能量转移增强荧光染料的制作方法
【专利说明】
[0001]技术领域本发明涉及的化工领域，尤其涉及一种能量转移的荧光染料的使用。发明背景
已经开发了各种荧光染料标记和检测样品中的组件。在一般情况下，优选的荧光染料具有高的量子产率和使染料可被用来检测被检测成分的少量的大的消光系数。荧光染料最好还具有大的斯托克斯位移，因此，容易区别于用来激发光源的荧光发射染料。已开发的一类荧光染料的能量转移荧光染料。在一般情况下，能量转移的荧光染料包括一个供体荧光团和受体荧光团。在这些染料中，在彼此相邻，并与正确的方向相对于彼此的位置时，供体和受体荧光团，被吸收的能量从供体荧光团的发射由受体荧光，导致受体荧光团发出荧光。因此重要的是能够有效地吸收激发能量的供体荧光团的能量有效地转移到受体荧光，激发态的供体荧光团。
[0002]对于这些检测方法中，理想的是同时采用一组中的两个或更多个频谱解析的荧光染料在同一时间，让一个以上的目标物质的样品中可检测到。使用多种染料的样品中的多个组件的同时检测减少了所需的时间串行检测样品中的单个组件。在多基因座的DNA探针检测的情况下，频谱解析的多个荧光染料的使用所需要的反应管的数量减少，从而简化了实验协议和便于制造的特定应用的试剂盒。在自动DNA测序的情况下，频谱解析的多个荧光染料的使用允许所有四种碱基在一个单一的线，从而增加数据吞吐量超过单色的方法和消除不确定性与车道间的电泳迁移率的变化的分析。
[0003]有与用于同时检测多个目标物质的样品中获得的一组荧光染料的一些困难，特别是对于需要电泳分离和治疗用酶，例如，DNA测序分析。例如，每个组中的染料必须从其他染料光谱解析。这是很难找到一个收集染料的发射光谱分光，由于有机荧光染料的典型的发射带的半宽度大约是4080纳米(nm)的可用频谱的宽度是有限的激发光源。如本文所用的术语“参考一组染料的光谱分辨率”表示染料的荧光发射带足够明显的，即，足够的非重叠的，该试剂各自的染料附着，例如多核苷酸，可以区分的基础上，使用标准的光检测系统由各自的染料产生的荧光信号，例如采用带通滤波器及光电倍增管，电荷耦合器件和摄谱仪，或类似的系统。与使用相关的一组染料的另一个困难是，染料一般不具有相同的最大吸光度。当染料的一组用于不具有相同的最大吸光度，创建一个权衡与提供多个光源，以激发每个在其最大吸光度的染料之间的较高的成本，较低的灵敏度每一种染料所产生的不兴奋，其最大吸光度。
[0004]除外，电荷，分子大小和构象的染料必须不会产生不利影响的片段的电泳迁移率。荧光染料也必须与用于创建或操作的片段，例如，DNA的合成的溶剂和试剂，缓冲液，酶聚合酶，连接酶的酶和类似的化学相容。
[0005]与当前可用的若丹明染料，特别是在多重检测方法的上下文相关联的一个缺点，是若丹明染料的相对宽的发射光谱。这种广泛的发射光谱限制之间的光谱分辨率光谱相邻染料，使这种染料组合的多组分分析的困难。与当前可用的若丹明染料的第二个缺点是它们的吸收光谱不匹配波长当前可用的固态倍频绿光二极管激光器，例如，固态钕YAG激光器，其中有一个在约532 nm的发射线。这是非常有利的，使用这样的激光器，因为它们具有紧凑的尺寸，使用寿命长，电源使用效率。能量转移的荧光染料具有一些功能，这使得他们有吸引力的同时检测多个目标物质的样品中，如在DNA测序中使用。例如，一个单一的供体荧光团可用于能量转移的一组荧光染料，染料，使每个有较强的吸收，在一个共同的波长。然后，通过不同的受体荧光团的能量转移染料，产生了一系列的能量转移染料，荧光发射光谱解析可以。任何使用的荧光染料的检测的灵敏度依赖于所产生的荧光染料的荧光信号的强度。因此，需要有很强的荧光信号的荧光染料。关于能量转移荧光染料，这些染料的荧光信号的强度依赖于吸收的能量受体荧光的供体荧光团的发射效率。反过来，这取决于多种变量，包括邻近的供体荧光团受体的荧光团和受体荧光团供体荧光团的相对的方向。因此，需要的能量转移的荧光染料中，供体和受体荧光团之间的取向是这样的供体和受体荧光团之间的能量高效地传递。
[0006]本发明涉及的连接子连接的供体到受体的能量转移染料的荧光染料染料。本发明还涉及具有增强的荧光能量转移的荧光染料。本发明还涉及本发明的染料的能量传递，使用的染料和试剂的方法，包括在其内的染料和试剂和试剂盒的试剂。具体实施方法1、能量转移本发明的染料链接器
本发明涉及新颖的连接子连接的供体到受体的能量转移染料的荧光染料染料。本发明还涉及能量转移的荧光染料，其中包括这些连接子。已发现在这些链接器以方便一个供体和受体的能量转移染料的染料之间的能量有效地转移。
[0007]2、本发明的能量转移染料
在一般情况下，本发明的能量转移染料包括供体染料吸收在第一波长的光，并发出响应的激发能量，是能够吸收激发能量供体染料发射的荧光的第二受体染料波长响应和链接器重视捐助染料的受体染料。关于本文所提供的所有的分子结构，它的目的是，这些分子结构不仅包括精确的电子结构，但还包括其所有的共振结构和状态。
[0008]根据本发明的能量转移的荧光染料的一类包括供体染料，咕吨类染料，受体染料和一个连接器，这是如本文所用，第I节中所述的连接子组的成员的成员咕吨染料包括所有的分子具有通式结构。
[0009]如上所述，根据本发明的能量转移染料的第一类包括供体基团，这是一个成员的咕吨类染料，因此具有咕吨环结构为4的环的位置。在该类别中的染料受体染料是一种能够吸收激发能量供体染料发射的荧光响应的第二波长的染料，该染料。
[0010]根据本实施例中，供体可以是荧光素，若丹明或不对称苯并类染料，这些染料每个会员提供了更广泛的咕吨类染料的成员。咕吨染料的一般结构式所示。具有一般咕吨，荧光素，若丹明，和非对称苯并环结构的，因为所有的染料都将落入的范围之内的各种各样的取代基，可被结合到这些不同类别的染料，这些染料中所示的取代基可以选自本发明。
[0011]这类接收器可以用在本实施例中的能量转移荧光染料的染料的例子包括，但不限于，咕吨染料，花青染料，酞菁染料，方酸染料。这些染料的一般结构中。这些染料中所示的取代基可以选自各种各样的可掺入到这些不同类别的染料，因为所有的染料具有一般的咕吨，荧光素，若丹明，不对称苯并，花青，酞菁，方酸环结构的取代基取代的目的是属于本发明的范围。
[0012]另外，本发明涉及的第四类的能量转移的荧光染料，其中供体染料是咕吨类染料的成员，和受体染料是咕吨，花青，酞菁或方酸菁类染料的成员。在该类别中的能量转移的染料，优选的是，供体染料的荧光素类的成员和受体染料发射最大值是大于约600nm和/或至少约100，最大发射纳米大于供体染料的最大吸收。
[0013]本发明第四类染料表现出不寻常的大斯托克的变化，所测得的供体和受体的发射之间的吸光度的差异。此外，这些染料表现出有效的能量转移，在该最小的供体荧光观察。有趣的是，从供体到受体，在一些属于这一类的染料，即使受体染料的吸收光谱不重叠的供体染料的发射光谱的能量转移。
[0014]受体在本实施方式中可以使用的染料的例子包括，但不限于5 -羧基-X。
[0015]本实施例中的能量转移染料还包括一个链接，供体到受体。该连接器用来连接供体到受体染料可以是任何连接器，根据所述第一和第二类的染料。然而，可以预见，备用链接器也可以使用在这个类染料。
[0016]本发明的上述的能量转移染料的例子。值得注意的是，染料有5 -羧基荧光素供体染料，咕吨染料各种各样的其他应当理解，可以容易地作为供体染料取代。还应当理解的是，各种各样的其它咕吨染料，以及花青，酞菁，方酸染料可以很容易地为5 -羧基ROX和Cy5的受体基团取代的，如上面已经描述了，所有这些方面的变化落入本发明的范围内的供体和受体染料。
[0017]在此实施例中的能量转移染料表现出异常大的斯托克的变化，这使得这些染料特别适合于使用与染料具有较小的斯托克移的四种荧光DNA测序。3、本发明包括能源传输染料试剂
本发明还涉及包含根据本发明的能量转移荧光染料的荧光试剂。第III部分中更详细地描述的，这些试剂可以用在各种各样的方法，用于检测样品中的一个组成部分的存在。
[0018]本发明的荧光试剂包括的任何分子或材料，本发明的染料的能量传递，可以附加用于检测基于荧光能量转移染料的试剂的存在下。本发明的染料可以附着到形成的试剂的分子和材料的类型包括，但不限于蛋白质，多肽，多糖，核苷酸，核苷，寡核苷酸，寡核苷酸类似物的(如肽核酸)，脂类，固相载体，有机和无机聚合物，以及它们的组合物，如染色体，细胞核，活细胞，如细菌等微生物，哺乳动物细胞和组织。
[0019]优选的本发明的试剂类，核苷酸，核苷，寡核苷酸和寡核苷酸的类似物已被修改，以包括本发明的能量转移染料。核苷酸和核苷类试剂的用途的例子包括，但不限于，标记的寡核苷酸形成的酶促合成，例如，PCR扩增，的桑格型寡核苷酸测序，缺口转译反应中的上下文中使用的三磷酸核苷。寡核苷酸的试剂的用途的例子包括，但不限于，作为DNA测序的引物，PCR引物的寡核苷酸杂交探针并等。
[0020]一个特定的实施例中所用试剂标记的核苷(NTP)，如胞嘧啶，腺苷，鸟苷，胸苷，能量传递的本发明的荧光染料标记的。这些试剂可用于在多种涉及寡核苷酸合成的方法。另一个相关的实施例中，标记的核苷酸，例如，单-，双-和三磷酸核苷的磷酸酯的。这些试剂包括，特别是脱氧核苷三磷酸，如三磷酸脱氧胞苷，脱氧腺苷三磷酸，三磷酸脱氧鸟苷，脱氧胸苷三磷酸，能量传递的本发明的荧光染料标记的。也可以使用这些试剂，例如，作为聚合酶底物的染料标记寡核苷酸的制备。这些试剂还包括标记的双脱氧核苷三磷酸，另一个实施例的试剂，其中包括能量传递的本发明的荧光染料的寡核苷酸。
[0021 ] 本发明的能量转移染料标记的寡