0024] 所述异质双链产物的制备方法也可W为:在PCR扩增时用参照与待测样品等质量 混合的DNA作为模板，再将扩增产物进行高溫变性和降溫复性。
[0025] 所述高溫变性条件为:94°C变性5min;所述降溫复性条件为:先按2°C/s降溫至85 DC，再 W〇.rc/s降溫至 25°C。
[0026] 芹菜核酸酶CEL I是一种单链特异性核酸酶，能从3'端切割异源双链DM分子中错 配的单核巧酸碱基对。当参照与待测样本在检测区段内具有单碱基突变时，形成的异质双 链产物中将含有错配碱基，CEL I能特异性识别和切割错配碱基。当电泳图谱中只有一条目 的基因扩增条带时，表明待测样本中不存在单碱基突变或变异；当电泳结果显示除了目的 基因扩增条带外还出现2条新条带时，说明具有单碱基突变或变异，且运2个片段的长度之 和与目标扩增片段大小一致。
[0027] 证明了待测样本具有单碱基突变后，对存在突变的样本再进行后续的检测，用于 测定具体的突变类型。
[0028] 所述的连接产物的扩增是指利对异质双链产物的CEL I消化产物与4种不同DNA接 头连接后的PCR扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测。所用的引物是特异性的，其中之一 就是用来扩增目标片段的上游或下游引物，另一条则是基于人工接头序列设计的正反向引 物AF或AR，AF和AR序列在4个接头中是相同的，AF用于突变点下游的扩增，AR用于突变点上 游的扩增。
[0029] 利用T4连接酶将CEL I酶切割产物分别与带有A、T、G或C粘性末端的4种不同DNA接 头连接。
[0030] 所述带有A、T、G或C粘性末端的4种人工接头分别为：
[0031] 接头 A:
[0032] 5 '-ACCTCGCTCAGCATCCTCCAC 图-3 '
[0033] 3 '-TGGAGCGAGTCGTAGGAGGTG-5 '；
[0034] 接头 T:
[0035] 5 '-ACCTCGCTCAGCATCCTCCAC 固-3 '
[0036] 3 '-TGGAGCGAGTCGTAGGAGGTG-5 '；
[0037] 接头 G:
[00；3 引 5 ' -ACCTCGCTCAGCATCCTCCAC 图-3 '
[0039] 3 '-TGGAGCGAGTCGTAGGAGGTG-5 '；
[0040] 接头 C:
[0041 ] 5 ' -ACCTCGCTCAGCATCCTCCAc|-3 '
[0042] 3，-TGGAGCGAGTCGTAGGAGGTG-5，。
[0043] 所述基于人工接头序列设计的正反向引物为：
[0044] AF:5 '-ACCTCGCTCAGCATCCTCCAC-3 '
[0045] AR:3 '-TGGAGCGAGTCGTAGGAGGTG-5 '。
[0046] 所述的突变碱基类型的确定是根据不同接头连接后扩增产物的有无和扩增产物 的大小来判断的。若待测样本在目标区段内具有单碱基突变，则异质双链产物中含有8种可 能的错配形式，I消化的产物只能与特定的接头连接。若有扩增产物，而且扩增产物大 小是切割片段长度与接头长度的之和，则突变的碱基必定是与相应接头粘性末端碱基互补 的碱基。
[0047] 基于所述的检测单碱基