专利名称：野生型和嵌合流感病毒样颗粒(vlp)的装配的制作方法
技术领域：
本发明涉及仅含基质蛋白的流感病毒样颗粒，也可含有任何流感的结构蛋白。
背景技术：
流感病毒包括称为A、B和C的亚型。流感病毒具有分节段的单链反义RNA基因组，它编码病毒生活周期所需的10条多肽。一个完整基因组中的8个RNA节段分别被多个核衣壳蛋白(NP)亚基衣壳包装，并与一些三聚聚合酶(PB1、PB2和PA亚基)分子结合，从而形成核糖核蛋白复合物(RNP)(文献号1)。围绕这些结构有一层基质蛋白(M1)，它似乎在核与病毒包膜之间起到融合膜的作用。该宿主细胞衍生的包膜镶嵌有两种主要病毒编码的表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，和一些量少得多非糖基化的小蛋白(M2)(1，2)。HA糖蛋白被蛋白酶切开形成HA1和HA2。
表面血凝素附着到含有唾液酸的细胞受体上，引发流感病毒感染。该最初的病毒-细胞相互作用诱导病毒颗粒通过受体介导的胞吞作用被摄入细胞。在核内体的低pH条件下，HA经过构象改变，促使HA2的疏水性NH2末端结构域与核内体膜相互作用，导致膜融合，随后将核心RNP和基质蛋白(M1)释放到细胞液中。RNP和基质蛋白的解离在细胞液中发生，然后RNP转位到核，在此发生完整基因组的转录和复制(3，4)。
最初转录后，新合成的蛋白质引发病毒基因组的复制，后者反过来提高了转录和蛋白质合成。在病毒生命周期的该点上，表面糖蛋白HA和NA开始在胞质膜的分散区域中聚集，在此释放出新装配的病毒。设想病毒装配是通过胞质和/或膜锚定蛋白的跨膜结构域与下面的基质蛋白(M1)之间的某种相互作用开始的，该作用反过来又维持与RNP的紧密结合(5，6)。总的说，HA、NA、M1和M2构成4种病毒编码的结构蛋白。基质蛋白M1和RNP复合物之间的接触，以及一组完整的8种RNP掺入成熟病毒颗粒的机制还未被完全确定。设想在结构成分中的特定分子接触指挥形态发生过程如何开始，并进行到成熟颗粒装配和从宿主细胞表面出芽的时刻。
该过程的复杂性引起了问题，例如1)确定哪种病毒蛋白是装配和出芽所需要的。2)表面和驱动装配和出芽过程的下面的成分之间的蛋白-蛋白和脂类-蛋白相互作用类型。3)RNP引入装配位点，掺入颗粒并从同类节段中分拣出的机制。4)装配和出芽的相互作用和调节的性质和化学计量。所有这些事件在复杂的细胞环境中发生，一些宿主分子可以或可以不增强或干扰装配和出芽过程的进展。这相反导致了问题，即细胞蛋白质是否真的涉及病毒装配，和非病毒蛋白质一般如何从出芽颗粒的表面排除。
进行了大量研究来解决一些不同家族的包膜RNA病毒的这些问题(5)；然而对于流感病毒这些问题中的大部分仍未解决。对于某种程度上与流感病毒形态和进化有关的无节段RNA病毒家族(例如弹状病毒和副粘病毒)的研究显示了弹状病毒水疱性口炎病毒(VSV)的基质蛋白(M)本身能够从细胞表面作为膜颗粒挤出(出芽)(7，8)。另外，M蛋白在出芽中的重要性也反映了这一事实，即具有编码G表面蛋白的基因缺失的狂犬病病毒(另一种弹状病毒)的拷贝仍然能够形成，并从感染细胞中释放(9)。最近对于PIV-3(一种副粘病毒)的研究也显示基质蛋白和核衣壳蛋白(NP)能结合成病毒样结构，从细胞表面出芽(10)。然而对于流感病毒，用Semliki Forest病毒复制体表达这两种蛋白不显示它们之间的结合或膜小泡的出芽(11)。
进行流感病毒的反向遗传是一种调查结构成分之间的蛋白-蛋白相互作用的有用方法。近来研究了糖蛋白的胞质结构域在流感病毒装配中的重要性(12，13，14)，显示HA尾的缺失减少它在颗粒中的掺入以及出芽的功效，但不影响病毒颗粒形态。另一方面，具有缺失的NA尾的病毒显示丝状形态，NA在包膜中的掺入受损。另外，双重缺失似乎降低了出芽的效率以及感染性，并改变病毒颗粒形态，它与具有尾缺失的和野生型的病毒是可分辨的。虽然双尾缺失似乎影响病毒颗粒的出芽效率和形态，它们并不完全取消病毒颗粒的装配和输出。这提示M1蛋白能指导病毒装配和出芽(13)。
类似的，基质蛋白和细胞膜之间建立的相互作用似乎对于病毒装配和释放是关键的。然而该结合的物理性质，基质蛋白是否完全嵌于胞质膜或仅通过静电相互作用吸附，是一个未解决的问题。克服该问题的近来研究强烈提示，基质和膜是通过静电相互作用结合的，但不能排除一定量的M1可以嵌入膜(15)。M1和M2蛋白在成熟病毒颗粒中的关键作用，当这些分子种任一个存在氨基酸取代时反映在颗粒的球形或丝状形态上(16)。
病毒样颗粒(VLP)近年来引起了很大兴趣，因为它是免疫原性组合物中内含物的可能候选物。这是由于VLP含有一种或多种表面蛋白，它们显示构象与其天然构象足够相似，能够引发所需的免疫应答。同时，VLP缺乏在宿主中产生病毒子代所需的遗传材料的补体。因此，与野生型病毒不同，VLP不能导致具有疾病症状或病理的感染。例如，轮状病毒(一种双链RNA病毒)的两种或三种蛋白被装配入VLP，引发免疫应答(17)。
杆状病毒表达系统已广泛用于研究无包膜病毒的VLP的形态形成和装配，它们能自己装配成二十面体结构(18，19，20，21)。类似的，反转录病毒科不同成员的蛋白gag和/或env在昆虫细胞中的表达也用于研究包膜病毒核心结构的装配和出芽(22，23，24，25)。
需要评估杆状病毒表达系统产生流感VLP的能力。特别是，需要鉴定装配入VLP的感冒病毒蛋白最少量和评估这些VLP的形态学和免疫原性。
发明概述因此，本发明的一个目的是鉴定装配入VLP的感冒病毒蛋白最小量。本发明的另一个目的是产生含有来自流感病毒一种以上亚型蛋白质的VLP。本发明的另一个目的是产生含有来自异源的，非流感病毒来源蛋白质的嵌合VLP。本发明还有另一个目的是配制含有一种或多种上述VLP的致免疫的和药物的组合物。
下面讨论了本发明的这些和其它目的，通过装配含有至少一种流感病毒结构蛋白的流感VLP来实现，其中所述的VLP总含有M1。在本发明的一个实施例中，VLP仅含M1(它可掺入核衣壳(NP))。这些VLP是通过构建编码M1的重组DNA分子产生的，用所述重组DNA分子转染、感染或转化合适的宿主细胞，在允许M1表达的条件下培养宿主细胞，从而在M1表达后细胞内使VLP装配，并从培养上清液中纯化出VLP。
在本发明的另一个实施例中，VLP还含有至少一种流感病毒结构蛋白，选白HA、NA和M2。这些VLP是通过构建一种或多种重组DNA分子产生的，它们编码M1加上至少一种HA、NA和M2，用所述的一种或多种重组DNA分子转染、感染或转化合适的宿主细胞，在允许所述流感病毒结构蛋白表达的条件下培养宿主细胞，从而VLP在结构蛋白表达后细胞内使VLP装配，并从培养上清液中纯化出VLP。仅含M1或含有M1加上至少一种HA、NA和M2的VLP与稀释剂或载体配制成免疫原性组合物，用于免疫脊椎动物抵抗因流感病毒导致的感染。
在本发明的另一个实施例中，可能期望的是产生含有不同流感病毒亚型的表面糖蛋白的VLP。这些含有来自一个亚型的HA和不同亚型的NA的VLP与稀释剂或载体配制成二价免疫原性组合物，用于免疫脊椎动物抵抗因这两种流感病毒亚型导致的感染。
在本发明的另一个实施例中，可期望的是产生VLP，在此HA或NA的一部分或全部被不是流感病毒产生的异源部分所替换，从而含有嵌合VLP。这些部分包括但不局限于肽、多肽或蛋白质。当仅需要替换一部分HA或NA时，用编码为非流感肽、多肽或蛋白质的DNA序列替换编码为HA或NA的重组DNA分子中一部分DNA序列。当要替换全部HA或NA时，用编码为非流感肽、多肽或蛋白质的DNA序列替换重组DNA分子中的完整DNA序列。
一方面，这些非流感肽、多肽或蛋白质来自病原性微生物。这些嵌合的VLP是用稀释剂或载体配制成免疫原性组合物的，用于免疫脊椎动物抵抗该病原性微生物导致的转染。
在另一个方面，这些非流感部分是一个药物活性部分。这些嵌合VLP用稀释剂或载体配制或为药物组合物，并以有效量施用，用于治疗具有所述非流感部分的脊椎动物。
在另一个方面，VLP装配和包装的RNP，还可以进一步掺入并表达异源的核苷酸序列。
任何上述免疫原性和药物组合物还可含有佐剂。
附图简述
图1描述了四重杆状病毒转移载体(结构的四重)，携带流感A/Udorn/72(H3N2)株的4个基因。流感基因HA和M1的转录是由多角体启动子驱动的(缩写成“pH”)，而M2和NA是由p10启动子驱动的。该载体和线性杆状病毒DNA一起转染入Sf9昆虫细胞，以产生四重重组株(HA/Q)。
图2描述了VSV-G/HA嵌合体的结构。细胞质尾的14个氨基酸和流感HA的跨膜结构域的29个氨基酸在框架中与VSV-G表面糖蛋白的胞外域(SEQ ID NO1)融合。
图3描述了在感染了四重杆状病毒重组株(HA/Q28或VSV-G/Q)的Sf9细胞中表达的流感和VSV G蛋白的蛋白质印迹分析。在图3A中，在被四重重组株HA/Q28感染的Sf9细胞的上清液中(感染后72小时)，用抗-HA、抗-M1和M2单克隆抗体的混合物检测流感蛋白HA、M1和M2(泳道1)；还在细胞沉淀中检测了HA和M1(泳道2)。感冒A/Udorn/72(H3N2)-感染的MDCK细胞用作对照(泳道3)。
图3B描述了VSV G，以及流感M1和M2蛋白在被VSV-G/Q(全长G)感染的Sf9细胞中的表达。当用抗-G、抗-M1和M2单克隆抗体混合物探测时，在细胞沉淀(泳道2)和培养上清液(泳道3)中检测表达。未感染的Sf9细胞(泳道1)、VSV-感染的BHK细胞(泳道4)和流感A/Udorn/72(H3N2)-感染的MDCK细胞(泳道5)分别用作阴性和阳性对照。
图4描述了被四重杆状病毒重组株(HA/Q28)感染的Sf9细胞的免疫荧光分析。以1MOI用HA/Q28感染Sf9细胞的箱式培养物，并孵育72小时。此时，用对甲醇-丙酮固定单个箱，并依次与一抗体和二抗体孵育。用合适的滤膜检测HA(图4A)、M1(图4B)或HA/M1(图4C)的表达。
图5描述了用HA/Q28感染的Sf8细胞的免疫荧光分析。在1个MOI用HA/Q28感染Sf8细胞箱式培养物，并孵育72小时。此时，用甲醛固定单个箱，并依次用一抗体和二抗体呼育。用合适的滤膜检测HA(图5a)，NA(图5b)或HA/NA(图5c)的表达。
图6描述了用HA/Q28感染的Sf9细胞的免疫荧光分析。用HA/Q28以1MOI感染Sf9细胞的箱式培养物，并孵育72小时。此时，用对甲醛固定单个箱，并依次与一抗体和二抗体孵育。用合适的滤膜检测M2的表达。
图7描述了用VSV-G/Q(HA/Q28中的全长流感HA基因被全长VSV G基因替换)感染的Sf9细胞的免疫荧光分析。用VSV-G/Q以1MOI感染Sf9细胞的箱式培养物，并孵育72小时。此时，用对甲醇一丙酮固定单个箱，并依次与一抗体和二抗体孵育。用合适的滤膜检测VSV G的表达。
图8描述了用碘克沙醇梯度离心分析VLP形成。图8A描述了当用抗-Ha和M1单克隆抗体混合物通过蛋白质印迹分析探测HA/Q28的片段时的结果。泳道1-8代表从试管顶部到底部收集的片段；泳道9是MDCK流感A/Udorn/72(H3N2)-感染的对照。图8B描述了当用抗-VSV-G、抗-M1和抗-M2单克隆抗体混合物通过蛋白质印迹分析探测VSV-G/Q的片段的结果。泳道1-8代表从试管顶部到底部收集的梯度片段；泳道9是VSV-感染的BHK和流感病毒感染的MDCK细胞的混合物，作为对照。图8C描述了当纯化双重感染(M1和NP单重组株)的Sf9细胞的浓缩上清液，并用抗-M1和抗-NP抗体混合物探测时的结果。泳道1-8代表从试管顶部到底部收集的片段；泳道9是流感病毒感染的MDCK细胞，作为对照。
图9描述了被M1单独或HA/Q28加NP单一杆状病毒重组株感染的Sf9细胞的培养上清液的蛋白质印迹分析。图9A描述了衍生自单M1片段的上清液的片段分析，此片段用抗-M1抗体探测。泳道1-8代表从试管顶部到底部收集的片段；泳道9是流感病毒感染的MDCK细胞，作为对照。图9B描述了当纯化双重感染(HA/Q28加NP单杆状病毒重组株)的Sf9细胞的上清液，并用抗-HA、抗-M1和抗-NP抗体混合物探测时的结果。泳道1-8代表从试管顶部到底部收集的片段；泳道9是与图9A中的相同的对照。
图10描述了从被四重重组株HA/Q28感染的Sf9细胞的培养基中纯化的负染色的流感VLP的电子显微镜照片。
图11描述了免疫金标记的流感VLP的电子显微镜照片。在图11A(三视图)中，用抗-HA单克隆抗体探测VLP并用与抗-小鼠IgG偶联的金球复染。在图11B中，用抗-NA单克隆抗体探测VLP并如图11A中复染。
图12描述了用HA/Q28 VLP免疫的小鼠血清合并物探测的流感病毒感染的细胞的蛋白质印迹分析。在图12A中，描述了来自第一对的两只小鼠的合并血清的结果。在图12B中，描述了来自第二对两只小鼠的合并血清的结果。在图12A和B中，泳道1未感染的MDCK作为对照，泳道2流感A病毒感染的MDCK细胞。探测未感染的MDCK细胞显示在M1条带稍上方的非特异性条带，它也存在于流感病毒感染的细胞中。
图13描述了用VSV-G/Q嵌合VLP免疫的小鼠血清合并物探测的VSV-感染的印迹。在图13A中，描述了来自第一对的两只小鼠的合并血清的结果。在图13B中，描述了来自第二对两只小鼠的合并血清的结果。在图13A和B中，泳道1未感染的BHK细胞作为对照，泳道2VSV感染的BHK细胞；泳道3未感染的MDCK细胞作为对照；泳道4流感病毒感染的MDCK细胞。
图14描述了携带流感A/Udorn/72(H3N2)株的4个基因的四重杆状病毒转移载体，包括三个编码聚合酶亚基和核蛋白的基因。流感基因PB1和PA(位于相反方向)的转录是由多角体启动子(缩写为“pH启动子”)驱动的，而PB2和NP基因的转录也是相反方向，是由p10启动子驱动的。将4个基因亚克隆入杆状病毒转移载体PAcAB4，然后与线状杆状病毒DNA共转染入Sf9昆虫细胞，以产生四重重组株。
图15描述了荧光素酶活性在未感染(对照)和VLP-感染的幼仓鼠肾细胞(BHK)中作为相对发光值的测量值。
图16描述了感染了携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的VLP后，GFP在BHK细胞中的表达。箭头表示表达GFP的BHK细胞。
发明详述包膜病毒颗粒从病毒感染的细胞表面装配和释放是一种复杂和分步的过程。它需要病毒编码的糖基化和非糖基化蛋白质与胞质膜的分散区域协同作用，以引发病毒颗粒的装配。除了这些成分，蛋白质衣壳包装的核酸(代表病毒的遗传物质)也掺入该结构，以完成形态生成过程，这是通过成熟病毒颗粒从细胞表面挤出或出芽完成的。在完整病毒颗粒的装配和最终释放中确切的分子相互作用和不同结构成分贡献没有完全被确定。
本发明描述了流感病毒样颗粒(VLP)从表达流感病毒结构蛋白的重组载体所感染的细胞表面装配和释放。各种表达系统适用于产生VLP。用表达流感病毒结构蛋白的杆状病毒重组株所感染的昆虫细胞举例说明了本发明。
为了确定流感病毒装配和出芽所需的分子，构建了一系列单基因和四重基因杆状病毒重组株。重组株在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)9(Sf9)细胞中表达4个流感结构蛋白(HA、NA、M1和M2)。Sf9细胞是昆虫细胞系(ATCC登录号CRL1711)，是SF21细胞系的衍生物。虽然描述了编码全部4个结构蛋白的转移载体，但是使用编码2个或4个合起来编码这4个蛋白的转移载体也在本发明范围内。
为了获得四重重组株，用穿梭载体法构建了编码流感A/Udorn/72(H3N2)株的4个结构蛋白的单个杆状病毒转移载体，通过减小工作质粒的大小和提高限制性位点的数量促进克隆。在最终转移载体中，流感基因位于杆状病毒启动子p10(NA和M2)和多角体(HA和M1)下游，安置它们以驱动反向基因的转录(图1)。
通过用线性病毒DNA和转移载体DNA同时转染Sf9细胞，获得四重(HA、NA、M1和M2)杆状病毒重组株。挑选几个重组病毒噬斑，进一步用另外的两轮噬斑-噬斑分离纯化。基于免疫印迹评估的蛋白质表达水平，挑选出该四重重组转移载体(称为HA/Q28)用于随后的实验。
该构建物的一个显著特征是在M1基因上的供体和受体剪切位点突变，以防止M1 mRNA剪切。另外，M1 mRNA可被切成M2 mRNA，导致M1蛋白的表达水平下降。M2 DNA作为独立基因被引入转移载体。
为了调查这4个流感结构蛋白的表达是否足够驱动流感VLP从被四重杆状病毒重组株HA/Q28感染的Sf9昆虫细胞表面上装配和出芽，用蛋白质印迹分析培养上清液以确定M1和HA蛋白质的存在。感染后72小时收集培养基，在4000xg澄清30分钟，然后200000xg离心2小时浓缩剩余的悬浮物质。
用抗-HA、M1和M2单克隆抗体探测感染的细胞的浓缩上清液，进行蛋白质印迹分析显示流感HA、M1和M2蛋白的显著表达(图3A)。HA蛋白似乎与流感A/Udorn/72(H3N2)感染的Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞的HA迁移模式不同，可能反映了该蛋白的不同糖基化形式。另一方面，M1和M2蛋白的迁移模式与在MDCK流感感染的细胞中所表达的相似(图3A，泳道1-3)。通过蛋白质印迹分析，使用也识别HA、M1和M2的小鼠多克隆抗体检测NA蛋白的表达(数据未显示)。
下文讨论的结果显示4种流感结构蛋白的表达足够使VLP从Sf9昆虫细胞表面装配和出芽。除了这4种蛋白质，核衣壳蛋白(NP)的表达导致形成使NP蛋白掺入颗粒的VLP。另外，M1蛋白单独表达诱导VLP的释放，当与M1共表达时，它也可以掺入核衣壳NP。另外，用全长水疱性口炎病毒的G蛋白或四重重组株中的杂交HA/G替换HA基因，诱导了嵌合VLP的装配和释放。所有这些VLP是通过常规纯化方法在VLP分泌到培养基后获得的。
为了评估异源非流感糖蛋白是否能掺入流感VLP表面，构建了两种不同的嵌合四重杆状病毒重组株。第一种称为VSV-G/Q，用编码水疱性口炎病毒(VSV)的全长糖蛋白G的DNA序列替换编码流感HA蛋白的DNA序列。第二种称为VSV-G/HA-Q，携带编码VSV G蛋白胞外域和流感HA蛋白的跨膜结构域和胞质尾的杂交DNA序列(见图2)。两种重组株都包含三个结构流感蛋白M1、NA和M2的基因。
这些构建物与野生型流感VLP一样经过相同的特征研究，结果显示Sf9昆虫细胞被任一构建物感染都指导在其表面携带VSV G蛋白的流感样颗粒装配和释放。这两种重组病毒都能驱动4种蛋白质的表达(M1、M2、NA和VSV-G)，也分泌入培养基。
用VSV-G/Q感染的Sf9细胞的蛋白质印迹分析显示，VSV G蛋白和流感蛋白M1和M2一样，是在感染后72小时表达的(图3B)。而且，感染的细胞的浓缩上清液当用VSV G和流感M1和M2的抗体探测时，显示阳性蛋白质印迹(图3B，泳道3)。
刚刚对于VSV g蛋白所述的方法可方便的用于将其它生物学上感兴趣的非流感糖蛋白掺入VLP表面，以及掺入不是由流感病毒产生的部分。这些部分包括但不限于肽、多肽或蛋白质。如下所述，这些VLP在受体-配体相互作用研究中用作免疫原性组合物，和/或用作传递作为药物组合物的一部分的非流感部分的系统。
为了进一步评估流感蛋白在Sf9细胞中的表达和细胞定位，进行了用噬斑纯化的杆状病毒重组株HA/Q28所感染的细胞的免疫荧光分析。这些实验显示4种流感结构蛋白正如间接免疫荧光所示表达(图4-6)。用抗-HA和抗-HA抗体的双染色实验证明这些表面糖蛋白定位在感染细胞周围，有某些程度的重叠(图5C)。这些结果提示，这些主要糖蛋白共同位于感染昆虫细胞表面上的分散区域，与在哺乳动物细胞的天然流感病毒感染中所预期的相似。
类似的，用针对任一HA和M1的单克隆抗体的混合物对HA/Q28-感染的Sf9细胞进行双免疫荧光染色，显示表面蛋白和基质M1似乎共同定位在细胞膜的不同区域(图4C)。
在另一方面，M1-杆状病毒重组株感染的Sf9细胞的免疫荧光显示，M1蛋白质主要聚集在感染细胞核中，仅少量在细胞表面可见(数据未显示)。M1蛋白在感染细胞中的分布模式似乎不被改变，不论M1是作为单基因或与HA、NA和M2作为四重重组株表达(图4)。另外，当与用M1或NP重组株单独感染的Sf9细胞比较时用M1和NP单重组株同时感染Sf9细胞不显示这些蛋白质在细胞中重新分布(数据未显示)。
因此，感染细胞的蛋白质印迹和免疫荧光分析显示，这4种蛋白不仅存在于细胞和细胞上清液中，也共同定位在胞质膜上的分散区域中。这提示这些结构蛋白之间的有可能结合。
用VSV-G/Q重组株感染的Sf9细胞的免疫荧光分析显示，VSV G蛋白不仅被表达，而且似乎聚集在感染细胞周围。
由于免疫荧光研究揭示这些蛋白共同定位于细胞表面，这导致评估这4种病毒蛋白质是否足够驱动VLP从感染细胞表面形成和释放。特别是，为了调查这些蛋白质是作为细胞损伤和死亡的结果从细胞释放，还是由于它们装配成从细胞表面出芽的VLP，对HA/Q28-感染的Sf9细胞浓缩上清液进行碘克沙醇(26)速度梯度离心(200000xg，3.5小时)。如分别规定的，含有感兴趣的蛋白质组分在20-60％蔗糖梯度上进行另外的纯化。
收集的组分的蛋白质分析显示HA和M1通过梯度共迁移，在组分2中达到峰浓度(图8A，泳道2)。还在邻近的组分3和4以及组分7和8中发现了这些蛋白质(图8A)。在这些较低的组分中检测到HA和M1(朝向梯度底部)似乎是由于这些蛋白质与杆状病毒结合，它在这些条件下是在组分7和8中形成条带(数据未显示)。
用VSV-G/HA-Q(嵌合体)和VSV-G/Q(全长)构建物进行了类似实验。如用HA/Q28观察到的，碘克沙醇梯度的组分2含有如蛋白质印迹分析显示的VSV G和流感M1和M2蛋白(图8B，泳道2)。当用携带全长VSV-G而不是HA的四重重组株感染Sf9细胞时，所有探测的蛋白(VSV-G，M1和M2)也都存在于浓缩的上清液和碘克沙醇梯度的组分2和3中(图3B，泳道3和泳道8B)。这些结果提示用四重VSV-G/HA-Q(嵌合体)或VSV-G/Q(全长)感染Sf9细胞指导携带VSV G蛋白的流感VLP在其表面装配和释放。
根据一些HA/Q28颗粒在电子显微镜下检查不显示可检测的表面突起的事实(见下文)，产生了疑问，即流感基质蛋白自身是否足够驱动水疱性口炎病毒颗粒装配和释放。为了解决这个疑问，用M1杆状病毒重组株感染Sf9昆虫细胞72小时，对浓缩培养上清夜如上所述进行相同的分析。碘克沙醇梯度上清液组分的免疫印迹分析显示基质蛋白浓缩在组分2和3中，与从被HA/Q28感染的Sf9细胞释放出VLP的迁移模式类似(图9A)。
有强有力的证据(3)证明基质蛋白(M1)在核糖核蛋白复合物(RNP)从核运输到细胞表面中起到了重要作用，并在细胞表面发生病毒装配。基质和RNP之间的结合可能是通过与NP、病毒颗粒RNA或两者接触介导的。因此，感兴趣的是评估当Sf9细胞与四重重组株HA/Q28和NP单杆状病毒重组株共同感染时，核衣壳蛋白质(NP)是否掺入VLP。梯度组分2的蛋白质印迹分析显示，核衣壳蛋白NP事实上掺入生成的VLP(图9B)。该结果提出了问题，即哪种蛋白质确立与NP的接触，以使得NP掺入颗粒。
为了解决该问题，使用了M1和NP单一杆状病毒重组株。在Sf9细胞中M1和NP的同时表达产生了由两种蛋白组成的膜颗粒。这使得可在确定的具有精确末端的流感RNA缺失的情况下，评估这两种蛋白质之间的可能相互作用。来自由M1和NP重组株双重感染的Sf9细胞的梯度纯化颗粒经蛋白质分析显示，M1和NP共同定位于相同组分中(图8C)。另一方面，用NP重组株单独感染不诱导颗粒释放，不显示反应性NP在任何组分中的存在(数据未显示)。这些结果提示M1和NP之间的相互作用足够强，甚至在RNA缺失的情况下也能够将NP携带入含M1的颗粒中。
基于流感病毒中NP蛋白质定位和其它对于蛋白质颗粒装配的研究，合理的推断NP蛋白建立与基质蛋白M1接触，作为该相互作用的结果，使其掺入VLP。在流感感染的细胞中，RNP从核运输到胞质膜上的病毒装配位点在通过没有确定的机制与基质蛋白结合后发生。
显示了(27)NP蛋白不仅与流感RNA结合，还可以较低亲和力与非特异性RNA结合。因此，该结果不排除在M1和NP之间的生产性相互作用需要RNA的可能性。
因此，概括了基质蛋白不仅引发导致颗粒装配和释放的分子相互作用，还能够结合核衣壳NP并掺入颗粒。在流感感染细胞中，M1蛋白与RNP在运输和病毒装配过程中结合。就单一M1重组株的情况下，这些其它流感结构不存在，但出芽仍然发生。NP可以与M1作为单体或寡聚体结合，或在结合细胞RNA后结合。不论结合性质是什么，清楚的是在昆虫细胞中所表达的M1和NP以充分亲和力结合装配入小囊，该小囊从细胞中分离出。
为了确定在共同迁移入组分2和3的流感蛋白之间的结合性质，在这些组分中存在的物质进行电镜评估。
组分2的电子显微镜检测揭示同时存在高浓度的小泡和非小泡颗粒，镶嵌有与流感细胞和亚病毒颗粒非常相似的表面突起物(图10)。VLP的形状和结构特征随它们在梯度中的位置而变化。从某些小泡表面伸出的刺突看来与流感HA和MA相似，它们从颗粒表面向外突起，如同它们从流感病毒表面突起。
组分2中的一些VLP上的突起物与存在于流感病毒中的HA刺突非常相似(图10)。NA的形态在含有如此广泛范围刺突镶嵌体的样品中差别较小。组分3在高浓度下含有相似范围的颗粒，然而似乎比组分2含有更高浓度的聚集的膜(数据未显示)。
在电子显微镜下显示最大数量的流感VLP的组分也含有最高浓度的M1和HA蛋白，如蛋白质印迹分析显示那样。VLP被表面突起物覆盖，长度范围为约75-150nm，很明显在大小和形状上类似流感病毒。
为了进一步确定M1颗粒的结构特征，用电子显微镜检测了这两种梯度组分。负染色的电子显微镜检测显示大量不定形的小泡，在其表面没有带有刺突(数据未显示)。
为了确定杆状病毒感染的细胞是否自发释放小泡，或M1蛋白质在细胞表面的结合是否足够驱动颗粒排出，通过电子显微镜检测了用野生型或NP重组株杆状病毒感染的Sf9细胞浓缩上清液的类似梯度组分。当用相应的单一重组株感染的Sf9细胞上清液用于分析时，在这些组分中没有一种其它蛋白质(NP，HA)检测到。这些结果表明基质蛋白本身足够驱动VLP的装配和从昆虫细胞表面释放。
用针对HA和NA的特异性单克隆抗体(与免疫荧光实验中所用的相同)探测的免疫金标记的表面抗原，通过电子显微镜研究从VLP表面伸出的刺突蛋白质组成。该检测显示，主要流感表面抗原HA事实上存在于VLP表面，如通过金珠的存在所表明的(图11A)。这证实了通过负染色和电镜所见的刺突结构评估的推断(图10)。类似的，用抗-HA抗体标记的免疫金和电子显微镜也揭示了NA糖蛋白在VLP表面上存在，虽然丰度比HA低(图11B)。
通过用家兔多克隆抗体的免疫金标记试图检测M2蛋白质在VLP表面上的存在，该抗体是针对包含M2蛋白质氨基末端18个氨基酸的肽产生的。在颗粒表面检测不到M2蛋白，即使它存在于受到免疫金标记-电子显微镜(IEM)的梯度组分中。然而，这并不惊奇，因为IEM作为检测微量蛋白质是不够灵敏的系统，甚至对于天然流感病毒，产生极少量的M2而且很难将其检出。
当纯化嵌合流感-VSV VLP并用电子显微镜检测时，发现它们具有与流感VLP相似的形态。另外，免疫金标记分析揭示，它们携带与抗-G抗体反应的表面糖蛋白(数据未显示)。
用任何一种构建物产生的颗粒似乎不显示形态上有任何显著区别。G蛋白在两种颗粒表面上的含量也是非常相似的。这提示在G/HA嵌合体的HA部分与膜下面的M1之间可能有利的相互作用不显著提高G掺入颗粒的水平。
为了评估野生型流感VLP和嵌合VLP的免疫原性(含有VSV G)，用HA/Q28或VSV-G/Q经肌肉注射途径免疫两组Balb/c小鼠，其中每一组VLP用磷酸铝配制。各组中的所有小鼠每隔两周接受最初和两次增强注射。最后一次免疫两周后，获得血样，用蛋白质印迹(对于两类VLP)、血凝素的抑制(对于HA/Q28)和血清中和试验(对于VSV-G/Q)评估针对相应抗原的抗体存在。
免疫印迹分析说明，用流感HA/Q28免疫的小鼠血清识别用作试验免疫原(主要是HA和M1；图12A和B，泳道2)的流感病毒。类似的，用嵌合体VLP VSV-G/Q免疫的小鼠血清识别VSV的G蛋白(图13A和B，泳道2)。
流感病毒血凝试验(IHA)的抑制表现显示，用HA/Q28免疫的小鼠血清具有96IHAU的IHA滴度，它比首次用于试验的对照小鼠(32IHAU)获得的滴度高两倍以上。该应答几乎与作为阳性对照的用活流感A/Hong Kong(H3N2)，(Dr.Mbawuike，Baylor College of Medicine赠送)经两次鼻内免疫(隔二周)引发的128IHAU的IHA滴度相等。
用VSV-G/Q免疫的小鼠血清中和VSV显示高达1/64的稀释度完全中和标准VSV滴度，从而防止在细胞单层中形成任何噬斑。
这些结果说明流感VLP引发的抗体应答不仅在蛋白印迹中识别野生型流感病毒，还抑制流感病毒血凝反应。另外，用携带VSV G蛋白的嵌合体VLP免疫小鼠诱导了体液抗体应答，它在蛋白质印迹分析中识别野生型病毒的VSV G蛋白，也在血清中和试验中防止VSV感染。
除了昆虫细胞，其它类型的宿主细胞也可与编码流感病毒结构蛋白一种或多种(如有需要，一种非流感蛋白)的重组载体一起使用，以便产生VLP。对VSV M蛋白的研究证明，该性质在昆虫(8)和哺乳动物(7)细胞类型中都有显示。另外，副流感病毒(另一类无节段，负链RNA病毒)的基质M和NP蛋白质在哺乳动物细胞中的表达导致病毒样颗粒的形成和释放(10)。
适合与用作为宿主细胞其它的细胞类型包括哺乳动物(例如中国仓鼠卵巢、鸡胚成纤维细胞、BHK细胞、人SW13细胞)和酵母(例如毕赤、酿酒酵母)宿主细胞。用哺乳动物或酵母细胞可导致具有糖基化的蛋白质表达，与在昆虫细胞中获得的相比，更相似于野生型蛋白质的表达。
合适的用于传递基因的重组载体除了杆状病毒还包括，但不局限于，诸如牛痘病毒和其它痘病毒属的病毒，辛德毕斯、腺病毒、委内瑞拉马脑炎病毒和其它甲病毒，以及质粒DNA。
重组载体应包括启动子和有效指导流感病毒(和任何非流感病毒)蛋白质表达的其它调控元件(例如聚腺苷酸信号)，在相应宿主细胞类型中产生VLP。应用本领域已知的常规技术转染，感染或转化宿主细胞。这些技术还包括，但不局限于转导、电泳和脂转染。
如本文所述，流感病毒的四种结构蛋白(HA、NA、M1和M2)通过四重杆状病毒重组株表达足够驱动VLP的装配和从Sf9昆虫细胞表面释放。这是关于仅用4种结构蛋白产生的流感VLP形成的首次报道。事实上，VLP可包含少至1种结构蛋白M1。因此，本发明包括单独由M1构成的、M1加上HA、NA和M2中的一种或两种，以及全部4种结构蛋白构成的VLP。
装配的VLP与野生型流感病毒在大小、颗粒形态和表面刺突的精细结构上都非常相似。另外，在不存在流感RNP的情况下形成VLP表明RNP不是颗粒装配和释放所必需的。
这种装配流感VLP的新颖方法对于设计针对新流感病毒变种的免疫原性组合物非常重要。该系统的一个重要特征是能力用不同亚型的HA和/或NA替换表面糖蛋白；这将允许用这些蛋白的新抗原的变种进行最新配制。由于鉴定了这些糖蛋白的抗原的变种，VLP可更新至包含这些新变种。因此，甚至极端危险的表面糖蛋白，例如H1N1(来自1918西班牙流感)和具有流行可能性的HA、NA的组合也能掺入VLP，而不用担心释放在人类中已经有几十年没有周转过的基因的含义。这是由于VLP没有感染性，不复制也不会引起疾病。
另外，在VLp表面掺入异源糖蛋白的可行性使该方法有吸引力不仅使作为传递系统，而且还能考虑到基于表面糖蛋白掺入表面的靶向特定的细胞类型(向性)。在一个实施例中，VLP含有HA的胞质尾和跨膜结构域，和非流感糖蛋白的外部结构域，它促使用于多价免疫的嵌合颗粒的产生。
总的说，已显示只要每次都表达基质蛋白M1，在表达仅1种至4种病毒结构蛋白后，野生型和嵌合流感病毒样颗粒可装配并从Sf9细胞表面释放，还显示当两种同时存在时，M1能驱动含有NP的小泡颗粒的释放。
在本发明的另一个实施例中，实现了核糖核蛋白复合物(RNP)(含有三种聚合酶亚基，PA、PB1和PB2以及核蛋白NP)的形成和随后的衣壳包装成VLP。产生第二种的四重杆状病毒重组株同时在Sf9昆虫细胞中表达这三种聚合酶亚基和NP，(图14)。
为了评估RNP形成和衣壳包装，合成了以反义朝向编码荧光素酶的体外负义RNA模板，侧接流感病毒NP末端的3’和5’保守和非编码区域。用体外产生的RNA转染Sf9昆虫细胞，随后用Q28和第二种四重重组株共感染导致装配和释放VLP，该VLP携带报道基因和聚合酶以及NP。转染的/感染的Sf9细胞的浓缩上清液转移给幼仓鼠肾细胞(BHK)单层上，孵育，用荧光素酶检验裂解缓冲液破碎细胞。感染细胞的裂解液标示的荧光素酶活性比未感染的对照细胞高70-700倍(图15)。
类似的，为了评估RNP形成和衣壳包装，合成了体外负义RNA模板，它编码反义朝向的绿色荧光蛋白(GFP)，侧接流感病毒NP末端的3’和5’保守和非编码区域。用体外产生的RNA转染Sf9昆虫细胞，随后用Q28和第二种四重重组株共感染导致装配和释放携带报道基因和聚合酶以及NP的VLP。当将转染的/感染的Sf9细胞的浓缩上清夜转移到MDCK细胞单层上时，检测到GFP的表达(图16)。
这些结果表明杆状病毒衍生的颗粒能衣壳包装RNP，它在原代转录作用中有功能，如荧光素酶和GFP表达所示。因此，VLP能装配和包装RNP，并进一步掺入和表达异源核苷酸序列。这种表达的异源序列包括但不局限于非流感病毒产生的异源部分，包括来自非流感病原性微生物的肽、多肽或蛋白质，如下所述。这些表达的异源序列还包括免疫调节剂，以提高和/或改变免疫应答。这些免疫调节剂包括但不局限于IL-12(Genetics Institute，Cambrige，MA)和GM-CSF(ImmunexCorp.，Seattle，WA)。进一步表达的异源序列还包括单克隆抗体，用作为靶向和/或治疗部分。
本发明的VLP用于配制免疫或药物组合物。要这样做，调节VLP到适合浓度，并用任何合适的佐剂、稀释剂或载体配制。生理上可接受的介质可用作载体和/或稀释剂。这些包括但不局限于水、合适的等渗介质、甘油、乙醇和其它常规溶剂、磷酸盐缓冲盐水等。合适的佐剂包括但不局限于磷酸铝、氢氧化铝、MPLTM(3-0-去乙酰一磷酰脂A；RIBI ImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，MT，现在是Corixa)、合成的脂类A类似物，例如529(Corixa)、StimulonTMQS-21(AquilaBiopharmaceuticals，Framingham，MA)。IL-12(Genetics Institute，Cambrige，MA)、合成的多核苷酸，例如含有CpG基序的寡核苷酸(美国专利号6,207,646(28))，大肠杆菌的热不稳定毒素和霍乱毒素(野生型或突变形式，例如在氨基酸29位的谷氨酸被另一种氨基酸，最好是组氨酸替换，根据出版的国际专利申请号WO 00/18434(29))。
在本发明的一个实施例中，含有VLP的制剂将用作免疫原性组合物。病毒可以与冷冻保护添加剂或稳定剂，例如蛋白质(例如清蛋白、明胶)、糖(例如蔗糖、乳糖、山梨醇)、氨基酸(例如谷氨酸钠)、盐水或其它保护剂混合。该混合物保持在液态，或然后干燥或冻干，便用于运输和储藏，并在施用前与水立即混合。
包括仅含流感病毒结构蛋白的VLP的制剂用于免疫人类或其它脊椎动物对象，以诱导对流感病毒感染的保护作用。因此，本发明还提供了免疫个体以诱导对流感病毒感染的保护方法，通过对个体施用有效免疫量的免疫原性组合物制剂，该组合物中掺有仅含流感病毒结构蛋白的如上所述产生的VLP。
含有含不同流感病毒亚型的表面糖蛋白的VLP制剂，例如来自一种亚型的HA和不同亚型的NA的制剂，是用稀释剂或载体配制成二价免疫原性组合物，用于免疫脊椎动物抵抗由这两种流感病毒亚型导致的感染。如上所述，当鉴定出抗原性变种时，HA和NA中的都每一个都可被替换。因此，按照上述方法很容易构建更新的嵌合VLP。
另外，通过产生一组来自感兴趣的各流感病毒株的VLP，以合适比例混合该组VLP，制备多价免疫原性组合物，并施用得到的免疫原性组合物。
本发明的制剂还含有VLP，此VLP中HA或NA的一部分或全部被不是流感病毒产生的异源部分替代，因此是嵌合VLP。这些部分包括但不局限于肽、多肽或蛋白质。当要替换仅一部分HA或NA时，编码HA或NA的重组DNA分子中的一部分DNA序列被编码非流感肽、多肽或蛋白质的DNA序列替换。当整条HA或NA要被替换时，用编码非流感肽、多肽或蛋白质的DNA序列替换编码HA或NA的重组DNA分子中的整条DNA序列。
另外，如上所述的不是由流感病毒产生的异源部分(或流感病毒节段例如编码为NP的节段)被掺入到VLP。这是通过共感染、共转染或其它共转化合适的宿主细胞达到的(a)一种或多种重组DNA分子，每一编码至少一种流感病毒结构蛋白，其中总是构建编码M1的重组DNA分子，和(b)一种编码异源部分(或流感病毒节段)的重组DNA分子，在允许所述至少一种流感病毒结构蛋白表达的条件下培养宿主细胞，从而使VLP在细胞内在至少一种流感病毒结构蛋白表达后装配，并从培养上清液中纯化VLP。异源部分(或流感蛋白)被掺入到VLP。
当这些非流感肽、多肽或蛋白来自病原性微生物，得到的嵌合VLP用稀释剂或载体配制成免疫原性组合物，用于免疫脊椎动物抵抗该病原性微生物(以及流感病毒)导致的感染。最典型的，嵌合VLP包含来自非流感病原性微生物的表面抗原。
这些非流感病原性微生物包括但不局限于来自感染人类或非人脊椎动物的病毒、细菌、真菌或寄生微生物。其它类型的非流感部分包括但不局限于来自癌细胞或肿瘤细胞的、单克隆抗体(例如用作，靶向和/或治疗部分)、过敏原、淀粉样肽蛋白质或其它大分子成分。
这些病毒的例子包括但不局限于人免疫缺陷病毒、猿免疫缺陷病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒1-3型、单纯疱疹病毒、人巨细胞病毒、甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、人乳头瘤病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、肾盏病毒(aliciriruses)、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、腺病毒、狂犬病病毒、犬瘟热病毒、牛瘟病毒、冠状病毒、细小病毒、感染性鼻气管炎病毒、猫白血病病毒、猫感染性腹膜炎病毒、禽感染性法氏囊病病毒、新城疫病毒、Marek氏病病毒、猪呼吸道和生殖综合征病毒、马动脉炎病毒和各种脑炎病毒。
这些细菌的例子包括但不局限于流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)(可定型或不可定型的)、睡眠嗜血菌(Haemophilus somnuus)、粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)，无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、屎链球菌(Streptococcus faecalis)、幽门螺杆菌(Helicobater pylori)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)、大肠杆菌(Echerichia coli)、志贺氏菌(Shigella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、白喉棒杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)-胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)复合物、奇异变形菌(Proteus mirabilis)、普通变形菌(Proteus vulgaris)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、溶血巴斯德氏菌(Pasteurella haemolytica)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)、大叶性肺炎放线菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)和鸡败血枝原体(Mycoplasma gallisepticum)。
这些真菌的例子包括但不局限于曲霉、芽生菌、念珠菌、环孢子菌、隐球菌和组织胞浆菌。
这些寄生虫的例子包括但不局限于硕大利什曼原虫(Leishmania major)、蛔虫、毛首线虫、贾第鞭毛虫、血吸虫、隐孢子虫、毛滴虫、鼠弓形虫(Toxoplasmagondii)和卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)。
这些癌细胞或肿瘤细胞的例子包括但不局限于前列腺特异性抗原、癌胚抗原、MUC-1、Her2、CA-125和MAGE-3。
这些过敏原的例子包括但不局限于美国专利号5,830,877(30)和国际专利申请号WO 99/51259(31)中所述的那些，它们在此引入以供参考，并包括花粉、昆虫毒液、动物毛皮垢屑、真菌孢子和药物(例如青霉素)。这些成分妨碍IgE抗体的产生，即一种已知的过敏反应的原因。
淀粉样肽蛋白(APP)与多种疾病有关，例如阿尔茨海默氏病、淀粉样变性或淀粉生成病。β-淀粉样肽(也称为Aβ肽)是APP的42个氨基酸片段，它是通过由β和γ分泌酶加工APP产生的，并具有下列序列Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln LysLeu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile IleGly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala(SEQ ID NO2)在一些病人中，淀粉样沉淀的形式是聚集的Aβ肽。惊人的是，现在已发现给予分离出的Aβ肽可诱导针对脊椎动物宿主中淀粉样沉淀的Aβ肽成分的免疫应答(32)。这些Aβ肽还已与不相关部分连接。因此，该发明的VLP包括代替流感病毒HA或NA一部分或全部表达该Aβ肽，以及Aβ肽的片段和对Aβ肽的抗体或其片段。Aβ肽的一个这样片段是28个氨基酸的肽，具有下列序列(33)Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln LysLeu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys(SEQ ID NO3)在合适剂量次数下足量上述免疫原性组合物给予个体，以引发免疫应答。本领域熟练技术人员能方便地确定这些量和剂量。给药可以通过任何常规有效形式，例如鼻内、胃肠外、口腔或局部用于任何粘膜表面，例如鼻内、口腔、眼、肺、阴道或直肠表面，例如通过气溶胶喷雾。给药的最优方法是通过鼻内给药。
这些非流感肽、多肽或蛋白质还可以是药物活性部分。这些部分包括但不局限于治疗性蛋白、生长因子、免疫调节剂、单克隆抗体以及上述与免疫原性组合物有关的部分。这些嵌合VLP用稀释剂或载体如上所述配制成药物组合物，并以有效量给药，用所述非流感肽、多肽或蛋白质治疗脊椎动物。有效量可以由本领域熟练技术人员方便的确定。
上述药物组合物还可以含有上述佐剂。
这些非流感肽、多肽或蛋白质还可以是用于受体-配体研究的受体或配体。例如，非流感糖蛋白包括在VLP中，它靶向特异性受体。
在所有这些免疫原性或药物组合物中，当施给脊椎动物宿主时，VLP能诱导免疫应答，但不能产生疾病症状，因为VLP不含遗传物质，不能在脊椎动物中复制。
本文引用的所有专利和出版物在此引入以供参考。
为了更好的理解本发明。列出了下列实施例。这些例子是仅为了说明的目的，而不是要限制本发明的范围。
实施例实施例1将流感M2基因克隆入杆状病毒转移载体pAcAB4用RT-PCR从被流感A/Udorn/72(H3N2)株感染的MDCK细胞中提取出的聚腺苷酸mRNA中分离出流感病毒M2基因，它是M1 mRNA的剪切产物。M2基因作为DNA插入物克隆入pGemT载体(Promega)，并用特异性引物，使用染料末端测序反应和自动ABI 377DNA测序仪(Applied Biosystems)测序。
用EagI限制性酶消化，从pGemT-M2质粒释放M2基因，并制备克隆入pAcAB4(PharMingen)杆状病毒转移载体。M2-DNA片段用DNA聚合酶(Klenow片段)填入，通过与T4 DNA连接酶的连接将BglII接头掺入末端。所有酶和接头获自NewEngland Biolabs(NEB)。然后用BglII消化转移载体pAcAB4，并用胎牛小肠碱性磷酸酶(CIP)处理。然后凝胶纯化(Qiagen)M2插入物，并以3∶1的比例连接入转移载体。用限制性分析筛选阳性克隆，从100毫升大肠杆菌培养物中使用Qiagen质粒纯化试剂盒制备质粒DNA。该构建物现在称作pAcAB4/M2。
实施例2中间(“穿梭”)载体的构建由于便利的限制性位点数量对将流感基因克隆入转移载体pAcAB4的限制，产生了穿梭克隆载体，携带三种杆状病毒启动子(两个多角体和一个p10)，侧接通过PCR加上的新限制性位点。该穿梭质粒如下构建用SmaI消化pAcAB4M2(来自实施例1)，分成两个样品。一个pAcAB4/M2-SmaI样品用XbaI消化，它释放400核苷酸长的DNA片段。该DNA用凝胶纯化，并通过PCR用两个引物扩增，其中一个在掺入PmeI(斜体)和NotI(下划线)位点最终产物的一个末端5’GTTTAAACGCGGCCGCCGTATTTATAGGTTTTTTTATTA 3′(SEQ ID NO4)5′TTTTATTACTAGTCCCGGGGATCTGTGATTGTAAAT 3′(SEQ ID NO5)用BamHI消化其它pAcAB4/M2-SmaI样品，凝胶纯化释放的SmaI/BamHI DNA片段，并用两个引物PCR扩增，其中一个掺入在最终PCR产物SacI(斜体)和NheI(下划线)位点5′AAGAGCTCGCTAGCGTATTTATAGGTTTTTTTATTA 3′(SEQ ID NO6)5′ACAATCACAGATCCCCGGGACTAGTAATAAAACCTAGA 3′(SEQ ID NO7)这两种PCR产物在未修饰的末端重叠，用于另一个PCR反应，该反应使用两个对于新掺入的限制性酶位点特异性的外部引物5′GTTTAAACGCGGCCGCCG 3′(SEQ ID NO8)5′AAGAGCTCGCTAGCGTA 3′(SEQ ID NO9)然后用SacI/PmeI消化该PCR DNA。pNEB193质粒(Promega)也用SacI/PmeI消化，并将已消化的PCR DNA用T4连接酶连接。最终该得到的pNEB193穿梭载体携带含有两个多角体启动子和一个p10启动子的DNA片段，侧接用于随后克隆流感病毒基因HA、NA和M1的新限制性位点。
实施例3
将流感HA、NA和M1基因克隆入穿梭载体用RT-PCR从流感病毒A/Udorn/72(H3N2)的纯化的基因组RNA回收流感基因HA、NA和基质(M1)。全部三种基因作为DNA插入物克隆入pGemT或pGemTeasy载体(Promega)，并使用染料末端测序反应和自动ABI 377 DNA测序仪用特异性引物测序。用Strategene的Quikchange试剂盒(pGT-M1剪切)突变两个M1基因的5′末端供体剪切位点，来防止宿主细胞中M1 mRNA的可能剪切。
分三步将这三种基因克隆入穿梭载体1)M1基因的克隆用pGemT/M1(剪切)质粒(携带M1基因的pGemT)在带5′和3′引物作为PCR反应的模板，在扩增的DNA中分别引入NheI和SacI位点。然后用NheI/SacI消化该PCR DNA，并用凝胶纯化。类似的，用NheI/SacI消化pNEB193穿梭载体并纯化。连接穿梭载体和插入物(M1 PCR)，并在转染后在大肠杆菌中扩增。用Bigdye(Perkin Elmer)测序M1基因。M1基因位于多角体启动子下游。得到的质粒称为pNEB193N1。
2)HA基因的克隆用SacII消化pGemT/HA质粒(携带HA基因的pGemT，)，并填充末端。连接NotI接头在要消化的DNA上。然后用NotI消化DNA，从而释放HA插入物，在两侧都具有NotI位点。用NotI消化质粒pNEBl93M1，用胎牛小肠磷酸酶(CIP)处理，用T4连接酶(不定向)连接HA插入物。用PCR确定HA基因的朝向，该基因在多角体启动子的转录控制下。得到的质粒称为pNEBl93M1/HA。
3)NA基因的克隆首先用SacII消化质粒pGemT/NA3B(携带NA基因的pGemT)，并用T4 DNA聚合酶末端填充。随后，通过用SpeI消化NA基因，并用Klenow填充，NA插入物钝端连接。接着，用SmaI消化pNEB193M1/HA，NA插入物钝端连接。用PCR鉴定携带正确朝向的NA基因的克隆。NA基因位于p10启动子下游。得到的质粒称为得到的质粒称为pNEB193M1/HA/NA。
实施例4含有流感病毒基因M2、M1、HA和NA的转移载体的构建在完成实施例3的过程后，pNEB193M1/HA/NA穿梭载体含有位于杆状病毒启动子的转录调节控制下的M1、HA和NA基因。为了释放这三种基因作为单一条DNA，用PmeI/SacI消化穿梭载体。该DNA片段与实施例1的pAcAB4M2(已含有M2基因)连接，它已如下修饰在pAcAB4/M2中引入新限制性位点，以促使从穿梭载体克隆出含有这三种基因的DNA片段。然后用XbaI消化该pAcAB4/M2质粒，用DNA聚合酶(Klenow片段)末端填充，并用T4 DNA连接酶加上PmeI接头。然后用PmeI消化该DNA，并重新连接重新产生PmeI位点。类似的，用BamHI消化重新连接的质粒，用DNA聚合酶(Klenow)填充，并用T4连接酶附上SacI接头。随后用SacI消化，并连接恢复SacI位点。得到的pAcAB4/M2载体具有两个新的位点PmeI和SacI。制备载体用于通过用PmeI/SacI消化和凝胶纯化，插入额外的流感基因。所有连接都进行测序，以确定在pNEB193克隆中未引入突变。得到的构建物称为HA/Q(见图1)，它是携带4种流感基因的转移载体(pAcAB4/M2/M1/HA/NA)。
实施例5嵌合转移载体的产生用G基因3′和5′末端的特异性引物(5′AACAGAGATCGATCTGT 3′(SEQ IDNO10)和5′CATAAAAATTAAAAATTAAAATATAATTAAGG 3′(SEQ ID NO11))从VSV通过RT-PCR病毒RNA回收VSV G蛋白的编码序列，并克隆入pGemT质粒(Promega)。得到的pGemT-VSV克隆用SacII消化，用T4 DNA聚合酶补成钝端。然后用SpeI消化并用Klenow补成钝端。用T4连接酶加上NotI接头，然后用NotI重新消化。随后，将VSV G编码序列连接入用NotI消化的Q28载体，以除去HA基因。用PCR和测序确定基因的朝向。该构建物称为转移载体VSV-G。
在另一个实施例中，插入了仅一部分VSV G基因。用PCR方法产生了包含G蛋白外功能域与在HA跨膜(29个氨基酸)和胞质(14个氨基酸)的结构域的框架中融合的嵌合基因如下(见图2)从pGemT-HA克隆通过PCR扩增出流感HA基因的跨膜域和胞质尾，并用凝胶纯化。还用PCR扩增出VSV G基因的胞外域并凝胶纯化。在使用Pfu DNA聚合酶，(Stratagene，LaJolla，CA)PCR反应中都用这些DNA片段作为模板，使用对应于VSV G基因的5′末端和HA基因的3′末端的引物。凝胶纯化1620bp的DNA片段，NotI接头用T4接连酶加上，然后用NotI消化。该插入物连接入HA/Q载体，它已经用NotI消化以除去HA基因。得到的构建物产生转移载体VSV G/HA(嵌合体)。
实施例6四重杆状病毒重组株在昆虫细胞中的转染将Sf9细胞ATCC CRL 1711以2×106细胞/皿的密度接种在60mm培养皿中。将约2微克HA/Q转移载体与0.5微克线性BaculoGold DNA(PharMingen)混合，用BaculoGold转染试剂盒(PharMingen)用该DNA转染Sf9细胞。挑选重组杆状病毒，用三轮噬斑纯化纯化。一株这样的噬斑纯化的重组株被称为HA/Q28，挑选用于进一步研究。
另外，携带全长VSV-G或VSV-G/HA(嵌合体)的四重转移载体DNA与线性BaculoGold DNA转染入如上所述的Sf9细胞，以产生重组VSV-G/Q和VSV-G/HA/Q。如上所述挑选重组病毒中的HA/Q28。全部重组株在Sf9细胞中扩增到7×107pfu/ml的滴度。
实施例7Sf9昆虫细胞的生长和用杆状病毒重组株的感染在无血清培养基中悬浮培养全部Sf9细胞培养物。以感染复数(MOI)为5的杆状病毒重组株进行感染。重组病毒以小体积接种在细胞单层中，在室温下吸附30分钟，然后在加入无血清新鲜培养基后28℃培养。除非另外说明，感染后72小时收集细胞和培养基，用于随后分析蛋白的表达和VLP的形成。
实施例8单个流感基因克隆入转移载体pBlueBac4.5并产生单一杆状病毒重组株先前将流感A/Udorn的M1基因克隆入pGemT(pGT-M1剪切，见上文实施例1)。为了亚克隆M1基因，用SacII消化pGT-M1，用T4 DNA聚合酶钝端修平，用T4连接酶在末端加上SacI接头。然后用SacI/SalI消化质粒，凝胶纯化释放的M1。插入物连接入pBlueBac4.5(Invitrogen)，它已用SacI/SalI消化，用连接混合物转化DH5c细胞。
为了将HA基因亚克隆入pBlueBac4.5，用SalI消化pGemT/HA(见上文实施例3)，并用T4 DNA聚合酶钝端修平。然后重新用SalI消化DNA，除去插入物并凝胶纯化。HA插入物与NheI(钝端)/SalI消化的pBlueBac4.5连接，用连接混合物转化STBL2感受态大肠杆菌细胞。
用SacII消化pGemT-NA(见上文实施例3)，并用T4 DNA聚合酶钝端修平。然后用SpeI消化该DNA，并凝胶纯化。插入物连接入用已NheI/SmaI消化的pBlueBac4.5载体，并转化STBL2感受态大肠杆菌细胞。
当通过测序发现转移载体DNA是正确的时，用5微克每一pBlueBac克隆和10微克Bac&Blue DNA(Invitrogen)转染Sf9细胞。通过脂质体介导的转染用这些DNA共转染Sf9细胞。培养细胞5天，上清液噬斑纯化。长出单一个蓝色噬斑，在Sf9细胞中扩增，并用蛋白质印迹评估蛋白表达。如Galarza等所述的构建了在该工作中所用的NP杆状病毒重组株(含有流感NP基因)。
实施例9免疫印迹分析用蛋白质印迹用于鉴定感染的Sf9细胞中的蛋白质，浓缩上清液和梯度组分。将样品在10％SDS-PAGE凝胶(除非另外说明)中被解析，转移到硝基纤维素膜上。在含有5％脱脂牛奶和0.1％的Tween-20的TBS溶液(tris缓冲盐水)中封闭印迹，随后用针对流感HA、M1(基质)和M2蛋白的单克隆抗体混合物探测。从RocheMolecular Biochemicals(Indianapolis，IN)获得小鼠单克隆抗-HA(克隆12CA5)。小鼠单克隆抗体抗-M1(克隆GA2B)来自Serotec(Raleigh，NC)。小鼠单克隆抗体抗-M2来自Mt.sinai杂交瘤中心(New York，NY)。在蛋白质印迹上用碱性磷酸酶偶联的抗小鼠IgG二抗(Promega)使抗原可视化。以相似方式进行分析被单基因杆状病毒重组株的单、双或三组合感染的Sf9细胞中的VLP形成。用小鼠单克隆抗-G抗体(克隆P5D4，Roche Molecular Biochemicals)与对流感M1和M2蛋白的抗体联合，探测分析含有VSV G蛋白的样品。结果如图3所示。
实施例10感染的Sf9细胞的免疫荧光Sf9细胞在8方室(盒式培养物)中生长，并用四重或单一基因杆状病毒重组株以1MOI感染。在感染后72小时，用甲醇/丙酮(2∶1)或3％对甲醛固定单个盒中的Sf9细胞。作为封闭步骤，固定的细胞在含有3％牛血清清蛋白(BSA)的磷酸缓冲盐水(PBS)中室温孵育30分钟。随后每片载玻片用一抗和二抗溶液依次孵育。用大鼠抗-HA(Roche Molecular Biochemicals)/小鼠抗-M1单克隆(见实施例9)抗体(如最初，1∶100稀释)的组合和山羊抗-大鼠罗丹明偶联(Molecular Probes)/绵羊抗-小鼠FITC偶联(Sigma)抗体(作为二抗)检测HA和M1的表达。用大鼠单克隆抗-HA/家兔抗-NA肽(Research Genetics定制)(如最初，1∶100稀释)的组合和山羊抗-大鼠罗丹明偶联(Sigma)(Molecular Probes)/绵羊抗-家兔FITC偶联(Sigma)抗体(作为二抗)检测NA和HA的表达。作为罗丹明的替代品，可使用Cy3偶联的山羊抗大鼠(Sigma)抗体。各抗体反应在室温保温30分钟，在步骤之间，用PBS漂洗载玻片三次。当在495nm和552nm的波长激发时，FITC和罗丹明分子分别发射绿光和红光，这可由合适的滤色片分辨。免疫荧光分析的结果如图4-7所示。
实施例11流感病毒VLP的纯化以7.5×107细胞/150cm2组织培养瓶的密度接种Sf9细胞，并使其在室温放置30分钟。用杆状病毒重组株(HA/Q28，VSV-G/Q，VSV-G/HA/Q嵌合体或单个重组株)以5MOI感染细胞，并在28℃进行感染72小时。当完成时，收集培养基并进行低速离心(4℃，20分钟，2000xg)。然后通过在200000xg旋转90分钟沉淀。根据最初感染的细胞数目，将得到的沉淀重悬浮在50或500微升的1X PBS中，通过简单超声匀浆，然后装在碘克沙醇(Optiprep，Nycomed/Sigma)梯度(密度1.08g/ml-1.32g/ml)顶部。梯度在20000xg旋转3.5小时，并用U形毛细管从试管底部按重力收集组分。SDS-PAGE后用蛋白质印迹分析分析这些组分的等份。图8和9显示了蛋白质印迹。为了进一步纯化颗粒，含有VLP的片段进行第二次蔗糖梯度离心。对于蔗糖平衡梯度离心，用PBS透析先前所选的组分，并铺在20-60％(wt/wt)蔗糖(于NTE)梯度中，4℃，150000xg离心22小时。离心后，从试管底部如上所述收集0.5ml组分，SDS-PAGE后蛋白质印迹分析。
然后用电子显微镜和免疫金标记检测含有VLP的组分(见实施例12)。
实施例12电子显微镜负染色和免疫金标记为了负染色和免疫金标记，VLP从培养上清液浓缩，并用两个连续密度梯度离心纯化(见实施例11)。样品的等份置于新鲜辉光放电的塑料/碳-包裹的网格上，用几滴蒸馏水温和洗涤，用2％磷酸钨酸钠，pH6.5负染色，并用电子显微镜观察。负染色的流感VLP的电子照片如图10所示。
预先将修饰VLP的表面抗原免疫金标记的样品在0.5％对戊二醛中固定5分钟，置于上述网格上，用几滴蒸馏水洗涤。随后，它们依次面朝下在100微升体积的下列溶液顶部保温，下列溶液用PBS-1％BSA稀释的一抗，30分钟；用PBS-1％BSA三次，每次5分钟；用针对小鼠IgG以PBS-1％BSA(1∶10)稀释的抗体包裹的金球悬液，，30分钟；用PBS-1％BSA三次，每次5分钟。最后，用几滴蒸馏水洗涤，用2％醋酸铀酰染色，风干并在电镜下检测。
图11描述了用抗-HA或抗-NA单克隆抗体探测的免疫金标记的流感VLP的电子显微镜照片，并用与抗小鼠IgG偶联的金球复染色。
实施例13流感核蛋白(NP)掺入VLP用任一HA/Q28和NP或NP和M1单一杆状病毒重组物共感染Sf9细胞。根据实施例11纯化共感染细胞的浓缩上清液。图9B描述了这些共感染细胞表达的，都含有HA和NP的组分的蛋白质印迹。图8C描述了这些共感染细胞表达的含NP和M1的组分的蛋白质印迹。
实施例14
VLP在小鼠中的免疫原性通过肌肉内途径用HA/Q28 VLP(约1微克HA)或VSV-G/Q VLP(约1微克G)免疫两组Balb/c小鼠(4-5周龄)，其中各组VLP用磷酸铝(200微克/剂量)配制。各组中的全部小鼠接受一次最初注射和隔两周接受两次增强注射。最后一次免疫2周后，获得血样并用蛋白质印迹(对于两类VLP)，血凝素抑制试验(IHA)(对于HA/Q28)和血清中和试验(对于VSV-G/Q)评估针对相应抗原的抗体存在。图12(对于HA/Q28)和图13(对于VSV-G/Q)描述了蛋白质印迹。在IHA单元(IHAU)中测量IHA滴度，如下首次实验的小鼠 32IHAU*阳性对照[流感A/Hong Kong] 128IHAUHA/Q28合并的血清 96IHAU*首次实验的小鼠显示抑制滴度，可能是由于非特异性凝集素引起的。所有样品用高岭土处理，并在56℃加热30分钟，使得灭活非特异性抑制剂和/或非特异性凝集素。
对于血清中和试验，将用VSV-G/Q免疫的小鼠血清的递增稀释物置于含有VSV的细胞单层顶部，孵育和分析抑制病毒的能力，如通过防止细胞单层中形成任何噬斑所示。发现高达1/64稀释的血清完全中和VSV的标准滴度(1×106PFU/ml)。
实施例15核糖核蛋白复合物(RNP)包装入流感VLP和报道基因的表达聚合酶(亚基PB1、PB2和PA)和NP杆状病毒构建物(四重转移载体重组株)将编码聚合酶亚基(PB1、PB2和PA蛋白)以及流感病毒A/Udorn/72(H3N2)株核蛋白NP的三个基因亚克隆入单一个杆状病毒转移载体PAcAB4。PB1和PA基因以相反方向位于杆状病毒多角体启动子的转录控制下，而PB2和NP基因也以相反方向位于杆状病毒p10启动子的转录控制下。用携带聚合酶基因和NP的纯化的转移载体DNA，以及线性基因组的杆状病毒DNA共感染Sf9昆虫细胞，使得同源重组。这导致聚合酶和NP基因转移入杆状病毒DNA。该胞内重组事件产生释放入培养基的四重杆状病毒重组株(图14)。进行三次连续噬斑纯化/扩增步骤，以选择四重杆状病毒转移载体重组株。进行用基因特异性引物的PCR，以确认纯化的四重重组株中的4个基因的存在。用抗-PB1、抗-PB2、抗-PA和抗-NP特异性多克隆抗体进行蛋白质印迹试验，评估三种聚合酶亚基和NP的表达(数据未显示)。
报道基因构建物产生了含有荧光素酶或绿色荧光蛋白(GFP)基因的DNA质粒，侧接流感病毒的保守3′和5′末端。这些序列是野生型病毒感染中转录/复制和包装流感病毒基因组所需的。除了保守序列，精确3′和5′末端是功能性基因组必需的。为了获得这些精确末端，在流感序列的5′末端加入改变的T7启动子；然后，用T7 RNA聚合酶在RNA转录物中产生精确的5′末端。另外，工程改造流感序列在3′末端的BsaI限制性位点。用该限制酶消化质粒，产生具有5′突出物的DNA模板，它在失控T7聚合酶转录反应中，产生具有精确流感3′末端的RNA分子。然后用这些模型流感报道基因用于研究聚合酶活性、RNA衣壳包装，并将RNA包装入流感病毒-样颗粒。
荧光素酶报道基因的VLP包装同时用Q28(HA、NA、M1、M2)和四重转移物(PB1、PB2、PA、NP)载体杆状病毒重组株以5MOI感染Sf9感染细胞。感染进行48小时，此时，用LT1感染试剂(Panvera，Madison，WI)将含有反向的荧光素酶基因，通过侧接流感病毒基因组的3′和5′末端序列的30微克体外合成的RNA感染入Sf9细胞。再培养感染的/感染的细胞24小时。然后收集培养上清液，慢速离心澄清，2000xg离心2小时浓缩VLP。VLP重新悬浮在培养基中，并涂到新的幼仓鼠肾细胞(BHK)的单层上。培养48小时后，用荧光素酶试验裂解缓冲液破碎BHK细胞，测量细胞提取物中的荧光素酶活性。用荧光计在未感染的BHK细胞(对照)中确定背景荧光素酶活性，读数是50-500相对发光值(RLUs)。VLP-感染的BHK细胞的裂解液确定了36,000RLUs(图15)的荧光素酶活性读数(图15)。
绿色荧光蛋白(GFP)报道基因的VLP包装用绿色荧光蛋白基因(GFP)作为报道子进行了类似的RNP包装成VLP的实验。根据上述参数感染/感染Sf9昆虫细胞。构建感染的RNA分子，该分子含有反义方向的GFP编码序列，侧接流感病毒RNA的3′和5′末端。用VLP感染BHK细胞和MDCK细胞24小时，然后用Zeiss显微镜和异硫氰酸荧光素(FITC)滤色片监测GFP的表达。存在少量绿色细胞，提示VLP能够转移GFP基因，从而导致绿色荧光蛋白的表达(图16)。
序列表序列表<110>美国氰胺公司(American Cyanamid Company)<120>野生型和嵌合流感病毒样颗粒(VLP)的装配<130>AM100288PCT<140><141><150>60/213,656<151>2000-06-23<150>60/284,411<151>2001-04-17<160>11<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>71<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述水疱性口炎病毒G蛋白和流感HA蛋白的嵌合部分<400>1Gly Glu Thr Leu Phe Phe Gly Asp Thr Gly Leu Ser Lys Asn Pro Ile1 5 10 15Glu Phe Val Glu Gly Trp Phe Ser Ser Trp Lys Ser Lys Ser Gly Tyr20 25 30Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu35 40 45Cys Val Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn50 55 60Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile65 70<210>2<211>42<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人淀粉样肽蛋白的氨基酸1-42<400>2Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala35 40<210>3<211>28<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人淀粉样肽蛋白的氨基酸1-28<400>3Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys20 25<210>4<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>4gtttaaacgc ggccgccgta tttataggtt tttttatta39<210>5<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>5ttttattact agtcccgggg atctgtgatt gtaaat 36<210>6<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>6aagagctcgc tagcgtattt ataggttttt ttatta 36<210>7<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>7acaatcacag atccccggga ctagtaataa aacctaga 38<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>8gtttaaacgc ggccgccg 18<210>9<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>9aagagctcgc tagcgta17<210>10<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>10aacagagatc gatctgt17<210>11<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>11cataaaaatt aaaaattaaa atataattaa gg 3权利要求
1.一种流感病毒样颗粒的生产方法，其特征在于，所述方法包括步骤i)构建一种或多种重组DNA分子，它们分别编码至少一种流感病毒结构蛋白，其中总是构建编码基质蛋白的重组DNA分子；ii)用所述一种或多种重组DNA分子转染，感染或转化合适的宿主细胞，在允许所述至少一种流感病毒结构蛋白表达的条件下培养宿主细胞，从而在至少一种流感病毒结构蛋白表达后在细胞内装配病毒样颗粒；和iii)从培养上清液纯化病毒样颗粒。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒样颗粒含有M1加上至少一种选自血凝素、神经氨酸酶(NA)和M2的流感结构蛋白。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，HA和NA来自不同的流感病毒亚型。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在重组DNA分子中编码HA或NA的至少一部分或全部DNA序列，被编码不是由流感病毒产生的分子的DNA序列替换，从而产生嵌合的病毒样颗粒。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述重组DNA分子中编码HA的DNA序列被编码水疱性口炎病毒的G蛋白的DNA序列替换。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，一个重组DNA分子中编码HA的跨膜域和胞质域的DNA序列，但HA剩余的编码区被编码水疱性口炎病毒的G蛋白胞外域的DNA序列替换。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括用编码流感蛋白的重组DNA分子共转染、共感染或共转化宿主细胞，从而使流感蛋白掺入病毒样颗粒。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，重组DNA分子编码流感病毒核衣壳蛋白。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括用编码不是由流感病毒产生的分子的重组DNA分子共转染、共感染或共转化宿主细胞，从而使非流感病毒分子掺入病毒样颗粒。
10.含有至少一种流感病毒结构蛋白的流感病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒样颗粒总是含有M1。
11.如权利要求10所述的流感病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒样颗粒还含有至少一种选自HA、NA和M2的流感结构蛋白。
12.如权利要求11所述的流感病毒样颗粒，其特征在于，HA和NA来自不同的流感病毒亚型。
13.如权利要求10所述的流感病毒样颗粒，其特征在于，HA或NA的至少一部分或全部被编码不是流感病毒产生的分子替换，从而含有嵌合的病毒样颗粒。
14.如权利要求13所述的嵌合病毒样颗粒，其特征在于，所述一部分或全部HA或NA被病原性微生物产生的肽、多肽或蛋白取代。
15.如权利要求14所述的嵌合病毒样颗粒，其特征在于，所述HA被VSV的G蛋白取代。
16.如权利要求14所述的嵌合病毒样颗粒，其特征在于，HA的跨膜域和胞质域存在，但HA剩余的编码区被编码VSV的G蛋白胞外域替换。
17.如权利要求10所述的流感病毒样颗粒，其特征在于，流感蛋白被掺入病毒样颗粒。
18.如权利要求17所述的流感病毒样颗粒，其特征在于，掺入病毒样颗粒的流感蛋白是NP。
19.如权利要求10所述的流感病毒样颗粒，其特征在于，所述不是由流感病毒产生的分子被掺入病毒样颗粒。
20.一种免疫原性组合物，其特征在于，该组合物含有权利要求10所述的病毒样颗粒和稀释剂或载体。
21.如权利要求20所述的免疫原性组合物，其特征在于，该组合物还含有佐剂。
22.一种免疫原性组合物，其特征在于，该组合物含有权利要求11所述的病毒样颗粒和稀释剂或载体。
23.如权利要求22所述的免疫原性组合物，其特征在于，该组合物还含有佐剂。
24.一种药物组合物，其特征在于，该组合物含有权利要求13所述的病毒样颗粒和稀释剂或载体。
25.如权利要求24所述的药物组合物，其特征在于，该组合物还含有佐剂。
26.一种免疫原性组合物，其特征在于，该组合物含有权利要求14所述的病毒样颗粒和稀释剂或载体。
27.如权利要求26所述的免疫原性组合物，其特征在于，该组合物还含有佐剂。
28.一种免疫原性组合物，其特征在于，该组合物含有权利要求17所述的病毒样颗粒和稀释剂或载体。
29.如权利要求28所述的免疫原性组合物，其特征在于，该组合物还含有佐剂。
30.一种免疫原性组合物，其特征在于，该组合物含有权利要求19所述的病毒样颗粒和稀释剂或载体。
31.如权利要求30所述的免疫原性组合物，其特征在于，该组合物还含有佐剂。
32.一种药物组合物，其特征在于，该组合物含有权利要求19所述的病毒样颗粒和稀释剂或载体。
33.如权利要求32所述的药物组合物，其特征在于，该组合物还含有佐剂。
34.一种免疫抵抗流感病毒导致的感染的方法，其特征在于，该方法包括施给脊椎动物权利要求20所述的免疫原性组合物。
35.一种免疫抵抗流感病毒导致的感染的方法，其特征在于，该方法包括施给脊椎动物权利要求22所述的免疫原性组合物。
36.一种免疫抵抗流感病毒以外的病原性微生物导致的感染的方法，其特征在于，该方法包括施给脊椎动物权利要求26所述的免疫原性组合物。
37.一种免疫抵抗流感病毒以外的病原性微生物导致的感染的方法，其特征在于，该方法包括施给脊椎动物权利要求30所述的免疫原性组合物。
38.一种治疗方法，其特征在于，该方法包括施给脊椎动物有效量的权利要求24所述的药物组合物。
39.一种治疗方法，其特征在于，该方法包括施给脊椎动物有效量的权利要求32所述的药物组合物。
40.一种被编码流感病毒M1、M2、HA和NA蛋白的重组DNA分子转染、感染或转化的宿主细胞。
41.如权利要求40所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞还被编码流感病毒聚合酶亚基PA、PB1和PB2和流感病毒核蛋白NP的第二种重组DNA分子转染、感染或转化。
42.如权利要求41所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞还被异源核苷酸序列转染、感染或转化。
43.如权利要求42所述的宿主细胞，其特征在于，所述异源核苷酸序列在表达后不是由流感病毒所产生的分子。
44.流感病毒样颗粒，其特征在于，所述流感病毒样颗粒装配和包装核糖核蛋白复合物。
45.如权利要求44所述的流感病毒样颗粒，其特征在于，该病毒样颗粒还表达异源核苷酸序列。
46.如权利要求45所述的流感病毒样颗粒，其特征在于，该异源核苷酸序列在表达后不是由流感病毒产生的分子。
全文摘要
描述了含有结构蛋白HA、NA、M1和M2的流感病毒样颗粒(VLP)。也产生仅含M1的VLP，带有M1和任何一种或两种HA、NA和M2的VLP。还描述了来自一种流感亚型HA和不同流感亚型NA的VLP，还描述了其中HA或NA的一部分或全部被不是由流感病毒产生的异源部分替换的VLP，即包含嵌合VLP。
文档编号A61K39/39GK1437655SQ01811643
公开日2003年8月20日 申请日期2001年6月21日 优先权日2000年6月23日
发明者J·M·加拉尔萨, T·E·莱瑟姆 申请人:美国氰胺公司