专利名称：基于量子点共振能量转移检测hbv dna及单碱基突变的方法
技术领域：
本发明属靶DNA或单碱基突变的检测领域，特别是涉及一种基于量子点共振能量 转移检测HBV DNA及单碱基突变的方法。
背景技术：
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(h印atitis B virus, HBV)引起的疾病，乙肝病毒的 感染是一个全球性的健康问题。全世界将近有3. 5亿HBV慢性携带者，我国有1. 2亿HBV病 毒携带者，并呈上升趋势。HBV的感染可以引起多种疾病，比如慢性肝炎，肝硬化和原发性 肝癌。在HBV的治疗方面，通过抗HBV药物来抑制病毒复制是目前治疗慢性乙型肝炎(CHB) 最重要和有效的方法。诸如拉米呋啶和阿德福韦等药物已广泛用于抗HBV的治疗。但药 物长期应用后，病毒产生基因突变，进而引发的变异和耐药性问题已成为临床中的棘手问 题。因此，定量检测HBV DNA及碱基突变在HBV基础研究和临床实践中具有重要意义。目前 最常见的检测HBV感染及单碱基突变的方法包括凝胶电泳聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)、分支 DNA 信号扩增法(branched DNA signal ampli-f ication assay)、等位特异的 DNA 杂交方法(allele-specif ic DNA hybridization)、连接或 引物延伸法(ligation or primer extension)、基于分子信标的荧光共振能量转移 (molecular-beacon-based fluorescence resonance energy transfer),电化学检 贝Ij (electroche mical detect-ing)等。但这些方法普遍存在一些缺陷，或者操作过程复杂， 或者灵敏度不高，或者比较费时，缺乏多靶标高通量检测的能力。因此建立简单、特异、快速 和高通量的靶DNA及单碱基突变检测的方法是解决临床应用的关键问题。量子点(quantum dots，QDs)，是一种新型的荧光探针。自从第一批报道使用修饰 的CdSe/ZnS核/壳结构QDs作为荧光标记物标定生物样品以来，QDs近年来已在众多的生 物分析和生理过程研究中引起广泛的关注和应用。QDs具有许多独特的光物理性质，如宽 广的吸收光谱和狭窄的发射光谱，这使得它们可以作为良好的能量供体应用于基于荧光共 振會邑量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)的传感器中。这是因为这 些荧光特性允许我们能够在QDs宽广的吸收光谱中选择某个激发波长进行激发，从而避免 对染料受体(如Cy5)的直接激发；并可以选择适当的滤光片对供体和受体发射的荧光进 行有效的分离。迄今为止，研究者们已构建了多种以FRET为基础的QDs纳米传感器。这些 传感器已被成功用于多种分析物的检测，包括营养物质、爆炸物、蛋白质、酶以及PH值的变 化等。与此同时，也有研究集中在基于FRET的QDs-DNA纳米传感器应用于寡核苷酸(DNA) 的识别，通过寡核苷酸杂交后引起的FRET荧光发射信号的变化从而达到对寡核苷酸(DNA) 的识别和检测。但是许多QDs-DNA传感器的制备过程复杂，代价高，而且制备得到的探针不 能够长期保存。绝大多数情况下，构建的QDs-DNA FRET传感器是在常规的荧光仪上实现对 靶DNA的检测的，但是利用普通荧光仪进行检测的方法通常都比较繁琐和费时。也有一些 研究者通过将QDs植入到纳米管上或者结合单分子荧光检测技术，可以获得检测灵敏度很高的DNA传感器，然而这些方法中传感器制备过程的复杂性，以及需要精贵复杂的仪器，都 使得这些方法的应用受到了限制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于量子点荧光共振能量转移检测HBV DNA及单碱基突变的方法，以解决现有技术中的缺陷。本发明的一种基于量子点共振能量转移检测HBV DNA及单碱基突变的方法，包 括(一 )检测探针的制备及HBV DNA临床样本的制备(1)巯基丙酸包裹的CdSe/ZnS核/壳结构量子点的制备取0. 5mL荧光发射峰为575 615nm的三辛基氧化磷(TOPO)包裹的CdSe/ZnS核 /壳结构QDs的甲苯溶液，加入2 4mL氯仿，再逐滴加入2 4mL巯基丙酸(MPA)溶液，室 温搅拌30 60分钟，加入5 SmL水，反复震荡，分去有机层，在水层中加入丙酮，离心沉 淀后，将得到的QDs溶于Milli-Q超纯水中，制备得到MPA包裹的水溶性CdSe/ZnSQDs ；(2) HBV DNA检测探针的设计及合成HBV多聚酶位点rtM204I/V(YMDD)的变异与血清中HBV DNA的反弹及转氨酶水平 有关。当M变为V或I时可导致氨基酸侧链的柔性减低，并在HBV聚合酶和拉米呋啶三磷酸 盐之间形成空间位阻，使其与拉米呋啶三磷酸的结合力下降，导致病毒对拉米呋啶的耐药。 本发明根据YMDD (rtM204M)及变异型YVDD (rtM204V)的DNA序列设计检测探针，其中每个 位点设计两个相连接的探针，两个探针的长度都是15个碱基，单碱基多态位点设计在第一 个探针的3’端，并在5’端修饰Cy5(为信号探针)，另一个探针将用作QDs-DNA交联探针， 探针的3’未端经过氨基功能化修饰，以便与修饰了羧基的量子点结合，所有用到的DNA序 列见表1，探针的合成由大连宝生物(TAKARA)有限公司完成；表1. HBVDNA靶序列及探针
权利要求
1. 一种基于量子点共振能量转移检测HBV DNA及单碱基突变的方法，包括(一)检测探针的制备及HBVDNA临床样本的制备(1)巯基丙酸包裹的CdSe/ZnS核/壳结构量子点的制备取0. 5mL荧光发射峰为575 615nm的三辛基氧化磷TOPO包裹的CdSe/ZnS核/壳结 构QDs的甲苯溶液，加入2 4mL氯仿，再逐滴加入2 4mL巯基丙酸MPA溶液，室温搅拌 30 60分钟，加入5 SmL水，反复震荡，分去有机层，在水层中加入丙酮，离心沉淀后，将 得到的QDs溶于Milli-Q超纯水中，制备得到MPA包裹的水溶性CdSe/ZnS QDs ；(2)HBV DNA扩增引物及检测探针的设计合成 PCR扩增引物PCR 上游引物5’ -ACGACCGACCTTGAGGCATACTTC-3’ ； PCR 下游引物5，-CAGAGCAGAGGCGGTGTCG-3，； 检测探针-NH2 修饰的单链 DNA 探针5，-TGG ATG ATG TGG TAT (T)10(CH2)3- (NH2) -3'； -Cy5 标记的信号 DNA 探针-1 :5，_Cy5_TGG CTT TCA GTT ATA-3，； -Cy5 标记的信号 DNA 探针-2 :5，_Cy5_TGG CTT TCA GTT ATG-3，；(3)QDs-DNA探针交联物的制备将0. 5g/L的1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亚胺EDC、0. 5g/L的N-羟基琥珀 酰亚胺NHS和0. 05 μ M的MPA包裹的QDs按体积比为1 2 1 2 2 6的比例混合， 活化0. 5 2小时，然后加入上述-NH2功能化修饰过的单链DNA探针，于37°C孵化0. 5 2小时，制备得到QDs-DNA探针交联物；(4)HBV DNA临床样本的制备采用裂解法抽提阳性血清样品中HBV基因组DNA，然后对HBV DNA进行PCR扩增，制得 HBV DNA临床待测样本；(二)使用酶标仪对互补靶HBVDNA及单碱基突变的检测(1)互补靶HBVDNA及单碱基突变的检测将10 μ L的HBV DNA的PCR待测样本加入到115 μ L(20mM)的Taq联接缓冲液中，在 PCR仪上经95°C变性5分钟，使其解为单链；随后将该混合液放入到冰箱中，于冰水中冰浴 5分钟；然后向该混合液中加入70 μ L上述(一)/ (3)中的QDs-DNA探针、10 μ L的Cy5标 记的信号探针-1 (10 μ Μ)、5 μ L(1个单位)的Taq DNA联接酶；将该混合液共210 μ L于42°C下反应15 30分钟，在联接反应完成后，将该反应混合 液于Eppendorf PCR仪上在85°C下加热变性5分钟，使双链解离变为单链；变性后，立即将 反应混合液置于冰水中冰浴5分钟；冰浴后将反应混合液迅速转移至96孔板酶标仪中，在Wallac 1420型酶标仪上采用 485nm光激发，检测杂交反应液670nm处的荧光发射强度，从而实现对完全互补的或单碱基 突变的HBV DNA临床样本的检测；(2)互补靶HBVDNA及单碱基突变检测的结果判断①基于QDs-Cy5荧光共振能量转移的HBV DNA野生型的定量检测 将上述(二)/(1)中670nm处荧光发射强度的检测结果与不加PCR待测样本的空白试 样的检测结果进行对比，若上述(1)中670nm处的荧光发射强度比空白试样有明显增强，则判断该样本中的HBV DNA未发生突变，即为野生型，这时可将该样本于670nm处的荧光发射 强度与标准曲线进行对比，可以确定样本中HBV DNA的浓度，从而实现了对野生型HBV DNA 的定量检测；②基于QDs-Cy5荧光共振能量转移的HBVDNA单碱基突变的检测将上述(1)中670nm处荧光发射强度的检测结果与不加PCR待测样本的空白试样的 检测结果进行对比，若样本的荧光强度与空白噪声的荧光强度相当，则判断该样本中的HBV DNA发生了单碱基突变；③HBV单碱基突变样本的突变类型的判断替换步骤(二)/(1)中的待测样本为上述②中的HBV DNA的单碱基突变样本，并将该 步骤中的Cy5标记的信号探针-1替换为Cy5标记的信号探针_2，其他方法相同进行检测；将突变样本于670nm处荧光发射强度的检测结果与不加PCR待测样本的空白试样的检 测结果进行对比，若样本的荧光强度比空白试样有明显增强，则判断该样本中的HBVDNA发生了 YVDD突变，反之则为其他突变。
2.根据权利要求1所述的一种基于量子点共振能量转移检测HBVDNA及单碱基突变 的方法，其特征在于所述步骤(一)/(1)中的巯基丙酸溶液为巯基丙酸的甲醇溶液，浓度 30mmol/L，用四甲基氢氧化铵调pH值为9 11。
3.根据权利要求1所述的一种基于量子点共振能量转移检测HBVDNA及单碱基突变的 方法，其特征在于所述步骤(一)/ (3)中的-NH2功能化修饰过的单链DNA探针与MPA-QDs 的摩尔比为10 500 1。
4.根据权利要求1所述的一种基于量子点共振能量转移检测HBVDNA及单碱基突变的 方法，其特征在于所述步骤(一)/⑷中的PCR扩增体系为10X缓冲液1.5 μ 1，Taq酶 (1 个单位)，25mmol/L MgCl2O. 8 μ l、25mmol/L dNTP 1 μ 1，上下游引物各0. 5 μ 1，引物终浓 度为0. 5pmol/L ；扩增条件94°C变性4分钟；94°C 30秒，54°C 30秒，72°C 30秒，35个循环， 72 °C延伸4分钟。
5.根据权利要求1所述的一种基于量子点共振能量转移检测HBVDNA及单碱基突变的 方法，其特征在于所述步骤(二)/(1)中的QDs-DNA探针与Cy5标记的信号探针的摩尔比 为 1 1。
全文摘要
本发明涉及一种基于量子点共振能量转移检测HBV DNA及单碱基突变的方法，包括巯基丙酸MPA包裹的CdSe/ZnS核/壳结构量子点的制备；HBV DNA检测探针的设计及合成；QDs-DNA探针交联物的制备；HBV DNA临床样本的制备；使用酶标仪对互补的及单碱基突变的HBV靶DNA的高通量检测。该方法操作简单，不需要对杂交体系中未联接的DNA进行分离纯化；由于Cy5在所选的激发光(485nm)下不会直接产生荧光信号，因此背景干扰小，信号强；该方法还具有特异、快速、高分辨率、高灵敏度和高通量的特点，可应用于临床医学中HBV DNA及单碱基突变的高通量和多靶标的检测。
文档编号G01N21/64GK101993956SQ20101000304
公开日2011年3月30日 申请日期2010年1月3日 优先权日2010年1月3日
发明者毛红菊, 王祥, 赵建龙, 金庆辉, 钟新华 申请人:中国科学院上海微系统与信息技术研究所;华东理工大学