使用细胞内生物发光共振能量转移识别生物活性剂的细胞靶标结合的制作方法
【专利说明】使用细胞内生物发光共振能量转移识别生物活性剂的细胞 朝标结合
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年12月12日提交的美国临时专利申请序列No. 61/736,429 ; 2013年3月15日提交的美国临时专利申请序列No. 61/794, 461 及2013年9月19日提 交的美国临时专利申请序列No. 61/880, 048的优先权，每个专利在此W引用的方式整体并 入。
[000引领域
[0004] 本发明提供用于检测和分析生物活性剂与细胞祀标的细胞内结合的组合物和方 法。具体说来，本文提供拴系至巧光团的生物活性剂；融合至生物发光报道子、或生物发光 报道子的部分、组分或亚基的细胞祀标；W及检测和分析生物活性剂与随其的细胞祀标的 相互作用的方法。
[000引背景
[0006] 分子种类与细胞祀标的相互作用在理解细胞生理学和开发治疗干预措施如新的 合成药物和生物药剂中是极其重要的。需要精确且高效地测定祀标结合（engagement)的 方法，特别是在其中该些相互作用介导其表型响应的活细胞内。有效地检测祀标结合的能 力对发现过程具有广泛的启示，包括高通量筛选、优化对药物先导物的命中物化it)的筛 选、W及发现和表征治疗相关的细胞祀标。
[0007] 使用小分子文库的基于表型的筛选在药物发现领域中起重要作用。使用该种筛 选方法，在没有预先得知其潜在的细胞祀标的情况下就其引发表型响应（例如缓解疾病症 状）的能力对化合物文库进行筛选。虽然此方法可用于鉴定能够调节细胞生理的生物活性 剂，例如小分子，但确定该些小分子命中物的生物相关祀标是主要的技术挑战。另外，促进 一些想要的表型响应的小分子可由于脱祀相互作用而成为体内不利因素。为了预测药物选 择性并使可能的副作用减至最少，重要的是还鉴定了脱祀相互作用（例如较低的亲和力）。 目前用于鉴定生物活性剂祀标的大多数方法都依赖使用含有选择性部分（例如生物活性 剂或相关化合物）和分类部分（例如亲和标记物或固体支持物）的"双官能"化合物从复杂 的细胞裂解物富集该些祀标。因为富集是基于化合物的结合特性，其中该些化合物对于其 祀标的固有亲和力是不够的，所W化合物类似物被设计W便共价地结合至祀标（例如光交 联）。通过任一种方法，祀标分离的效力和特异性是必需的，且该些方法的失败率很高。该 些方法的失败可能是由于祀标的不充分捕获或因非特异性捕获所致的高本底。此失败的影 响因素包括；化合物W低至中等亲和力在难W检测的该些相对较弱的相互作用下结合多个 祀标；缺乏稳固的、简明的、无偏技术来表征检测到的相互作用；不能在相互作用可依赖的 天然细胞环境内进行祀标分离；所提供的关于祀标在细胞中的结合效能的信息有限；W及 由于非特异性结合至固体支持物或官能化小分子所致的假阳性相互作用的高本底。
[000引 概述
[0009] 在一些实施方案中，本发明提供BRET测定系统，其包含；(a)拴系至发色团（例如 巧光团）的生物活性剂；化）融合至生物发光报道子的细胞祀标；W及（C)所述生物发光报 道子的底物。在一些实施方案中，生物活性剂是小分子。在一些实施方案中，生物活性剂是 蛋白质功能的抑制剂，例如酶抑制剂或受体抑制剂。在一些实施方案中，发色团是巧光团。 在一些实施方案中，巧光团是駿基若丹明类似物。在一些实施方案中，生物发光报道子包含 与SEQIDN0:1具有至少70%序列同一性（例如，75%同一性…80%同一性…85%同一 性…90%同一性、95%同一性…98%同一性…99%同一性）的多肤。在一些实施方案中， 化）是融合至生物发光报道子的部分、或亚基或组分的细胞祀标。在一些实施方案中，化） 是融合至需要与另一多肤相互作用W产生发光的多肤的细胞祀标。在一些实施方案中，（a) 和化）是在细胞内。在一些实施方案中，（b)作为与目标蛋白质（例如细胞祀标）一起的 融合蛋白在细胞内表达。在一些实施方案中，细胞祀标由一种W上组分、亚基或多肤组成， 例如，细胞祀标是蛋白质复合物。在一些实施方案中，生物发光报道子由一种W上组分、亚 基或多肤组成，例如，生物发光报道子是蛋白质复合物。在一些实施方案中，（a)是在细胞 外添加的并进入细胞中。在一些实施方案中，（a)存在于细胞内和细胞周围的介质中。在 一些实施方案中，（a)结合至细胞和于细胞周围的介质中存在。在一些实施方案中，（a)存 在于周围介质中的量显著地大于在细胞中或结合至细胞的量，例如大至少2倍、至少5倍、 10倍、30倍或100倍。在一些实施方案中，细胞祀标是生物活性剂的结合配偶体。在一些 实施方案中，生物发光报道子的发射光谱与巧光团的吸收光谱重叠。在一些实施方案中，生 物活性剂一旦与细胞祀标结合，底物通过生物发光报道子向反应产物的转化便造成巧光团 由BRET激发和来自巧光团的光发射。在一些实施方案中，（a)是拴系至发色团的试剂或化 合物文库中的一个。在一些实施方案中，（a)是拴系至巧光团的试剂或化合物文库中的一 个。在一些实施方案中，化）是融合至生物发光报道子的多个潜在的细胞祀标中的一个。在 一些实施方案中，化）是表达融合至生物发光报道子的多个潜在的细胞祀标中的一个的细 胞的文库。
[0010] 在一些实施方案中，本发明提供对生物活性剂与细胞祀标的结合进行检测、分析、 表征等的方法。在一些实施方案中，细胞祀标可W是主要的药物祀标。在一些实施方案中， 细胞祀标是可在体内引起不希望的副作用的脱祀倾向（liability)。在一些实施方案中，生 物活性剂与细胞祀标的结合可能不具有可辨别的生物效应。在一些实施方案中，本发明提 供细胞，其包含W下一个或多个（例如其中的每一个）；(a)拴系至发色团（例如巧光团） 的生物活性剂；化）融合至生物发光报道子的细胞祀标；W及（C)所述生物发光报道子的底 物。在一些实施方案中，生物活性剂与细胞祀标的结合是非共价的。在一些实施方案中，发 色团是巧光团。在一些实施方案中，本发明提供用于检测生物活性剂与细胞祀标之间的相 互作用的方法，其包括；(a)在细胞中表达所述细胞祀标与在第一波长（例如，波长范围、光 谱分布等）下发射能量的生物发光报道子的融合体；化）使所述细胞与拴系至巧光团的所 述生物活性剂接触，其中所述巧光团在所述第一波长下接收能量且在第二波长（例如，波 长范围、光谱分布等）下发射能量；（C)使所述细胞与所述生物发光报道子的底物接触；（d) 在所述第二波长下检测能量，其中在所述第二波长下所述能量的存在指示所述生物活性剂 与所述细胞祀标相互作用。
[0011] 在一些实施方案中，本发明提供用于检测生物活性剂与细胞祀标之间的相互作用 的方法，其包括；(a)提供所述细胞祀标与生物发光报道子的融合体；化）使所述融合体与 拴系至发色团（例如巧光团）的所述生物活性剂接触；（C)使所述融合体与所述报道子的 底物接触；（d)检测发射光的光谱分布在不存在所述发色团下相对于与所述底物接触的所 述融合体的变化。在一些实施方案中，本发明提供用于检测第二生物活性剂与细胞祀标的 相互作用的方法，其包括；(a)提供所述细胞祀标与生物发光报道子的融合体；化）使所述 融合体与拴系至发色团（例如巧光团）的第一生物活性剂和所述第二生物活性剂接触；（C) 使所述融合体与所述报道子的底物接触；（d)检测发射光的光谱分布在不存在所述第二生 物活性剂下相对于与所述第一生物活性剂和所述底物接触的所述融合体的变化。在一些实 施方案中，发射光的光谱分布的变化是由于所述第二生物活性剂置换所述第一生物活性剂 而引起。在一些实施方案中，所述置换是竞争性置换。在一些实施方案中，发射光的光谱分 布的变化被用于估计生物活性剂与细胞祀标的结合亲和力。在一些实施方案中，所述第二 生物活性剂是多种生物活性剂中的一种。在一些实施方案中，发射光的光谱分布的变化被 用于估计多种生物活性剂与细胞祀标的相对结合亲和力。在一些实施方案中，所述第一生 物活性剂和所述第二生物活性剂是合成分子。在一些实施方案中，所述细胞祀标是在活细 胞、透化的细胞或细胞裂解物中。在一些实施方案中，发射光的光谱分布的变化是通过测量 在两个不同波长或两个不同波长范围下的光强度的比率来测定的。在一些实施方案中，检 测光谱分布随时间的变化。在一些实施方案中，发色团是巧光团。
[0012] 在一些实施方案中，本发明提供一种BRET测定系统，其包含；(a)拴系至巧光团的 生物活性剂；化）融合至生物发光报道子的结构互补肤的第一相互作用配偶体；（C)融合至 生物发光报道子的结构互补多肤的第二相互作用配偶体；W及（d)所述生物发光报道子的 底物，其中第一与第二相互作用配偶体相互作用W形成相互作用复合物，并且其中第一相 互作用配偶体、第二相互作用配偶体和/或相互作用复合物是所述生物活性剂的结合配偶 体。在一些实施方案中，第一相互作用配偶体和第二相互作用配偶体是相互作用W形成蛋 白质复合物的蛋白质或多肤。在一些实施方案中，第一相互作用配偶体和第二相互作用配 偶体通过结构互补多肤的相互作用被合在一起。在一些实施方案中，结构互补多肤通过第 一相互作用配偶体与第二相互作用配偶体的相互作用被合在一起。在一些实施方案中，第 一相互作用配偶体与第二相互作用配偶体的相互作用是通过发光的增加来测定的。在一些 实施方案中，第一与第二相互作用配偶体在生物活性剂的存在或不存在下形成相互作用复 合物。在一些实施方案中，相互作用复合物是生物活性剂的结合配偶体，但第一或第二相互 作用配偶体单独都不是生物活性剂的结合配偶体。在一些实施方案中，相互作用配偶体中 的一个而非另一个是生物活性剂的结合配偶体。在一些实施方案中，相互作用复合物形成 需要生物活性剂结合至相互作用配偶体。在一些实施方案中，相互作用复合物形成不依赖 于生物活性剂的结合。在一些实施方案中，本发明提供BRET测定系统，其包含；(a)拴系至 巧光团的生物活性剂；化）融合至生物发光报道子的结构互补肤的细胞祀标；（C)生物发光 报道子的结构互补多肤；W及（d)生物发光报道子的底物。在一些实施方案中，生物发光报 道子的互补肤和多肤缔合形成活性生物发光报道酶。在一些实施方案中，一旦生物活性剂 与细胞祀标结合且互补肤和多肤缔合，底物通过生物发光报道酶向反应产物的转化便造成 巧光团被BRET激发和来自所述巧光团的巧光发射。
[0013] 在一些实施方案中，本发明提供一种测定系统，其包含；(a)拴系至巧光团的生物 活性剂；化）融合至生物发光报道子的互补肤的第一结合配偶体；（C)融合至生物发光报道 子的互补多肤的第二结合配偶体；W及（C)生物发光报道子的底物。在一些实施方案中，生 物发光报道子的互补肤和多肤缔合形成活性生物发光报道酶。在一些实施方案中，当第一 与第二结合配偶体相互作用，生物活性剂结合至相互作用配偶体且互补肤和多肤发生缔合 时，底物通过生物发光报道酶向反应产物的转化造成巧光团被BRET激发和来自所述巧光 团的巧光发射。
[0014] 在一些实施方案中，生物活性剂拴系至巧光或发光巧灭剂（例如D油cyl)。在该样 的实施方案中，未拴系的生物活性剂的滴定产生信号增益。
[0015] 在一些实施方案中，本发明提供对本文所述的任一系统成像（例如，BRET成像、经 由电荷禪合器件摄影机等）W便证实和/或鉴定巧光的位置（例如胞内、胞外等）和/或 由系统组分（例如生物活性剂、细胞祀标等）的存在和/或相互作用产生的BRET信号。
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