核苷酸的合成，可以使用任何已知的寡核苷酸标记技术，使用已知的联系，连接基团，和相关的互补官能大量的完成。例如，标记的寡核苷酸可被合成酶，例如，使用DNA聚合酶或连接酶。一般地,如果使用酶促合成标记的寡核苷酸，可以使用下面的过程可能。的模板DNA变性的寡核苷酸引物退火到模板DNA。甲脱氧核苷三磷酸的混合物中加入包括三磷酸的dATP，dCTP标记，和dTTP，其中至少有一个脱氧核苷酸的一小部分被标记为与上述的本发明的染料化合物的反应。接着，添加聚合酶聚合酶活性的条件下。标记的多核苷酸掺入标记的脱氧核苷酸聚合酶链合成过程中所形成的。在另一种酶的合成方法中，使用两个引物，而不是一个，一个的+链和其他互补的目标-链互补的引物，聚合酶是一种热稳定聚合酶，和反应温度之间循环的变性温度和延伸温度，从而成倍合成通过PCR,如Innis等，PCR方案,祀序列的标记的补充。
[0022]一般地，如果是使用化学合成的标记的寡核苷酸，它是优选的，可以使用亚磷酰胺法。的多核苷酸合成的亚磷酰胺化合物和亚磷酰胺法合成寡核苷酸的，因为高效和快速的耦合和稳定性的起始原料是优选的。附着到固体支持物与不断增长的寡核苷酸链的合成，从而使过量的试剂，这是在液相中，可以很容易地通过过滤除去，从而消除了需要纯化步骤之间的循环。
[0023]鉴于亚磷试剂标记的核苷和寡核苷酸的效用，本发明还涉及亚磷酰胺化合物，其中包括本发明的能量转移染料。
[0024]下面简要描述了一个典型的寡核苷酸的合成循环使用的亚磷酰胺法的步骤。首先，固体支持物，包括一个受保护的核苷酸单体与酸，例如，三氯乙酸，进行处理，以除去5’_羟基的保护基团，释放的羟基为随后的偶联反应。一种活化的中间体，然后由一个受保护的亚磷酰胺核苷单体和一种弱酸，如四唑，同时加入到反应形成。弱的酸质子化的氮原子形成的反应性中间体的亚磷酰胺。核苷除了在30秒内完成。接着，封盖工序进行终止核苷此外，并没有经过任何多核苷酸链。旋盖，最好是用乙酸酐和1-甲基咪唑。然后转换到更稳定的磷酸三酯的亚磷酸酯氧化，使用碘作为优选的氧化剂和水作为氧供体。氧化后，除去羟基的保护基团与质子酸，例如，三氯乙酸或二氯乙酸，并重复该循环，直到链延长完成。的多聚核苷酸链合成后，使用碱，例如，氢氧化铵或叔丁基胺从支承切割。裂解反应也消除了任何保护基团，例如，氰乙基磷酸。最后，染料的碱和羟基保护基的环外胺上的保护基的除去处理的多核苷酸的碱溶液中，在升高的温度，例如，55°C。
[0025]不限亚磷核苷单体可以是染料标记的亚磷酰胺。如果被标记的核苷酸的5’ -末端的位置，本发明的标记的非核苷酸亚磷酰胺，也可以使用在最后的缩合步骤。如果是被标记的寡核苷酸的内部位置，本发明的标记的核苷酸亚磷酰胺的过程中可以使用任何缩合步骤。
[0026]4、染料和试剂的方法
能量转移染料和本发明的试剂，可以使用各种各样的方法，用于检测样品中的一个组成部分的存在下用试剂含有染料标记样品中的成分。特别是，本发明的能量转移染料和试剂非常适合使用的方法相结合的分离和荧光检测技术，特别是需要同时检测多个在空间上重叠的分析物的方法。例如，染料和试剂特别适合于吞吐量的寡核苷酸类已经经受生化分离过程，如电泳，其中一系列的带或点的目标物质具有相似的理化性质，如大小，构象，电荷，疏水性，或类似物，是存在于直链或平面布置。如本文所用，术语“带”包括相似或相同的物理化学性质的基础上，任何空间分组或聚集的分析物。一般条带中产生的染料的寡核苷酸的结合物，通过电泳分离。
[0027]寡核苷酸可以在多种情况下出现。在一类优选的方法在本文中称为“片段分析”或“遗传分析”的方法中，标记的寡核苷酸片段生成通过模板的酶促合成使用标记的引物或核苷酸的，例如，通过连接或聚合酶的引物延伸；片段的大小依赖的分离过程中进行，例如，电泳或色谱法，分离的片段被检测分离后，例如，通过激光诱导荧光。在一个特别优选的实施方案中，分离的寡核苷酸的多个类的同时，光谱解析标签的区别在于不同的类。
[0028]一个这样的片段的分析方法，扩增片段长度多态性分布检测是根据扩增片段长度多态性，即，通过PCR扩增的限制性片段长度多态性。这些扩增片段大小不等作为连锁突变基因通过家庭。扩增片段的突变基因在染色体上的，联动的相关性越高越接近。由于许多遗传性疾病的基因还没有被确定，这些连锁服务，以帮助评估疾病风险或侍。在AmpFLPs技术的多核苷酸可以被标记使用的标记的寡核苷酸PCR引物，或者通过利用在PCR标记的三磷酸核苷。
[0029]另一个片段的分析方法是缺口翻译。切口平移涉及与标记的未标记的双链DNA分子中的核苷酸三磷酸酯的反应，以取代。未标记的DNA游离的3’-羟基内创建的“刻痕”所造成的脱氧核糖核酸酶I (DNA酶I)的治疗DNA聚合酶I催化另外的标记的核苷酸的3’ -羟基末端的缺口。在同一时间，3’-核酸外切酶活性的这种酶的5’消除的核苷酸单元的缺口从5’ -磷酰基末端。一种新的核苷酸与游离的3’ -OH基团结合的位置处的原始切除核苷酸，和家族的3’方向上由一个核苷酸单元一起被转移。此3’转变将导致新的标记的核苷酸的DNA，与现有的未标记的核苷酸的去除顺序加入。然后分析了利用分离过程，例如，电泳缺口转译的多核苷酸。
[0030]根据本发明的再一个方面，提供了一种方法用于使用一个或多个本发明的能量转移染料标记的双脱氧核苷三磷酸进行染料终止子测序。根据该方法，在脱氧核苷三磷酸的存在下，至少一种荧光标记的双脱氧核苷酸三磷酸，DNA聚合酶的核酸序列杂交的寡核苷酸引物延伸的引物的混合物所形成的。的荧光标记的双脱氧核苷酸三磷酸包括一个能量传递的本发明的荧光染料标记的双脱氧核苷三磷酸。
[0031]根据该方法，DNA聚合酶延伸的引物与脱氧核苷三磷酸，直到延伸的引物结合到荧光标记的双脱氧核苷三磷酸。终止后，延伸的引物的混合物是分开的。的核酸序列的序列，然后确定通过检测连接到延伸的引物的荧光标记的双脱氧核苷。
[0032]在此方法的另一个实施例，延伸引物形成的混合物的步骤包括与四种不同的荧光标记的双脱氧核苷三磷酸，即，一个荧光标记，三磷酸，荧光标记的二脱氧腺苷三磷酸，荧光标记的三磷酸杂交的核酸序列，荧光标记的双脱氧胸苷三磷酸。
[0033]5、结合能量转移染料的套件
本发明还涉及具有能量转移的荧光染料和/或试剂的组合的试剂盒。在一个实施例中，该套件包括根据本发明的至少两个频谱解析的能量转移染料。在此试剂盒中，能量转移染料优选包括使一个单一的光源是需要激发的染料相同的供体染料。
[0034]在另一个实施例中，该套件包括的三磷酸，二脱氧腺苷三磷酸，三磷酸，双脱氧胸苷三磷酸，每个根据本发明的能量转移染料标记的双脱氧核苷酸三磷酸。在一个实施例中，各能量转移染料从连接到其他的三磷酸双脱氧核苷酸的其他能量转移染料光谱解析。在这个套件中，能量转移染料最好包括相同的第一咕吨染料。
[0035]在又一个实施方案中，所述试剂盒包括至少两个寡核苷酸，每个寡核苷酸，包括根据本发明的能量转移染料。在一个实施例中，每个寡核苷酸包含的能量转移染料，该染料的光谱解析连接到其他的寡核苷酸的染料的能量传递。在另一个实施方案中，所述试剂盒包括至少四个均含有一组光谱解析的能量转移染料的寡核苷酸。
[0036]通过下列实施例示出的能量转移的荧光染料，它们在DNA测序。实施例，上述规定以外的进一步的目的和优点将变得显而易见。
[0037]前述说明了本发明的优选实施例的说明和描述的目的已经呈现。它的目的不是穷举或将本发明限制为所公开的精确形式。很显然，许多修改和变化将是本领域技术人员显而易见的从业者，都将落入本发明的范围内。
【主权项】
1.能量转移增强荧光染料，其特征在于，包括:能够在响应于所述第一波长发光的激发能量，受体染料能够吸收激发能量由供体染料和荧光的第二光吸收咕吨供体染料波长响应于此，和一个非的核苷连接器连接的5 -或6元环的位置供体染料的5 -或6元环的位置的受体染料。
2.根据权利要求1的方法，其中供体染料的荧光素染料的染料的能量传递。
3.根据权利要求1的方法，其中链接器具有长度小于9个原子的主链是能量转移染料。
4.根据权利要求1所述的能量转移染料，其中的官能团选自烯烃，二烯，炔烃，具有至少一个不饱和键的五元环，六元环上具有至少一个不饱和键和稠合的环结构。
5.根据权利要求1还包括一个连接基团，合适的用于将能量转移到另一种物质的染料的染料的能量传递。
6.根据权利要求5的方法,其中连接基团连接的4’-位的的4，7- dichlororhodamine受体染料的染料的能量传递。
【专利摘要】能量转移增强荧光染料，提供链接供体染料受体染料中的能量转移荧光染料的新型连接器。这些连接器便成了一个供体和受体染料中的能量转移染料之间的能量传输效率。这些连接子连接的供体到受体染料的染料中的能量转移荧光染料的一般结构R.sub.21Z.sub.1C（O）R.sub.22R.sub.28R.是一个sub.21C.sub.1-5烷基连接的供体染料，C（O）为羰基，Z.sub.1是一个取代基，该取代基可以是NH，硫或氧，R.sub.22包括链烯烃，二烯烃，炔烃，五和六元环上具有至少一个不饱和键或稠环结构，它是连接到羰基碳和R.sub.28包括附加连接器的接受器的官能团的染色。
【IPC分类】G01N21-64, C09B57-00, C09K11-06, C12Q1-68
【公开号】CN104592783
【申请号】CN201310533714
【发明人】不公告发明人
【申请人】新昌县冠阳技术开发有限公司
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2013年11月4日