专利名称：：L-核糖-lna类似物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及L-核糖-构型双环状核苷类似物领域，以及用于合成寡核苷酸形成的核苷酸类似物的合成，该合成寡核苷酸可形成具有互补单链与双链核酸的核碱基特定性双显性组合(duplexes)。本发明还涉及可用来作为治疗药物并可结合于寡核苷酸的L-核糖-构型双环状核苷类似物的领域。
背景技术：
：合成寡核苷酸是在不同领域广泛使用的化合物，例如用于分子生物及以DNA为基础的诊断和治疗。综合考虑为了广泛地用于不同的应用范围，寡核苷酸必须满足许多不同的要求。以作为治疗剂为例，有用的寡核苷酸必须能够穿过细胞膜，具有良好的抗细胞外及细胞内核酸酶的性能，优选具有补充如RNAseH的内源酶的能力。在以DNA为基础的治疗及分子生物学中，其它性能，例如寡核苷酸对于作用在天然核酸的大量不同酶成长作为有效基质的能力很重要，该天然核酸如聚合酶、激酶、连接酶和磷酸酶。然而，各种用途的基础是寡核苷酸的基本性能寡核苷酸可辨识和杂交互补单链核酸的特异性序列，采用Watson-Crick氢键(A-TandG-C)或其它氢键结构如Hoogsteen模式。有两个重要术语即亲和力和特异性，常用于表现寡核苷酸的杂交性能。亲合性为该寡核苷酸对其互补目标序列的键合强度的测量(用该双显性组合的热稳定性(Tm)表示)。该双显性组合中各核碱基对增加热稳定性，因此亲合性随该寡核苷酸尺寸(核碱基)增大而增加。特异性为该寡核苷酸在完全互补和错配目标序列之间的辨别能力的测量。换言之，特异性为目标物中与错配核碱基有关的亲合性损失的测量。在寡核苷酸尺寸恒定时，特异性随着该寡核苷酸及其目标物之间的错配数目增加而增加(亦即，错配的百分比增加)。反之，在错配数目恒定时，当寡核苷酸尺寸增加时，特异性会减少(即错配的百分比减少)。换言之，寡核苷酸亲合性的增加是以牺牲其特异性为代价的，反之亦然。—般而言，考虑到天然寡核苷酸的缺点，增强特异性及亲合性的新方法对于以DNA为基础的治疗、诊断及对于分子生物技术极为令人期待。受构型限制的核苷已知寡核苷酸在杂交成为目标序列期间会经过构型转化，由单链态的相对任意线圈结构变成双显性组合态的规则结构。因此，构型限制近年来已应用在寡核苷酸，以寻找较未改性(2’_脱氧)寡核苷酸显示改良的杂交性能。例如具有附加的C-3’、C-5’-桥亚乙基的双环[3.3.0]核昔(M.Tarkoy3M.Bolli,B.SchweizerandC.Leumann,Helv.Chem.Acta,1993,76,481；TarkdyandC.Leumann,Angew.Chem.,Int.Ed.Engl.,1993,32,1432；M.Egli,P.Lubini,Μ.DoblerandC.Leumann,J.Am.Chem.Soc.,1993115,5855；M.Tark5y,M.BolliandC.Leumann,Helv.Chem.Acta,1994,77,716；M.BolliandC.Leumann,Angew.Chem.,Int.Ed.Engl.,1995,34,694；M.Bolli,P.LubiniandC.Leumann,Helv.Chem.Acta,1995,78,2077；J.C.Litten,C.EppleandC.Leumann,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1995,5,1231；J.C.Litten,C.Leumann,Helv.Chem.Acta,1996,79,1129；M.Bolli,J.C.Litten,R.SchiiltzandC.Leumann,Chem.Biol.,1996,3,197；M.Bolli,H.U.TrafeletandC.Leumann,NucleicAcids彻8.，1996，24，4660)、具有一附加(-1，、(-6，或C_6，、C_4，-桥亚甲基的双碳环[3.1.0]核苷(K.-H.Altmann,R.Kesselring,Ε.FrancotteandG.Rihs,TetrahedrnLett.,1994,35,2331；K.-H.Altmann,R.Imwinkelried,R.KesselringandG.Rihs,TetrahedronLett.,1994,35,7635；V.Ε..Marquez,Μ.A.Siddiqui,Α.Ezzitouni,P.Russ,J.Wang,R.W.WagnerandM.D.Matteucci,J.Med.Chem.,1996,39,3739；A.EzzitouniandV.E.Marquez,J.Chem.Soc.，PerkinTrans.1，1997，1073)、含有一与一未经改性核苷合成为二聚物的附加C-2’、C-3’-二氧戊环的双环状[3.3.0]-和[4.3.0]核苷，其中该附加环为核苷间键替代天然磷酸二酯键的部份(R.J.Jones,S.Swaminathan,J.F.Millagan,S.Wadwani,B.S.FroehlerandΜ.Matteucci,J.Am.Chem.Soc.,1993,115,9816；J.WangandM.D.Matteucci，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1997，7，229)、包含一具有C_2，、C_3，-桥亚甲基作为酰胺及磺酰胺型核苷间键部份的二聚物(C.G.Yannopoulus,W.Q.Zhou,P.Nower,D.Peoch,Y.S.SanghviandG.Just,Synlett，1997，378)、双环状[3.3.0]葡萄糖衍生的核苷类似物透过甲醛核苷间键加入三聚物中间(C.G.Yannopoulus,W.Q.Zhou，P.Nower,D.Peoch,Y.S.SanghviandG.Just,Synlett,1997，378)，具有C_2，、C-3，连接六元环和五元环的双环状[4.3.0]-与[3.3.0]核苷(P.Nielsen,H.Μ.Pfundheller,J.Wenge1,Chem.Commun.,1997,826；P.Nielsen,H.Μ·Pfundheller,Jffengel,XIIInternationalRoundtable!Nucleosides,NucleotidesandTheirBiologicalApplication；LaJolla,California,September15-19,1996；PosterPPI43)已合成并结合到寡脱氧核苷酸中。在所发现的适度改善双显性组合稳定性的情形中，仅涉及DNA或RNA目标物，或关于完全改性而非部分改性的寡核苷酸，反之亦然。已经报告的大部分类似物的评估，由于缺乏含G、A及C核碱基类似物的数据，以及缺乏指示杂交特异性及杂交模式数据，因而益发复杂。在许多情形中，已经报告单体类似物的合成极为复杂，而在另外一些情况下，完全改性寡核苷酸的合成与广为人使用的标准phosphoramidite化学不兼容。近来，已报导含锁定核酸(LNA)的寡聚物(Nielsen,P.，Pfundheller,H.M.，Olsen,C.E.andWenge1.J.,J.Chem.Soc.,PerkinTrans.1,1997,3423；Nielsen,P.,Pfundheller,H.Μ.,Wenge1,J.,Chem.Commun.,1997,9,825；Christensen,N.K.,Petersen,Μ.,Nielsen,P.,Jacobsen,J.P.andffengel,J.,J.Am.Chem.Soc.,1998,120,5458；Koshkin,A.A.andffengel,J.，J.Org.Chem.，1998,63,2778；Obika,S.，Morio.K.-I.，Han,Y.andImanishi,Τ.，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1999，515)。令人感兴趣的是，含有2’-0,4'-C-桥亚甲基LNA单体结合到寡核苷酸序列导致该改性寡核苷酸杂交能力前所未有的改善(Singh,S.K.,Nielsen,P.,Koshkin,Α.Α.,Olsen,C.Ε.andffengel,J.,Chem.Commun.,1998,455；Koshkin,Α.K.,Singh,S.K.,Nielsen,P.,Rajwanshi,V.K.,Kumar,R.,Meldgaard,Μ.,Olsen,C.Ε.,andWenge1,J.,Tetrahedron,1998,54,3607；Koshkin,A.A.Rajwanshi,V.K.,andWengel,J.,TetrahedronLett.,1998,39,4381；Singh,SanjayK.andWenge1,J.,Chem.Commun.,1998,1247；Kumar,R.,Singh,S.K.,Koshkin,A.A.Rajwanshi,V.K.,Meldgaard,Μ.,andWenge1,J.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219；Obika,S.etal.TetrahedronLett.,1997,38,8735；Obika,S.etal.TetrahedronLett.，1998，39，5401；Singh,S.K.,Kumar,R.,andffengel,J.，J.Org.Chem.，1998，63，6078；Koshkin,Α.A.,Nielsen,P.,Meldgaard,Μ.,Rajwanski,V.K.,Singh,S.K.andWengel,J.,J.Am.Chem.Soc.,1998,120,13252；Singh,S.K.,Kumar,R.,andWenge1,J.,J.Org.Chem.,1998，63，10035)。包含这种LNA单体的寡核苷酸和对应的2，-硫-LNA类似物与互补的DNA和RNA形成具有热稳定性且以前未曾发现的双-或三环状核苷改性寡核苷酸(△Tm/改性=+3至+irC)的双显性组合，并表现改善的选择性。在一系列论文中，Seela等人已研究包括单一或多个2’-脱氧-β-D-木糖呋喃糖基核苷酸单体(Rosemeyer，H.；Seela,F.Helv.Chem.Acta1991,74,748；Rosemeyer,H.；Krecmerova,M.；Seela,F.Helv.Chem.Acta1991,742054；Seela,F.；Worrier,Rosemeyer,H.Helv.Chem.Acta1994,77,883；Seela,F.；Heckel,Μ.；Rosemeyer,H.Helv.Chem.Acta1996,79,1451；Rosemeyer,H.；Seela,F.NucleosidesNucleotides,1995,14,1041；Schoeppe,Α.；Hinz,H.-J.；Rosemeyer,H.；Seela,F.Eur.J.Biochem.1996,239,33)的木-DNA(图1，碱基=腺嘌呤-9-基、胞嘧啶-1-基、鸟嘌呤-9-基或胸腺嘧啶-1-基)。与对应的天然2’-脱氧-β-D核糖呋喃糖基相比，一般而言，木-DNA表现出如同镜像的二级结构，此为在熵方面有利的双显性组合结构，对于外切核酸酶有增加的稳定性，对于包含少量2’-脱氧-β-D-木糖呋喃糖基单体的寡核苷酸，对互补DNA有减少的热亲合性(Rosemeyer,H.；Seela,F.Helv.Chem.Acta1991,74,2054；Seela,F.；Worner,Rosemeyer,H.Helv.Chem.Acta1994,77,883；Seela,F.；Heckel,M.；Rosemeyer,H.Helv.Chem.Acta1996，79，1451)。
发明内容基于上述及2’-0,4'-C-亚甲基桥连的LNA单体卓越的性能，决定合成包含单一或多个2’_0，4’-C-亚甲基-a-L-核糖呋喃糖基核苷酸单体。α-L-核糖-LNA计算机模式同样地指出呋喃糖环的S型构型。故而，这项工作的目的在于合成2’-0,4'-C-亚甲基-a-L-核糖呋喃糖基核苷酸单体以及研究含此单体的寡核苷酸的热稳定性。结果显示，改性的L-核糖-LNA有助于互补核酸的高亲合性靶标。当虑及在C-3’和C-4’转化的立体化学性质时，这是一个令人惊讶的事实。因此，本发明人提供了新型的LNA核苷类似物(L-核糖-LNA)及其中包含具有L-核糖-LNA核苷类似物的寡核苷酸。利用胸腺嘧啶作为核碱基合成该新型L-核糖-LNA核苷类似物，但可以利用其它四个核碱基轻易合成，因此，提供了用于结合寡核苷酸的全组核苷类似物。本发明涉及包含至少一种如通式I的核苷类似物(后文称为”L-核糖-LNA”)的寡聚物权利要求1.一种寡聚物，含有至少一种通式Ia的核苷类似物，其中X选自-0-;B为核碱基，选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黄嘌呤、二胺基曙呤、8-氧基-N6-甲基腺嘌呤、7-脱氮黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N4,N4-乙醇胞嘧啶、N6，N6-乙醇-2，6-二胺基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、拟异-胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤或肌苷；P表示与后一单体连接的核苷间键的自由基位置、或5’-端基；P*表示与前一单体连接的核苷间键的自由基位置、或3’-端基；R2*与R4*—起表示-O-CH2-的双自由基，在此取代基R1*、R2>R3*、R5>R5*分别为氢；和其碱性盐类和酸加成盐类。2.如权利要求1所述的寡聚物，包括1至9个通式Ia的核苷类似物及0至13个选自天然产生的核苷。3.如权利要求2所述的寡聚物，其中该寡核苷酸包括至少7个连续所述核苷类似物单体。4.如权利要求2所述的寡聚物，其中该寡聚物的所有核苷单体为所述核苷类似物。5.如权利要求1所述的寡聚物，其中所述核苷类似物的任一核苷间键选自由2至4个选自-CH2-、-0-、-P0(R”)-、和-PO(NHRh)-的基团/原子组成的键，其中Rh选自氢或C1^-烧基，R”选自Ci-6~焼基。6.如权利要求1所述的寡聚物，其中P为选自氢、羟基、Cp6-烷基、CV6-烷氧基、或芳氧基的5’-端基。7.如权利要求1所述的寡聚物，其中P*为选自氢、羟基或芳氧基的3’-端基。8.如权利要求1所述的寡聚物，其中B为核碱基，选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞啼唆、5-甲基胞嘧啶或尿嘧啶。9.如权利要求1所述的寡聚物，具有下式IIIG-[Nu-L]n(0)-{[(L-核糖-LNA)-L]m(q)-[Nu_L]n(q)}q-G*111其中q为1至50;各n(0)，···，n(q)分别为0至10000；各m(l)，···，m(q)分别为1至10000；条件为n(0)，...，n(q)及m(l)，···，m(q)的总和为2至15000；G表示5’-端基；各Nu分别表示选自天然核苷的核苷；各L分别表示介于选自Nu或L-核糖-LNA两基团之间的核苷间键，或L与(T表示3’-端基；且各L-核糖-LNA-L分别表示该通式Ia的L-核糖-LNA核苷。10.一种含有至少一种通式IIa的核苷类似物的核苷，11.如权利要求10所述的核苷，其中B为核碱基，选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶或尿嘧啶。12.如权利要求10所述的核苷，其中该核苷应用在制备权利要求1中的寡聚物。13.如权利要求10所述的核苷，其中核苷的结合调整寡核苷酸作为核酸活化酶基质的能力。14.如权利要求10所述的核苷，其中该核苷应用在制备寡聚物的轭合物以及选自蛋白质、扩增基因、酶、多醣类、抗体、半抗原、肽和PNA的化合物。15.如权利要求10所述的核苷，其中该核苷作为核酸上酶活性基质的应用。16.如权利要求15所述的核苷，其中该核酸上酶活性为DNA与RNA聚合酶。17.如权利要求10所述的核苷，其中该核苷应用在制备治疗药物。18.如权利要求10所述的核苷，其中该核苷应用在构成固体表面，该固体表面上已经连接不同序列的经LNA改性的寡核苷酸。19.如权利要求1所述的寡聚物在目标核酸序列特异性裂解中的应用。20.如权利要求1所述的寡聚物，其中该寡聚物应用在用作为反讯息、反基因或基因活化的药物组合物。21.如权利要求20所述的寡聚物，其中该寡聚物补充RNAseH。22.如权利要求1所述的寡聚物，其中该寡聚物包括多于一种该通式Ia的核苷类似物改性的寡核苷酸复合物在用作为反讯息、反基因或基因活化的药物组合物。23.如权利要求1所述的寡聚物在制备用于治疗癌症的药物中的应用，其中该寡聚物会特定地与选自tRNAs、rRNAs、snRNAs和scRNAs的RNA相互作用，从而抑制任何选自翻译、RNA拼接、RNA处理及其它主要细胞处理的细胞处理。24.如权利要求1所述的寡聚物在用于天然或合成核酸的分离、纯化、扩增、检测、辨识、定量或捕获中的应用。全文摘要本发明涉及L-核糖-LNA类似物。核苷类似物，其中，用在C-3’与C-4’转化的立体化学合成2’-4’-桥接锁定核苷构型的核苷类似物，以提供L-核糖-构型LNA核苷。该L-核糖-LNA-核苷合成可应用于所有核碱基，该核碱基包含胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶。这些具有L-核糖-构型的锁定核酸(LNA)已用于2’-O-4’-亚甲基-α-L-核糖呋喃糖基核苷酸以及其中含有L-核糖-LNA核苷酸的寡核苷酸的合成。利用这些L-核糖-LNA改性寡核苷酸，借助它们对于互补核酸的高亲和性，大幅改善靶标互补核酸的方法。文档编号A61K48/00GK102180924SQ201110034608公开日2011年9月14日申请日期2000年5月4日优先权日1999年5月4日发明者叶斯佩尔·文格尔申请人:桑塔里斯制药公司