双受体时间分辨时间分辨荧光共振能量转移法
【专利摘要】本发明提供了使用双受体时间分辨荧光共振能量转移法确定样品中是否存在多种分析物的方法。
【专利说明】双受体时间分辨时间分辨荧光共振能量转移法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2012年2月6日提交的第61/595，459号美国申请的权益，这里通过引用将其全部内容并入本文。
【技术领域】
[0003]本发明涉及利用时间分辨突光共振能量转移法(time-resolved fluorescenceresonance energy transfer)确定样品中是否存在两种种或多种分析物的多重分析(multiplex assays)。
【背景技术】
[0004]时间分辨荧光共振能量转移法(TR-FRET)的应用的基础是供体(donor)分子和受体(acceptor)分子之间的能量传递。FRET是从荧光供体分子至合适的受体分子的非辐射能量的转移。当光源激发供体分子时，就会产生荧光。如果紧邻受体分子且供体分子的发射光谱和受体分子的激发光谱重叠，那么供体分子能够将其激发能量转移至受体分子，而不是发射荧光。之后，受体分析会在受体发射波长下发射荧光。在受体发射波长下出现荧光表明供体和受体分子彼此紧邻，这是因为供体和受体分子需相距小于约20nm，例如相距5?10nm，才能发生能量转移。通常，通过生物亲和性相互作用，例如通过蛋白质-蛋白质结合、抗原-抗体结合、配体-受体结合、DNA杂交和DNA-蛋白质结合，来实现供体和受体分子的接近。
[0005]存在种类繁多的供体和受体分子。通常，用于FRET分析中的供体和受体分子是半衰期短的荧光基团。来自样品组分(例如缓冲液、蛋白质、化合物和细胞溶胞产物)的背景荧光能降低常规FRET化学的性能。针对这种会降低分析灵敏度，并且使结果分析复杂化的自发突光(auto-fluorescence),必须对检测到的突光强度进行校正。这种类型的背景突光是瞬时的(具有在纳秒范围内的寿命)，因此可使用时间分辨方法来消除。
[0006]TR-FRET利用镧系元素的离子例如铕(Eu)、铽(Tb)、钐(Sm)、镝(Dy)的离子的特有性质。由于其特定的光物理和光谱性质，稀土离子的络合物对生物学中的荧光应用来说是感兴趣的。具体而言，相对于更常见的荧光基团，它们具有大的斯托克斯位移(Stoke’ sshifts)和长的发射半衰期(从微秒至毫秒)。
[0007]通过直接激发难以产生镧系元素离子的荧光，这是因为这些离子吸收光的能力较差。镧系元素必须先与能捕(harvest)光并通过分子内的非辐射过程将光转移至镧系元素的有机部分(organic moieties)络合。稀土元素的螯合物和穴合物是捕光部分(light-harvesting moieties)的实例。所收集的能量被转移至稀土离子,然后发射其特征性的长寿命荧光。镧系元素螯合物通常还具有高量子产率，从而使少量供体产生光亮信号，进而提高了灵敏度。此外，它们的发射峰相当窄，从而对受体发射光的干扰很小。用于技术平台的重要金属之一是铕(在约315?350nm的波长下激发,而在约600?635nm的波长下发射)。
【发明内容】
[0008]本发明至少部分地基于TR-FRET的新方法。铕的螯合物在至少一个波长下发射能量。在忽略不明显的峰的情况下，其具有两个主要的发射峰:一个峰在约600?635nm处,而另一个在约675?715nm处(图1)。该观测结果增大了存在于TR-FRET分析中的具有两种的受体分子的概率:其中一种与600?635nm的发射峰相互作用，和另一种与675?715nm的发射峰相互作用。因此，镧系元素螯合物受体使得能够进行两个同步的分析以检测样品中的两种分析物或变体(modificat1n)。
[0009]一方面，本发明提供了确定样品中是否独立存在两种分析物的方法。该方法包括使样品接触第一分析物特异性的结合配体(analyte-specific binding partner)和第二分析物特异性的结合配体，其中该第一和第二分析物特异性的结合配体分别配合(conjugate)至镧系元素螯合物部分(lanthanide chelate moiety);使样品暴露于能够激发第一和第二分析物特异性的结合配体中的螯合物(chelate)的镧系元素的波长范围内的光；以及，独立确定第一分析物特异性的结合配体和第二分析物特异性的结合配体是否分别结合第一分析物和第二分析物，由此确定样品中的这两种分析物是否独立存在。
[0010]另一方面，本发明特征在于确定酶对两种不同的底物是否具有活性的方法。该方法包括提供包含两种不同底物的样品；在足以从第一底物中产生第一分析物且从第二底物中产生第二分析物的条件下，使该样品和酶接触；使该样品接触第一分析物特异性的结合配体和第二分析物特异性的结合配体，其中第一和第二分析物特异性的结合配体分别配合镧系元素螯合物部分；使样品暴露于能够激发第一和第二分析物特异性的结合配体中螯合物的镧系元素的波长范围内的光；以及，独立地确定第一分析物特异性的结合配体和第二分析物特异性的结合配体是否分别结合第一分析物和第二分析物，由此确定所述酶是否对第一和第二底物具有活性。
[0011]又一方面，本发明提供了确定两种酶是否独立地对底物具有活性的方法。该方法包括:提供包含底物的样品；在足以用第一酶产生第一分析物和用第二酶产生第二分析物的条件下，使样品接触两种不同的酶；使样品接触第一分析物特异性的结合配体和第二分析物特异性的结合配体，其中第一和第二分析物特异性的结合配体分别配合镧系元素螯合物部分；使样品暴露于能够激发第一和第二分析物特异性的结合配体中的螯合物的镧系元素的波长范围内的光；以及，独立地确定第一分析物特异性的结合配体和第二分析物特异性的结合配体是否分别结合第一分析物和第二分析物，由此独立地确定第一和第二酶对底物的活性。
[0012]一方面，本发明特征在于确定样品中是否独立存在两种分析物的方法。该方法可以包括使该样品接触结合第一突光能量共振转移(fluorescence energy resonancetransfer) (FRET)受体的第一分析物特异性的结合配体、结合第二 FRET受体的第二分析物特异性的结合配体和包含镧系螯合物部分的化合物；使样品暴露于能够激发螯合物中的镧系元素的波长范围内的光；以及，独立地确定第一分析物特异性的结合配体和第二分析物特异性的结合配体分别结合第一分析物和第二分析物，由此检测样品中是否独立存在这两种分析物。在一些实施方式中，第一和第二分析物分别包含亲和性标记物，而含镧系元素螯合物部分的化合物进一步包括亲和性标记物特异性的结合配体。
[0013]又一方面，本文描述了确定两种酶是否独立地对底物具有活性的方法。该方法包括:提供包含底物的样品，其中该底物标记有亲和性标记物；在足以用第一酶产生第一分析物和用第二酶产生第二分析物条件下，使该样品接触两种不同的酶；使该样品接触具有镧系元素螯合物部分的亲和性标记物特异性的结合配体；使该样品接触第一分析物特异性的结合配体和第二分析物特异性的结合配体，其中第一和第二分析物特异性的结合配体分别配合能够由波长为约600?635nm的光激发的检测部分和能够由波长为约675?715nm的光激发的另一检测部分；使该样品暴露于能够激发螯合物中镧系元素的波长范围内的光；以及，独立地确定第一分析物特异性的结合配体和第二分析物特异性的结合配体是否分别结合第一分析物和第二分析物，由此独立地确定第一和第二酶对底物的活性。
[0014]在一些实施方式中，两种螯合物部分的镧系元素是相同的。在一个实施方式中，经配合的螯合物部分(conjugated chelate moiety)在两种结合配体中是相同的。能够使用任何合适的镧系元素螯合物部分。在一些实施方式中，螯合物部分可以选自吡啶、联吡啶、三批唳、水杨酸、香豆素衍生物、菲咯啉(phenanthroline)和卩比唑衍生物(Hemmi^ etal., J Fluoresc 15:529?42，2005，通过引用将其并入本文)。
[0015]在一些实施方式中,第一和第二分析物分别独立地配合检测部分。在一些实施方式中，检测部分是FRET受体。在一个实施方式中，检测部分中的一种能够由波长为约600?635nm(例如 600 ?610nm、605 ?615nm、610 ?620nm、615 ?625nm、620 ?635nm、625 ?635nm)的光激发,而检测部分中的另一种能够由波长为约675?715nm(例如675?685nm、685 ?695nm、690 ?700nm、695 ?705nm、690 ?710nm、700 ?710nm、700 ?715nm、705 ?715nm)的光激发。
[0016]在一些实施方式中，镧系元素选自铕、铽、钐和镝。
[0017]在一些实施方式中，使样品暴露于波长为约275?350nm的光。在一些实施方式中，使样品暴露于波长为约315?350nm(例如315?320nm、315?325nm、320?330nm、325 ?335nm、330 ?340nm、320 ?340nm、325 ?340nm、330 ?340nm、325 ?345nm、330 ?345nm、335 ?345nm、340 ?350nm)的光。
[0018]在一些实施方式中，确定第一分析物特异性的结合配体是否结合第一分析物包括检测波长为约 650 ?680nm(例如 655 ?665nm、655 ?670nm、660 ?670nm、660 ?675nm、665?675nm)的发射光。
[0019]在一些实施方式中，确定第二分析物特异性的结合配体是否结合第二分析物包括检测波长为约 715 ?750nm(例如 715 ?725nm、715 ?730nm、720 ?730nm、720 ?735nm、725 ?735nm、725 ?740nm、730 ?740nm)的发射光。
[0020]在一些实施方式中，第一和第二分析物特异性的结合配体分别包括分析物结合分子。
[0021]在一些实施方式中，样品对于可见光是不透明的。在一些实施方式中，样品包括纯化分子、膜、组织提取液、血液(以及包含血清和血浆的血液衍生物)、细胞溶解物(celllysates)和细胞培养上清液，以及其它生物流体(脑脊液、尿)。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1示出了铕螯合物的发射光谱图。
[0023]图2示出了使用两种标记有不同受体分子(ULight和NIR-染料)的肽进行分析的示意图。
[0024]图3示出了使用两种分别标记有不同的受体分子(ULight和NIR-染料)的抗体和靶肽进行分析的示意图。
[0025]图4示出了多重TR-FRET分析后的原理示意图。
[0026]图5A和图5B示出了由单重检测分析得到的信号检测的线图。
[0027]图6示出了由多重检测分析得到的信号检测的线图。
[0028]图7A和图7B示出了由使用单酶(single enzyme)的多重检测分析、酶滴定得到的信号检测的线图。
[0029]图8A和SB示出了由使用单酶的多重检测分析、辅因子滴定得到的信号检测的线图。
[0030]图9示出了由多重的双酶辅因子滴定分析得到的信号检测的线图。
[0031]图1OA和1B是示出了由使用单酶的多重检测分析、抑制剂滴定得到的信号检测的线图。
[0032]图11示出了由使用双酶的多重检测分析、抑制剂滴定得到的信号检测的线图。
[0033]图12是示出了由用于确定Z’值的使用双酶的多重检测分析得到的信号检测的散点图。
[0034]除非另有声明，本文所使用的全部技术和科学术语具有和本发明所属【技术领域】的技术人员所通常理解的相同含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；还可以使用本领域已知的其它合适的方法和材料。这些材料、方法和实例仅是示例性的，而不希望是限定性的。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利、序列表、数据库项(database entry)和其它引用文献通过引用以其整体并入。
[0035]发明详述
[0036]使用现有的FRET技术测量样品中的多种分析物在技术难度上具有挑战性。为了测量样品中多于一种的分析物，通常会需要使用多对供体和受体分子。这就产生了对多个激发波长的需要和潜在的涉及峰重叠和串扰的复杂分析。受到同一波长激发时会发出两种不同发射峰的单供体分子和双受体分子的组合使得能够在单一样品中同时检测两种分析物，从而降低了复杂性、节省了试剂和节约了时间。
[0037]通常在TR-FRET中，镧系元素螯合物(例如包括镧系元素的离子，例如铕离子、铽离子、钐离子或镝离子的螯合物)在约315?350nm(例如320?340nm)被激发以产生约600?635nm(例如610?620nm)的光。该能量能够被转移至紧邻(例如I?20nm)的受体分子。然后，该受体分子在约655?675nm(例如660?670nm)发出突光。
[0038]在约315?350nm (例如320?340nm)激发的铕螯合物还发出约675?715nm (例如680?710nm)的光。通过使用在约675?715nm(例如680?710nm)吸收并且在约715?740nm(例如720?730nm)发射的受体分子，尽管使用单螯合物也能够产生第二种发光颜色。这使得能够在一个样品中对两种样品加以测量，并还产生约715?740nm的极具穿透性的光，能够在不透明的样品(例如含纯化分子的样品、膜、组织提取物、血液(以及包含血清和血浆的血液衍生物)、细胞溶解物和细胞培养上清液，以及其它生物流体(例如脑脊髓流体、尿))中读取所述光。
[0039]在不透明的介质中实施TR-FRET是复杂的，因为在常规TR-FRET所发出的光穿不透这些介质。然而,约715?740nm(例如720?730nm)的发射光在这些波长下是高穿透性的。此外，大于675nm(例如约675?715和约715?740nm的发射光)的发射波长在常见化合物中是罕见的，因此降低了在利用镧系元素(例如铕、铽、钐和镝)的螯合物的第二主发射峰所进行的分析中产生干扰的风险。如果存在干扰问题，那么第二波长是分析中的潜在对照。
[0040]荧光共振能暈转移
[0041]在一些实施方式中，本文所述方法使用检测两种或更多种分析物的基于FRET的同质分析(homogenous assays)。基于FRET的分析记载于第5，981，200号美国专利,这里通过引用将其并入本文。FRET需要至少两种染料分子:充当FRET供体的第一染料和充当FRET受体的第二染料。通常，FRET供体为能量供体，而FRET受体为能量受体。FRET是在FRET供体和FRET受体之间发生的能量转移(下文将作详细描述)，并且是在所谓的FRET分析期间测得的信号。
[0042]具有合适的发射和激发光谱的彼此紧邻的荧光分子能够进行FRET。该过程如下:首先，例如使用皮秒激光脉冲激发FRET供体，并通过吸收光子形式的能量使其从基态转化成激发态。第二，FRET供体以荧光形式发出这种刚吸收的能量。第三，如果受激发的供体分子足够接近合适的受体分子，那么就能以荧光的形式将激发态从供体转移至受体。这种能量转移称作FRET。第四，FRET导致供体的荧光或发光减弱，并且如果受体本身是发光的，那么FRET就会导致受体的发光增强。使用FRET检测系统可测量由受体所发出的光，并且所述光和FRET是成比例的。因此，所采集的信息可被用于定性和定量分析。在一些实施方式中，从供体所发出的光和从受体所发出的光是不同波长的光。
[0043]FRET的效率，即当能量从供体染料转移至受体染料时所产生的信号，取决于供体染料和受体染料间的距离(Ι/d)，并且只有当供体和受体是紧密靠近时FRET才会发生。信号减弱正比于分隔距离的六次幂。因此，FRET测量了与距离相关的相互作用(distance-dependent interact1ns)。使用FRET所作的测量是在约I?20nm的范围内。
[0044]因此，如本文所使用的，相互作用是指能够由FRET测量方法所检测到的分子之间的距离变化。为了检测这种相互作用，必须使FRET供体和FRET受体配合至一个或多个分子并且一个或多个分子间的相互作用导致FRET供体和FRET受体间的距离的变化。
[0045]在一些实施方式中，FRET可以包括但不限于㈧以结合对的形式结合不同分子的FRET供体和FRET受体；⑶结合单一分子内的不同区域的FRET供体和FRET受体；和(C)结合三元络合物中的两个不同分子的FRET供体和FRET受体。然而，在(C)中，FRET供体和FRET受体所依附的两个不同分子必须以在供体和受体之间能够发生有效的能量转移的方式络合。
[0046]因此，FRET能够呈现出㈧来自FRET供体的荧光信号强度的减弱；⑶FRET供体的激发态寿命的缩短；和/或(C)通常在表示受体特征的较长波长(较低能量)下的荧光的再发射。
[0047]能够选择能量受体，使得它们抑制由供体所释放的被称为猝灭剂(quencher)的能量；或者使得FRET受体自身能够发出荧光能量，即它们发出荧光。该能量受体被称为荧光基团(fluorophore group)或突光基团(fIuorophore)。金属络合物适合作为突光能量供体和荧光能量受体。被选择用于FRET的荧光基团通常是明亮的(bright)并在10_9?10_4秒的时标(timescale)范围出现。这样的亮度和时标使得FRET的检测变得容易，并允许使用多种检测方法。
[0048]在一些实施方式中，基于以下中的一种或多种(包括全部)选择FRET供体和FRET受体:(I)FRET供体的发射光谱应与FRET受体的激发光谱重叠；(2) FRET配体(即FRET供体和FRET受体)的发射光谱应表现出非重叠的荧光性；(3) FRET的量子产率(即从FRET供体转移至FRET受体的能量)应尽可能高(例如FRET在整个的I?20nm(例如5?1nm)的测量距离内应具有约I?100% (例如30%,40%,50%,60%,70%,80%,85%,90%,95%、98%和99%)的效率)；(4)FRET信号(即荧光)必须区别于样品所产生的荧光(例如自发荧光)；以及(5) FRET供体和FRET受体应具有便于进行FRET信号检测的半衰期(例如FRET可以是明亮的并可以以范围为10_9?10_4的时间度标进行，如上所述)。
[0049]任何在约600?635nm或约675?715nm激发的FRET受体可以用于本发明的方法。在一些实施方式中，使用以及在近红外波长范围内激发的FRET受体。熟练的从业者会鉴别可供使用的众多市售的FRET受体，例如可商购于PerkinElmer的FRET受体(例如LANCE?产品)、可商购于 Invitrogen 的 FRET 受体(例如LanthaScreenf^S )和可商购于Cisb1 B1assays的FRET受体(例如HTRFli产品)。
[0050]在一些实施方式中，基于表I中所列出的荧光基团中的一种或多种来选择FRET供体和FRET受体。
[0051]表1:FRET分子的实例
[0052]
【权利要求】
1.确定样品中是否独立存在两种分析物的方法，其包括: 使所述样品接触第一分析物特异性的结合配体和第二分析物特异性的结合配体，其中所述的第一和第二分析物特异性的结合配体分别与镧系元素螯合物部分配合； 使所述样品暴露于能够激发所述第一和第二分析物特异性的结合配体中的螯合物的镧系元素的波长范围内的光；和 独立确定是否所述第一分析物特异性的结合配体和所述第二分析物特异性的结合配体分别结合所述第一分析物和所述第二分析物，从而确定所述样品中是否独立存在所述两种分析物。
2.确定酶对两种不同的底物是否具有活性的方法，其包括: 提供包含两种不同底物的样品； 在足以由所述第一底物产生第一分析物并且由所述第二底物产生第二分析物的条件下，使所述样品和酶接触； 使所述样品接触第一分析物特异性的结合配体和第二分析物特异性的结合配体，其中所述第一和第二分析物特异性的结合配体分别和镧系元素螯合物部分配合； 使所述样品暴露于能够激发所述第一和第二分析物特异性的结合配体中的螯合物的镧系元素的波长范围内的光；以及 独立确定所述第一分析物特异性的结合配体和所述第二分析物特异性的结合配体是否分别结合所述第一分析物和所述第二分析物，由此确定所述酶是否对所述第一底物和所述第二底物具有活性。
3.确定两种酶是否独立地对底物具有活性的方法，其包括: 提供包含底物的样品； 在足以使用第一酶产生第一分析物并且使用第二酶产生第二分析物的条件下使所述样品和两种不同的酶接触； 使所述样品接触第一分析物特异性的结合配体和第二分析物特异性的结合配体，其中所述第一和第二分析物特异性的结合配体分别和镧系元素螯合物部分配合； 使所述样品暴露于能够激发所述第一和第二分析物特异性的结合配体中的螯合物的镧系元素的波长范围内的光；以及 独立确定是否所述第一分析物特异性的结合配体和所述第二分析物特异性的结合配体分别结合所述第一分析物和所述第二分析物，从而独立确定所述第一酶和所述第二酶对所述底物的活性。
4.确定样品中是否独立存在两种分析物的方法，其包括: 使所述样品接触结合有第一荧光能量共振转移(FRET)受体的第一分析物特异性的结合配体、结合有第二 FRET受体的第二分析物特异性的结合配体和具有镧系元素螯合物部分的化合物； 使所述样品暴露于能够激发所述第一和第二分析物特异性的结合配体中的螯合物的镧系元素的波长范围内的光；以及 独立确定是否所述第一分析物特异性的结合配体和所述第二分析物特异性的结合配体分别结合所述第一分析物和所述第二分析物，从而确定所述样品中是否独立存在所述两种分析物。
5.确定两种酶是否独立地对底物具有活性的方法，其包括: 提供包含底物的样品，其中所述底物标记有亲和性标记物； 在足以使用第一酶产生第一分析物并且使用第二酶产生第二分析物的条件下使所述样品和两种不同的酶接触； 使所述样品接触具有镧系元素螯合物部分的亲和性标记物特异性的结合配体； 使所述样品接触第一分析物特异性的结合配体和第二分析物特异性的结合配体，其中所述第一和第二分析物特异性的结合配体分别配合于检测部分，其中之一能够被波长为约600?635nm的光所激发，而另一检测部分能够被波长为约675?715nm的光所激发； 使所述样品暴露于能够激发所述螯合物中的镧系元素的波长范围内的光；以及 独立确定是否所述第一分析物特异性的结合配体和所述第二分析物特异性的结合配体分别结合所述第一分析物和所述第二分析物，从而独立地确定所述第一酶和所述第二酶对所述底物的活性。
6.权利要求1?3所述的方法，其中在所述两个螯合物部分中的镧系元素是相同的。
7.权利要求1?3所述的方法，其中所述经配合的螯合物部分在两个结合配体中是相同的。
8.权利要求1?3所述的方法，其中所述第一和第二分析物分别独立地配合于检测部分。
9.权利要求8所述的方法，其中所述检测部分之一能够被波长为约600?635nm的光所激发，而另一检测部分能够被波长为约675?715nm的光所激发。
10.权利要求1?5的方法，其中所述镧系元素选自由铕、铽、钐和镝组成的组。
11.权利要求1?5的方法,其中使所述样品暴露于波长为约315?350nm的光。
12.权利要求1?5的方法,其中使所述样品暴露于波长为约320?340nm的光。
13.权利要求1?5的方法，其中确定所述第一分析物特异性的结合配体是否结合所述第一分析物包括检测波长为约655?675nm的发射光。
14.权利要求1?5的方法，其中确定所述第二分析物特异性的结合配体是否结合所述第二分析物包括检测波长为约715?740nm的发射光。
15.权利要求1?5的方法，其中所述第一和第二分析物特异性的结合配体分别包括分析物结合分子。
16.权利要求1?5所述的方法，其中所述样品对可见光是不透明的。
17.权利要求1?5所述的方法，其中所述样品包括纯化分子、膜、组织提取液、血液(以及包含血清和血浆的血液衍生物)、细胞溶解产物和细胞培养上清液，以及其它生物流体(脑脊液、尿)。
18.权利要求4所述的方法，其中所述第一和第二分析物分别包括亲和性标记物，并且具有镧系元素螯合物部分的所述化合物进一步包括亲和性标记物特异性的结合配体。
【文档编号】G01N33/53GK104204799SQ201380015407
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2013年2月6日 优先权日:2012年2月6日
【发明者】P.罗比, B.伯恩德, S.达汉 申请人:珀金埃尔默生物信号股份有限公司