通过荧光共振能量转移方法原位定量活细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及蛋白质相互作用的方法，更具体地，涉及 通过荧光共振能量转移方法确定细胞中第一蛋白与第二蛋白是否存在相互作用的方法。
【背景技术】
[0002] 共振能量转移（RET:resonance energy transfer)，1948 年由科学家 Forster 首 次发现，因此称为FRET(Forster resonance energy transfer)。同时由于受体通常为焚 光分子，由此FRET也常被i全释为焚光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer)。荧光蛋白FRET在研宄活体（活细胞）水平上的分子间相互作用具有高度的特 异性和灵敏性，使其成为生命科学领域重要的研宄手段和方法。
[0003] 然而，目前常用的FRET方法尚存在各种缺陷，例如，受体光漂白FRET(apFRET)是 一种自身对照的FRET测量方法，该方面是目前比较准确的FRET效率定量技术。但它的不 足在于其对细胞有很大的光毒性，只能做一次而且时间分辨率很差（通常需要好几分钟）； pcFRET是把光切换荧光基团和apFRET相结合的技术，运用这种方法，供体的荧光强度随着 受体的光切换而振荡，它保留了 apFRET效率计算的准确性特点，同时，相较于apFRET，它大 大缩减了成像时间（~10秒），使计算具有可重复性，减少了对细胞的光毒性，减弱了对荧 光蛋白的淬灭，但pcFRET不适合作为双杂交FRET的定量工具。
[0004] 因此，FRET技术仍有待于进一步改进。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的 在于提出一种具有能在FRET定量、无需计算所需的对照实验、能观察动力学过程、对样品 具有普适性四个方面满足要求的新型FRET方法。
[0006] 需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：
[0007] 发明人发现，将荧光蛋白Dronpa标记的I⑶IF与荧光蛋白rsTagRFP标记的 PreIQ3-IQD-AD共表达于哺乳动物HEK293T，采用dsFRET的方法，即通过在下列三种条件 的每一种条件下：（a)打开焚光蛋白Dronpa，打开焚光蛋白rsTagRFP ; (b)打开焚光蛋白 Dronpa，关闭焚光蛋白rsTagRFP ;以及（c)关闭焚光蛋白Dronpa，打开焚光蛋白rsTagRFP， 分别用下列三种激发光和发射光的条件下检测所述细胞的荧光值：（1)用504nm的光照射 样品，同时用542nm的发射滤波片去接收发射光；（2)用504nm的光照射样品，同时用620nm 的发射滤波片去接收发射光；(3)用565nm的光照射样品，同时用620nm的发射滤波片去 接收发射光。通过对获得的荧光值进行拟合计算，获得FR值，通过FR值进一步判断蛋白 质之间的相互作用。发明人发现采用本发明的双光切换FRET法（dual-switchable FRET， dsFRET)比现在广泛使用的3-cube FRET方法，计算更加准确、稳定，对不同状态的细胞更 具普适性，更能体现出真实的蛋白之间相互作用情况。
[0008] 因而，本发明提供了一种通过荧光共振能量转移方法确定细胞中第一蛋白与第二 蛋白是否存在相互作用的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：
[0009] (1)在细胞中表达第一融合蛋白和第二融合蛋白，其中，所述第一融合蛋白包括第 一蛋白和作为供体的第一可关闭荧光蛋白，所述第二融合蛋白包括第二蛋白和作为受体的 第>可关闭焚光蛋白；
[0010] (2)在下列三种条件的每一种条件下：(a)打开所述第一可关闭荧光蛋白，打开所 述第二可关闭荧光蛋白；(b)打开所述第一可关闭荧光蛋白，关闭所述第二可关闭荧光蛋 白；以及（c)关闭所述第一可关闭荧光蛋白，打开所述第二可关闭荧光蛋白，分别在下列三 种激发光和发射光的条件下进行检测所述细胞的荧光值：（i)激发光的波长为nl，发射光 的波长为n2,其中nl表示所述第一可关闭荧光蛋白的激发波长，n2表示所述第一可关闭 荧光蛋白的接受波长；（ii)激发光的波长为nl，发射光的波长为n4,其中，n4表示所述第 二可关闭荧光蛋白的接受波长；以及（iii)激发光的波长为n3,发射光的波长为n4,其中， n3表示所述第二可关闭荧光蛋白的激发波长，以便获得由下列荧光绝对值组成的数据集： Snl-n4 (DM)、Snl-n2 (DM)、Sn3-n4 (DM)、Snl-n4 (D_On ly)、SnLn2 (D_On ly)、Sn3-n4 (D_On ly)、Snl-n4 (Α_ Only)SnlJ(AJMy)和Sn3n4(A_Only)，其中，（DM)表示所述第一可关闭荧光蛋白和第二可 关闭荧光蛋白均被打开，（D_Only)表示所述第一可关闭荧光蛋白被打开，所述第二可关闭 荧光蛋白被关闭，（A_Only)表示所述第一可关闭荧光蛋白被关闭，所述第二可关闭荧光蛋 白被打开。
[0011] ⑶基于所述数据集，确定参数FR数值，并且基于所述参数FR数值确定所述第一 蛋白与所述第二蛋白之间是否存在相互作用。
[0012] 与现有的技术相比，本发明至少具有以下有益的技术效果：
[0013] 1.对于FRET效率的测量，能够实现定量、无需供体及受体对照、时间分辨率能够 满足细胞一般动力学过程的需求、对二聚体或双杂交实验均适用；
[0014] 2.在细胞水平上，基于原位细胞的FRET参数及FRET效率计算更接近实际情况，相 比于传统方法其测量值更为精确；
[0015] 3.无需对照实验，节省实验开销；
[0016] 4.在亚细胞水平上，基于细胞内原位参数实现FRET定量，获得FRET效率的胞内分 布成像。
[0017] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。
【附图说明】
[0018] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变 得明显和容易理解，其中：
[0019] 图1显示了根据本发明一个实施例的dsFRET基本原理示意图；
[0020] 图2显示了根据本发明一个实施例的dsFRET成像装置示意图；
[0021] 图3显示了根据本发明一个实施例的dsFRET实验流程图；
[0022] 图4显示了根据本发明一个实施例的Dronpa与rsTagRFP对的哺乳细胞HEK293T 的dsFRET实验结果及与3-cube FRET的实验结果的示意图；
[0023] 图5显示了根据本发明一个实施例的Dronpa与rsTagRFP对的哺乳细胞HEK293T 的dsFRET实验及3-cube FRET实验的数据统计示意图；
[0024] 图6显示了根据本发明一个实施例的Dronpa标记的I⑶IF与rsTagRFP标记的 PreIQ3-IQD-AD双杂交的dsFRET实验的FR值示意图；
[0025] 图7显示了根据本发明一个实施例的Dronpa标记的I⑶IF与rsTagRFP标记的 PreIQ3-IQD-AD双杂交的3-cube FRET实验的FR值示意图；
[0026] 图8显示了根据本发明一个实施例的Dronpa标记的I⑶IF与rsTagRFP标记的 PreIQ3-IQD-AD的对Ab的结合曲线示意图；
[0027] 图9显示了根据本发明一个实施例的Dronpa标记的I⑶IF与rsTagRFP标记的 PreIQ3-IQD-AD的对Dfree的结合曲线示意图；
[0028] 图10显示了根据本发明一个实施例的一个视野下两个表达Dronpa标记的I⑶IF 与rsTagRFP标记的PreIQ3-IQD-AD的细胞的用dsFRET方法计算得到的FR值的三维示意 图；
[0029] 图11显示了根据本发明一个实施例的一个视野下两个表达Dronpa标记的I⑶IF 与rsTagRFP标记的PreIQ3-IQD-AD的细胞的用3-cube FRET方法计算得到的FR值的三维 示意图；
[0030] 图12显示了根据本发明一个实施例的显微镜观察的表达rsTagRFP-Dronpa的哺 乳细胞HEK293T的两个通道荧光成像的图片、33-FRET荧光成像图及dsFRET荧光成像图；
[0031] 图13显示了根据本发明一个实施例的表达rsTagRFP-Dronpa的哺乳细胞HEK293T 的线轨迹示意图；
[0032] 图14显示了根据本发明一个实施例的表达rsTagRFP-Dronpa的哺乳细胞HEK293T 细胞膜与细胞质相关值的比例的示意图；
[0033] 图15显示了根据本发明一个实施例的共表达rsTagRFP-Dronpa-ras与rsTagRFP 的哺乳细胞HEK293T的亚细胞分布的荧光显微图片；以及
[0034] 图16显示了根据本发明一个实施例的表达rsTagRFP-Dronpa与共表达 rsTagRFP-Dronpa-ras、rsTagRFP的哺乳细胞HEK293T的细胞膜与细胞质处FR比例的统计 示意图。
【具体实施方式】
[0035] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终 相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附 图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0036] 本发明的荧光共振能量转移方法的基本原理如图1所示，设计一个双开关FRET 对，即Donor蛋白和Accepter蛋白，通过不同的可逆光可以切换两种蛋白的开关，从而可以 原位获取计算所需参