专利名称：通过聚乙二醇的介导将致诱变核碱基引入植物原生质体的改进的诱变方法
技术领域：
本发明涉及通过将单链DNA寡核苷酸致诱变核碱基引入细胞而在靶细胞中的DNA 特定位点上特异性和选择性改变核苷酸序列的方法。更特别地，本发明涉及通过使用聚乙 二醇(PEG)将致诱变核碱基引入植物原生质体的定向诱变的方法。本发明进一步涉及含有 致诱变核碱基和PEG的试剂盒。本发明还涉及PEG用于增强定向诱变的用途。
背景技术：
有意地在活细胞的遗传物质中产生改变的过程具有修饰所述细胞或生物体(所 述细胞形成该生物体的一部分或能够再生形成该生物体)的一个或多个遗传编码的生物 学特征的目的。这些改变可以采取下列形式删除部分遗传物质、添加外源性遗传物质或改 变遗传物质的已有核苷酸序列。人们知道改变真核生物遗传物质的方法已经有20多年，所 述方法在植物、人和动物细胞和微生物中有广泛的应用，用于农业、人类健康、食品质量和 环境保护领域中的改进。最常见的方法由向细胞的基因组中加入外源性DNA片段组成，这 将赋予所述细胞或其生物体优于或超过已有基因所编码的性质的新性质(包括其中已有 基因的表达将因此被抑制的应用)。虽然许多这样的例子在获得所需性质中是有效的，然而 这些方法不是十分精确，因为对外源性DNA片段插入至基因组的位置没有控制(因而对最 终的表达水平没有控制)，并且因为所需的效果必须通过优于原始的和平衡良好的基因组 所编码的天然性质表现出来。相反，引起预先确定的基因组位点中的核苷酸的添加、删除或 转换的定向诱变的方法将允许精确地修饰已有的基因。另外，由于定向诱变的精确特性，可 以预料的是以此方式获得的新型植物系将更易于被消费者接受。定向诱变是一种定点诱变的方法，其基于将合成的致诱变核碱基(由以其 Watson-Crick碱基配对性质与DNA相似但在化学上可以不同于DNA的短串核苷酸样部分 (moietie)组成)递送进入真核细胞核(Alexeev 和 Yoon，Nature Biotechnol. 16 1343, 1998 ；Rice, NatureBiotechnol. 19 :321，2001 ；Kmiec, J. Clin. Invest. U2 :632，2003)。一 旦被引入细胞，这样的致诱变核碱基在靶位点上与互补序列碱基配对。通过有意地在核碱 基中设计错配，该错配可以在靶基因组序列中的相应位置上引起核苷酸转换。该方法允许 在内源性位点上转换单个核苷酸或最多几个核苷酸，但是可以应用于在已有位点上产生终 止密码子，从而引起其功能的破坏，或产生密码子改变，从而产生编码具有改变的氨基酸组 成的蛋白的基因(蛋白工程)。在植物、动物和酵母细胞中已经描述了定向诱变。两类不同的合成性致诱变核碱 基已经用于这些研究嵌合的DNA:RNA核碱基或单链核碱基。嵌合的DNA:RNA核碱基(嵌合体)是自我互补的分子，其由25bp只有DNA的区域 和25bp的互补序列(由5bp的DNA的核心区形成，所述DNA两侧是IObp的2，-0-甲基化 的RNA，其被认为可以帮助嵌合体在细胞中的稳定性)组成。5bp核心区在其中心包括工程 化的错配，其带有在基因组的靶DNA序列中要改变的核苷酸。这两个区都通过4bp的胸腺嘧啶脱氧核苷发夹连接。当引入细胞时，认为嵌合体与其靶序列形成双D-环，在嵌合体和 靶核苷酸之间形成错配。然后该错配由内源性细胞DNA修复蛋白通过转换基因组核苷酸而 解决。第一个使用嵌合体的定向诱变的例子来自于动物细胞(见Igoucheva等人2001Gene Therapy §，391-399的综述)，然后后来还用于获得植物细胞中的定向诱变(Beetham等人 1999 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 :8774_8778 ；Zhu 等人 1999 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96,8768-8773 ；Zhu 等人 2000Nature Biotech. 18，555-558 ；Kochevenko 等人 2003 Plant Phys.l巡174-184 ;0kuzaki 等人 2004 Plant Cell Rep. 22 509-512) 与人细胞不同， 产生定向诱变事件的植物细胞可以再生成完整的植物，并且突变可以转移至下一代，使其 成为重要食品作物的研究和商业化诱变的理想工具。但是，许多实验室的深层次研究显示 使用嵌合体的定向诱变频率相当低并且是可变的，或甚至不能检测到(Ruiter等人2003 PlantMol. Biol. 53, 715-729, Van der Steege 等人(2001) Nature Biotech. 19 305-306), 并且依赖于这样的因素如靶标的转录状态、细胞在细胞周期中的位置、靶标的序列和嵌合 体的质量(其是难以合成的)。由于使用本领域中已知方法的定向诱变的频率相对较低， 所以只有当基因组靶标的单个核苷酸的改变引起显性可选择性表型时，这样的事件才可以 被检查到。在植物细胞中，将特异性的点突变引入乙酰乳酸合成酶(ALS，在玉米中是AHAS) 基因的开放阅读框中，所述基因催化合成支链氨基酸亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的共同最 初步骤。在烟草中，单个核苷酸的改变足以产生密码子转换P194Q或W571L。在这些密码子 转换后产生的ALS蛋白对磺酰脲类除草剂的抑制不敏感，因此提供了选择染色体基因座上 的单个核苷酸转换的方法。由于使用用嵌合体工作的困难，人们已经寻求更可靠的可替代的寡核苷酸设 计。几个实验室已经研究了单链(ss)核碱基进行定向诱变的能力。发现它们给出更加可 重复的结果、合成更简单并且还可以包括修饰的核苷酸以改进致诱变核碱基在细胞中的 表现(Liu 等人 2002Nucl. Acids Res. 30 2742-2750 ；review, Parekh-Olmedo 等人 2005 GeneTherapy :639_646 ;Dong 等人 2006 Plant Cell R印·组457_65 ;DePi6doue 等人 2007 Oligonucleotides 21:258-263)。在Kmiec 的多个专利申请(其中有 W00173002，W003/027265, W001/87914, W099/58702, W097/48714, W002/10364)中已经描述了定向诱变。在 WO 01/73002 中考虑
到的是使用未修饰的核碱基获得的基因改变的低频率相信主要是由于其被存在于反应混 合物或靶细胞中的核酸酶所降解。为了解决这一问题，提出掺入经修饰的核苷酸以赋予所 产生的核碱基对抗核酸酶的抗性。这种经修饰的核苷酸的典型例子包括硫代磷酸酯键或 2’ -0-甲基-类似物。这些修饰优选位于核碱基的末端，留出包围定向碱基的中心未修饰 的结构域。为了支持这个观点，专利申请WO 02/26967显示某些增加核碱基细胞内寿命的 经修饰的核苷酸可以增加定向诱变在体外测试系统中也在哺乳动物染色体靶标上的效率。 不只是核酸酶抗性，ss致诱变核碱基结合至其互补靶DNA的亲和力也具有显著增加定向诱 变频率的潜力。含有经修饰的增加结合亲和力的核苷酸的ss核碱基可以更有效地在复杂 基因组中发现其互补的靶标和/或结合至其靶标更长的时间并且被调节DNA转录和复制的 蛋白除去的可能性更低。体外定向诱变分析已经用于测试许多经修饰的核苷酸以增加诱变 过程的效率。锁定的核酸(LNA)和C5-丙炔嘧啶分别具有糖部分和碱基的修饰，可以稳定 双链的形成并提高双链的熔解温度。当将这些经修饰的核苷酸掺入至ss核碱基上时，其相对于使用相同序列的未经修饰的核碱基获得的定向诱变效率增加达13倍。这一方面见本 申请人:名下的 W02007073166 和 W02007073170。本发明人已经开始通过优化用于向植物细胞中引入致诱变核碱基的方法而 增加植物细胞中定向诱变的频率。最广泛使用的转化植物细胞的方法(土壤杆菌 (Agrobacterium)介导的转化)将其诱导肿瘤(Ti)的质粒的一部分即所谓的T-DNA转移至 植物细胞中，在植物细胞中其有效地在随机的位置上整合进入植物基因组中。T-DNA两个末 端上的旁侧是与靶序列无同源性的源自Ti质粒的达22bp的“边界”序列。考虑到用于定 向诱变的ss致诱变核碱基的长度较短，边界序列将干扰这一过程。因此，只能使用化学或 物理的方法通过直接DNA转移而在植物细胞中实现定向诱变。在文献中已经报道了几个这样的直接DNA转移技术，其包括电穿孔、聚乙二醇 (PEG)处理原生质体、基因枪轰击(biolistic bombardment)植物愈伤材料和将DNA显微注 射至单个原生质体或组织中。本领域未给出转移ss核碱基以进行定向诱变的优选方法，特 别是DNA转移至植物或植物原生质体的优选方法的启示。为了尽可能高地获得植物中定向诱变的效率，在研究过程中本发明人鉴定了四个 要优化的因素。第一，优选以高转化效率引入致诱变核碱基，即，引入尽可能多的许多植物 细胞中。第二，优选地，处理对于大多数细胞不是致死的，保证尽可能多被转化的细胞也可 以在转化过程后存活(存活效率)。第三，优选地，转化方法对于经转化的植物细胞随后分 裂形成微愈伤组织是无害的(再生/植板效率)。最后优选地是可能不需要应用选择而鉴 定源自定向诱变事件的单个再生植物(鉴定效率)。大多数将DNA转化至单个植物细胞的方法使用原生质体，所述原生质体源自叶 (叶肉原生质体)或源自细胞悬浮液(见Sheen，J. (2001)Plant Phys. 127 1466-1475的 综述)。原生质体可以用于瞬时表达研究，在这种情况下可以在转化后不久评估基因的表达 或蛋白定位，或者当原生质体生长在培养基上以促进愈伤组织形成和器官发生时，原生质 体可以用于产生稳定转化的植物。以前已经报道过使用电穿孔转化植物原生质体(Fromm等人(1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 巡5824_5828 ;Nishiguchi 等人(1986)Plant CellRep. 5 57-60 ；Ou-Lee 等人(1986)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 迎6815_6819 ;Hauptmann 等人(1987)Plant Cell R印:265-270 Jones 等人(1989)Plant Mol. Biol. 13 503-511) 通常，给予最高转化 效率的场强(V/cm)引起< 50%的原生质体存活(Jones等人(1989)Plant Mol. Biol. 13 503-511)。在烟草电穿孔研究中我们发现样品中只有约10%的总烟草原生质体被表达GFP 的质粒转化，在拟南芥属(Arabidopsis)原生质体的电穿孔后也观察到这一相对的低转化 效率(Miao等人(2007)NatureProtocols丛2348_2353)。通常，对于每个植物物种必须 经验性地确定最佳的电穿孔条件，且这些条件还根据电穿孔仪器的类型和用于原生质体分 离的方法和缓冲液而变化。虽然电穿孔已经被成功地应用于许多植物物种，其仍然是有着 几个严重局限性(特别是在重现性方面)的困难技术(如http //Renetics. mgh. harvard. edu/sheenweb/faq. html中讨论的)。因此，为了增加定向诱变的TNE的总效率，电穿孔是 不太合意的。使用基因枪递送的直接基因转移在产生转基因作物植物中已经是非常成功的，并 常规地用于转基因的稳定整合。细胞悬浮液被转移至用于诱导愈伤组织的固体培养基中，通过高压气体源驱动的金颗粒轰击该材料。已经报道该转化频率低，约0. 01%的总细胞被 转化。由于低转化效率，难以评价经转化细胞的存活。相反，由于经处理的材料强烈分裂，所 以轰击后的再生效率有可能是高的。但是，因为TNE将发生在单个愈伤组织的单个细胞中， 所以，如果不选择的话这样的事件将会容易地丢失，或者，再生的植物将是定向诱变事件的 嵌合体。因此，对于在非选择性位点上进行定向诱变，轰击是不现实的。相反，使用原生质 体找回定向诱变事件是可能的，因为每个微愈伤组织源自单个原生质体。在ALS上通过嵌合体诱导的单个核苷酸转换已经证明定向诱变可以在烟草、玉米 和水稻细胞中被检测到。轰击已经被用于烟草(Beetham等人1999 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 8774-8778 ；Kochevenko 等人 2003Plant Phys. 132 174-184)，玉米(Zhu 等人 1999 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96,8768-8773)和水稻(Okuzaki 等人2004 Plant Cell Rep. 22 509-512)。Beetham等人(1999)报道与背景突变率相比(假定是10_7至10_8)，直接转移嵌 合体后的除草剂抗性的频率增加20倍。Kochevenko等人也使用电穿孔以在烟草叶肉原生 质体中进行定向诱变实验。与Beetham等人获得的频率相比，本发明人能够以0.0001%的 频率获得除草剂抗性的烟草愈伤组织。这显示当用相同的植物物种和在这一情况下相同的 靶核苷酸处理时，直接DNA递送方法对定向诱变效率没有大的影响，效率仍然维持在不理 想的低水平上。但是Ruiter等人(2003Plant Mol. Biol. 53, 715-729)在烟草和油菜含油 种子中进行了轰击和电穿孔实验，不能检测到嵌合体的任何作用。已经报道对玉米和水稻愈伤组织的轰击的效率是被转化的细胞的0. 01 % (Zhu 等人(1999)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96,8768-8773 ；Okuzaki 等人(2004 (Plant Cell Rep. 22 509-512)。但是，这只在可选择性位点是可行的。PEG介导的原生质体转化本身从1985年已经为人所知。第一个用于原生质体转 化的方法使用了 PEG(Krens 等人(1982)Nature 296 :72_74 ；Potyrykus 等人(1985)Plant Mol. Biol. R印:117-128 ;Negrutiu 等人(1987)Plant Mol. Biol. 8 363-373) 该技术 可用于来自许多不同植物的原生质体(Rasmussen等人(1993)Plant Sci.巡199-207)。 PEG被认为在二价阳离子存在时通过将DNA沉淀在原生质体的表面上(然后DNA在其中被 沉淀)而刺激转化(Maas & Werr (1989)Plant Cell Rep. 8 148-151) PEG 转化是转化拟 南芥属原生质体的选择方法(http //genetics, mgh. harvard, edu/sheenweb/faq. html) (Mathur 等人 Methods in molecular biology, vol. 82，267-276)，符合有效 TNE 的转化方 法所限定的四个要求。当用PEG处理烟草原生质体时，在所有被检查的细胞中可以检测到 生物素标记的ss寡核苷酸。通过使用二乙酸荧光素活体染色评估的PEG处理后的存活率 是>90%。不是所有的原生质体都保留了分裂和形成微愈伤组织的能力。在非处理的烟草 原生质体的典型分离体中，大约25%形成微愈伤组织。PEG处理确实对再生效率有轻微的 影响，再生效率下降约10%，但是与其它转化方法相比，这并不是显著的。以上描述的现有 技术中没有一个考虑到使用PEG转化用于定点诱变特别是TNE。本发明人已经开始改进直接DNA转移的方法以在植物细胞中获得有效的定向诱 变。本发明人发现从本文其它地方所述的转化技术中，PEG原生质体转化相对于电穿孔和 基因枪显著地增加了总的定向诱变的效率。这是令人惊讶的，因为至今用于植物中定向诱 变的技术似乎倾向于具有低效率的电穿孔。另外，技术中的大多数改进旨在改进致诱变核 碱基，而不是将致诱变核碱基递送至基因组靶DNA的递送系统。
为了比较，本发明人使用了 ss致诱变核碱基，其被设计为在ALS基因座上产生 P194Q转换，从而引起除草剂抗性。使用PEG介导的转化或电穿孔将相同的ss致诱变核碱 基引入烟草叶肉原生质体中，使用相同的选择条件选择除草剂抗性细胞。因此，本发明人发 现与已知的转化方法相比，PEG介导的植物细胞转化是在植物细胞中进行定向诱变的最有 效的方法。
发明内容
在一个方面，本发明涉及在植物细胞原生质体中定向改变双链受体DNA序列的方 法，其包括将双链受体DNA序列与ss致诱变核碱基结合，其中双链受体DNA序列含有第一 DNA序列和与第一 DNA序列互补的第二 DNA序列，其中供体ss致诱变核碱基相对于要改变 的双链受体DNA序列，优选相对于第一 DNA序列包含至少一个错配，其中所述方法进一步包 括使用聚乙二醇(PEG)介导的转化将ss致诱变核碱基引入细胞原生质体的步骤。使用基于PEG转化技术将ss致诱变核碱基与待转化植物的原生质体接触。PEG介 导的转化技术本身是广为人知的和必需的，可以不背离本发明的精髓而由技术人员做出对 特定规程的小的修改。用于本发明的ss致诱变核碱基的长度与用于定向诱变的其它(嵌合体)ss致诱 变核碱基相一致，即通常为10-60个核苷酸，优选为20-55个核苷酸，更优选为25-50个核 苷酸。在本发明的一些具体实施方式
中，本发明中使用的ss致诱变核碱基可以被修饰，例 如通过申请人的W02007073166和W02007073170所述的LNA和/或丙炔修饰。因此，在某 些具体实施方式
中，ss致诱变核碱基含有位于距离定向错配的位置的至少一个LNA，优选 为位于距离错配至少一个核苷酸的两个LNA。另外，这些LNA与ss致诱变核碱基的5’和/ 或3’末端距离至少3、4或5个核苷酸。在一些具体实施方式
中，ss致诱变核碱基可以含 有一个或更多丙炔置换，基本上如W02007073166和W02007073170中所述。在一些具体实 施方式中，可以将供体ss致诱变核碱基偶联至蛋白如核定位信号上。在这一具体实施方式
中，将本发明中使用的寡核苷酸通过常规(连接子)技术偶联至核定位信号上，例如已知的 SV40大T抗原的(NLS)肽、GATA转录因子11、DNA修复解螺旋酶XBP1、光介导的蛋白DET1、 ERF转录因子、PR-相关的转录激活子PTI6和核卷曲蛋白(nuclear coiled protein)，基 本上如同一申请人的申请PCT/NL2007/000279所述。寡核苷酸核定位信号偶联物可以用于 本文所述的基于PEG的转化方法。本发明的方法产生的改变是删除、置换或插入至少一个核苷酸。优选地，改变是置 换。可以在一个寡核苷酸中改变更多的核苷酸，但是可以预料到效率将下降，因此改变一个 核苷酸是优选的。靶DNA (或双链受体DNA)可以来自任何来源，但是优选靶DNA来自植物。优选靶 DNA来自基因组DNA、线性DNA、人工染色体、核染色体DNA、细胞器染色体DNA、游离型DNA。根据本发明的方法可以用于改变细胞、通过恢复至野生型而改正突变、诱导突变、 通过打乱编码区而使酶失活、通过改变编码区而修饰酶的生物活性、通过打乱编码区而修 饰蛋白。在一个方面，本发明涉及PEG介导的转化在增加植物原生质体中定向诱变效率中 的用途。
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不被理论所束缚，认为使用PEG介导的转化将DNA沉淀在原生质体的细胞膜上。经 沉淀的DNA被细胞膜封装并以隔离的形式引入原生质体中。在正常细胞周期的过程中，原 生质体在通过去除细胞壁而形成之后，直接开始其正常细胞壁的再生过程。细胞分裂通常 开始较晚(从几个小时至几天)。定向核苷酸交换通常在细胞分裂过程中通过细胞的修复 机制发生。在将供体DNA引入原生质体和细胞分裂开始之间的时间内，供体DNA倾向于受 到细胞防御机制如核酸外切酶的攻击，有可能退化，因此变得对于TNE无效。通过使用PEG 介导的转化技术，供体DNA通过内吞作用而被封装，并且以这一方式至少暂时地隔离于核 酸外切酶的退化作用。当DNA从其封装的形式中释放出来时，其具有增加的机会存在于细 胞分裂的时刻或大约在这一时刻前后，在这一期间DNA(即ss致诱变核碱基)能够找到受 体细胞DNA中的其互补物并以通常的定向诱变机制交换核苷酸。实施例#用 PEG原牛质体的分离在25°C和 60-70% RH，在 16/8h 20001ux 光周期下，烟草(Nicotianatabacum) cv Petit Havana系SRl的体外芽培养物保持在高玻璃瓶中的含有0. 8% Difco琼脂的MS20 培养基中。MS20培养基是基本Murashige和Skoog氏培养基(Murashige,T.和Skoog，F.， Physiologia Plantarum，！^ :473_497，1962)，其含有 2% (w/v)蔗糖，不添加激素和 0. 8% Difco琼脂。收集完全展开的3-6周龄的芽培养物的叶。将叶切成Imm厚的条，然后将其转 移至含有45ml MDE基本培养基的大(lOOmmxlOOmm)皮氏培养皿中进行预质壁分离处理30 分钟。MDE 基本培养基含有 0. 25g KCl, l.Og MgSO4. 7H20,0. 136g KH2PO4, 2. 5g 聚乙烯吡咯 酮(MW10，000)，6mg萘乙酸和2mg 6-苄氨基嘌呤，总体积为900ml。将溶液的重量克分子渗 透压浓度(osmolality)用山梨糖醇调整至600m0sm. kg—SpH为5. 7。然后加入5mL的酶储 存液SRl。每IOOml酶储存液由750mg纤维素酶Onozuka R10，500mg崩解酶(driselase) 和250mg离析酶(macerozyme) RlO组成，经Whatman纸过滤并过滤除菌。在黑暗中25°C进 行消化过夜。经消化的叶通过50 μ m尼龙滤网过滤进入无菌烧杯中。等体积的冷KCl洗涤 培养基用于洗涤滤网并与原生质体悬浮液合并。KCl洗涤培养基由每升2. Og CaCl2. 2H20 和使重量克分子渗透压浓度为540m0sm. kg—1的足够量的KCl组成。将悬浮液转移至IOml 管中，在85x g 4°C沉淀原生质体10分钟。弃去悬浮液，将原生质体沉淀小心地重悬于 5mL冷的MLm洗涤培养基中，其是一半正常浓度的MS培养基(Murashige，Τ.和Skoog，F.， PhysiologiaPlantarum, 15 :473_497，1962)的主要营养素、每升 2. 2g CaCl2. 2H20和使重量 克分子渗透压浓度为S^mOsmAg-1的量的甘露醇。将2管的内含物合并，在85x g 4°C离 心10分钟。弃去上清液，将原生质体沉淀小心地重悬于5mL冷的MLs洗涤培养基(其是蔗 糖代替甘露醇的MLm培养基)中。将2管的内含物合并，小心取出加在蔗糖溶液上的ImL KCl洗涤培养基，不扰动下 层相。在85x g 4°C离心原生质体10分钟。小心收集在蔗糖和KCL溶液之间含有活的原生 质体的中间相。加入等体积的KCl洗涤培养基并小心地混合。用血细胞计数器测定原生质 体的密度。PEG 转化在5°C 85x g离心原生质体悬浮液10分钟。弃去上清液，将原生质体沉淀重悬于KCl洗涤培养基至终浓度IO6. IIir10在IOmL的管中，将250 μ L原生质体悬浮液，1. 6nmole 的ss致诱变核碱基和250 μ 1 PEG溶液轻柔地但充分地混合。20分钟后，在室温孵育， 逐滴加入5mL冷的0. 275M Ca(NO3)2。在4°C 85xg离心原生质体悬浮液10分钟。弃去悬 浮液，将原生质体沉淀小心地重悬于1. 25mL T0培养基，其补充了 50 μ g. mL—1头孢噻肟和 SOyg.mL-1万古霉素。ss致诱变核碱基的培养基含有(每升，pH5. 7)950mg KN03，825mg NH4NO3, 220mgCaCl2. 2H20, 185mg MgSO4. 7H20, 85mg KH2PO4, 27. 85mgFeS04. 7H20, 37. 25mg Na2EDTA. 2H20，根据 Heller 氏培养基(Heller, R.，Ann Sci Nat Bot Biol Veg U-.1-223, 1953)的微量营养素，根据 Morel 和 Wetmore 氏培养基(Morel，G.和 R. H. Wetmore，Amer. J. Bot. 38 138-40,1951)的维生素，2% (w/v)蔗糖，3mg萘乙酸，Img 6-苄氨基嘌呤和使重 量克分子渗透压浓度为540m0sm. kg—1的量的甘露醇。将悬浮液转移至35mm的皮氏培养皿 中。加入等体积的Ttl琼脂糖培养基并轻柔混合。将样品在25°C黑暗中孵育并按照如下所 述进一步培养。电穿孔在5°C 85x g离心原生质体10分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于冰冷的电穿孔缓 冲液(由 IOmM HEPES,80mM NaCl, 0. 04mM CaCl2,0. 4M 甘露醇组成，pH 5. 7，用甘露醇调节 至SAOmOsm.Kg—1，终浓度为IO6Hir1)中。在整个过程中原生质体保持在冰上。向0.4cm宽的 电穿孔杯中加入4. 5nmole的ss致诱变核碱基和700 μ L原生质体悬浮液。根据下列参数 使用装有PC和CE模块的Biorad GenePulser XCell电穿孔系统向细胞悬浮液递送单指数 式衰竭脉冲场强500V. cm-1电容 950 μ F在这些条件下，样品的电阻约是30ohm，得到的时间常数约是30ms。这些参数被选 作电穿孔后24小时在烟草原生质体中给出最高水平的GFP瞬时表达的参数。脉冲发生后， 使原生质体在室温的杯中恢复30分钟。然后使原生质体在ImL Ttl培养基中恢复并转移至 IOmL的管中。用另外5mL Ttl培养基洗涤该杯，然后与原生质体悬浮液合并。在充分地但轻 柔地混合后，加入50 μ g. πιΓ1头孢噻肟和50 μ g. ml/1万古霉素，将1. 25mL的原生质体悬浮 液转移至35mm皮氏培养皿上。加入等体积的Ttl琼脂糖培养基，将混合物轻柔勻质化。在 25°C黑暗中孵育样品，按照如下所述进一步培养。原生质体的培养培养10天后，将琼脂糖板切成6等份，转移至含有补充了 20nM氯磺隆的22. 5mL MAP1A0培养基的皮氏培养皿中。该培养基由下列成分组成(每升，pH5.7) :950mg KNO3, 825mg NH4NO3, 220mgCaCl2. 2H20,185mg MgSO4. 7H20,85mg KH2PO4, 27. 85mgFeS04. 7H20, 37. 25mg Na2EDTA. 2H20，根据 Murashige 和 Skoog 氏培养基(Murashige, Τ.和 Skoog, F.， Physiologia Plantarum, 15 =473-497,1962)的十分之一原始浓度的微量营养素，根据 Morel 和 Wetmore 氏培养基(Morel，G.和 R. H. Wetmore, Amer. J. Bot. 38 138-40,1951)的 维生素，6mg丙酮酸盐，苹果酸、富马酸和柠檬酸每种12mg，3% (w/v)蔗糖，6% (w/v)甘露 醇，0.03mg萘乙酸和0. Img 6-苄氨基嘌呤。在25°C低光中孵育样品6_8周。将生长的愈 伤组织转移至MAPI培养基中并使其生长另外2-3周。MAPI培养基具有与MAP1AO培养基相 同的组成，但是以3% (w/v)的甘露醇代替6%的甘露醇，以及含有46. 2mg. Γ1组氨酸(pH5.7)。其用0.8% (w/v)DifC0琼脂固化。然后使用无菌镊子将愈伤组织转移至RP培养 基中。RP 培养基由下列成分组成(每升，pH5. 7) :273mg KN03，416mg Ca(NO3)2· 4H20，392mg Mg (NO3) 2· 6H20, 57mgMgS04. 7H20, 233mg (NH4) 2S04, 271mg KH2PO4, 27. 85mgFeS04. 7H20, 37. 25mg Na2EDTA. 2H20，根据Murashige和Skoog氏培养基的五分之一公布浓度的微量营养素，根据 Morel 和 Wetmore 氏培养基(Morel,G.禾口 R. H. Wetmore，Amer. J. Bot. 38 138-40,1951)的维 生素，0.05% (w/v)蔗糖，1.8% (w/v)甘露醇，0. 25mg玉米素和41nM氯磺隆，用0.8% (w/ ν)Difco琼脂固化。2-3周后将成熟的芽转移至生根培养基中。Ss致诱变核碱基所有的ss致诱变核碱基由Eurogentec (Seraing，Belgium)合成，通过反相HPLC 纯化，重悬于无菌的milliQ水中。使用前，将ss致诱变核碱基加热至95°C 5分钟。ss致 诱变核碱基06Q262设计为在烟草ALS基因(登录号X07644)中密码子位置P194上引入 单个错配(有下划线的核苷酸)，这将引起CCA至CAA(P194Q)的转换。06Q261 ss致诱变 核碱基与烟草ALS基因序列完全匹配，作为阴性对照。06Q263SS致诱变核碱基由40个核苷 酸的随机组合组成，作为阴性对照。06Q261 5’ TCAGTACCTATCATCCTACGTTGCACTTGACCTGTTATAG[SEQ ID 1]06Q262 5’ TCAGTACCTATCATCCTACGTTGCACTTGACCTGTTATAG[SEQ ID 2]06Q263 5 ‘ ATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCG[SEQ ID 3]每个处理的原生质体存活率转化后24小时，使用荧光活体染料二乙酸荧光素(fluoresceindiacetate，FDA) 通过酯酶活性评估PEG转化和电穿孔后原生质体的存活率。将2 μ L的丙酮中的5mg. mL—1 储存液FDA加入ImL经转化的原生质体中。将整个群体中发荧光的原生质体的部分用血细 胞计数器计数。用装有 GFP LP (EX480/40, DM505, BA510)过滤装置的 NikonEclipse E600 直立落射荧光显微镜(印ifluorescence microscope)进行观察。由IOOW高压汞灯提供激 发。使用连接至DS-Ul控制器(连接至运行NIS Element图像获取/分析软件的PC)的 DS-2MBffc C⑶照相机获取图像。MM使用PEG转化和电穿孔的转化结果的总结显示于表1中。使用PEG转化的原生质 体存活率显著高于电穿孔。电穿孔本身的性质比PEG转化对于原生质体的存活更有害，引 起高得多的恢复/存活比例以及较高的定向诱变效率。在氯磺隆存在的情况下孵育原生质 体后对定向诱变效率评分。
表1 关于原生质体存活率的PEG转化和电穿孔的比较*表达为FDA染色后在恢复的原生质体群体中发荧光的原生质体的百分比。结果是3个独立重复的平均值士 SD。PCR扩增ALS和测序使用DNeasy试剂盒(Qiagen)从氯磺隆抗性的烟草微群落中分离DNA，并 用作PCR反应的模板。使用扩增该基因的776bp片段(包括密码子194)的引物 5，GGTCAAGTGCCACGTAGGAT [SEQ ID 4]禾Π 5，GGGTGCTTCACTTTCTGCTC [SEQ ID 5]检测烟草 ALS基因中定向密码子的转换。通过将PCR产物克隆进入pCR2. 1 TOPO (Invitrogen)并对 单个质粒进行测序证实除草剂抗性烟草愈伤组织中的核苷酸转换。烟草含有ALS的2个等 位基因(SurASurB)。在任何这些位点的P194密码子上的核苷酸转换足以赋予对氯磺隆 的抗性。由于烟草是异源四倍体物种，在烟草中有8个可以发生TNE的可能靶标。据此，需 要对> 10个含有PCR产物的质粒克隆进行测序以检测到一个具有CCA至CAA的转换。这 提示在每个抗性愈伤组织中8个ALS等位基因中只有一个进行了定向诱变介导的核苷酸转 换。对于所有在本研究中产生的愈伤组织，我们均观察到预期的CCA至CAA的核苷酸转换。
权利要求
一种在植物细胞原生质体中定向改变双链受体DNA序列的方法，其包括将双链受体DNA序列与供体致诱变核碱基结合，其中双链受体DNA序列含有第一DNA序列和与第一DNA序列互补的第二DNA序列，其中供体致诱变核碱基相对于要改变的双链受体DNA序列，优选相对于第一DNA序列包含至少一个错配，其中该方法进一步包括使用聚乙二醇(PEG)介导的转化将致诱变核碱基引入细胞原生质体中的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中致诱变核碱基是ss致诱变核碱基。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中致诱变核碱基含有与定向错配距离至少一个 核苷酸的，可选地，与致诱变核碱基的5’和3’末端距离至少3、4或5个核苷酸的LNA置换。
4.根据权利要求1-3所述的方法，其中致诱变核碱基含有丙炔置换。
5.根据任意前述权利要求所述的方法，其中受体DNA来自基因组DNA、线性DNA、哺乳动 物人工染色体、细菌人工染色体、酵母人工染色体、植物人工染色体、核染色体DNA、细胞器 染色体DNA、游离型DNA。
6.根据任意前述权利要求所述的方法，其用于改变细胞、通过恢复至野生型改正突变、 诱导突变、通过打乱编码区而使酶失活、通过改变编码区而修饰酶的生物活性、通过打乱编 码区而修饰蛋白。
7.PEG介导的转化用于增加植物原生质体中定向诱变效率的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其中与基于电穿孔的转化相比增加为至少10倍。
9.根据权利要求7或8所述的用途，其中致诱变核碱基是ss致诱变核碱基。
10.根据权利要求7-9所述的用途，其中致诱变核碱基含有与定向错配距离至少一个 核苷酸的，可选地，与寡核苷酸的5’和3’末端距离至少3、4或5个核苷酸的LNA置换。
11.根据权利要求7-10所述的用途，其中致诱变核碱基含有丙炔置换。
12.根据任意前述权利要求所述的用途，其中受体DNA来自基因组DNA、线性DNA、哺乳 动物人工染色体、细菌人工染色体、酵母人工染色体、植物人工染色体、核染色体DNA、细胞 器染色体DNA、游离型DNA。
13.根据任意前述权利要求所述的用途，用于改变细胞、通过恢复至野生型改正突变、 诱导突变、通过打乱编码区而使酶失活、通过改变编码区而修饰酶的生物活性、通过打乱编 码区而修饰蛋白。
全文摘要
在植物细胞原生质体中定向改变双链受体DNA序列的方法，其包括将双链受体DNA序列与供体致诱变核碱基结合，其中双链受体DNA序列含有第一DNA序列和与第一DNA序列互补的第二DNA序列，其中供体致诱变核碱基相对于要改变的双链受体DNA序列，优选相对于第一DNA序列包含至少一个错配，其中该方法进一步包括使用聚乙二醇(PEG)介导的转化将供体致诱变核碱基引入细胞原生质体中的步骤以及使用PEG原生质体转化以增加定向诱变率。
文档编号C12N15/82GK101883855SQ200780101787
公开日2010年11月10日 申请日期2007年12月21日 优先权日2007年12月21日
发明者F·吕西耶, M·T·J·德博特, P·邦道克 申请人:凯津公司