一种基于香豆素树状体的荧光免疫层析条及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种免疫层析条及其制备方法和用途，特别涉及一种用于检测甲型流 感病毒的基于香豆素树状体的荧光免疫层析条及其制备方法和用途。本发明属于生物技术 领域。
【背景技术】
[0002] 流感病毒依据核蛋白（NP)抗原性分为甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病 毒。甲型流感病毒是导致人、动物传染性呼吸道疾病的主要病原。HlNl流感病毒或称为猪 流感病毒，是由人流感病毒和猪流感病毒基因重组产生，在世界各地爆发流行。人感染禽流 感病毒非常罕见，在人接触感染禽后引起禽流感病毒（如H5NUH7N9或H9N2)感染，会引起 呼吸道疾病症状甚至死亡。
[0003] 甲型流感病毒跨越种属障碍在人-动物之间传播，引起流感大流行，对人和动物 健康产生了严重影响，因此对于甲型流感病毒的检测非常有必要。通过至少3种甲型流感 病毒主要亚型病毒（H5、H7、H9)定期筛选人-禽甲型流感病毒，对感染急性期快速检测流感 病毒的存在，及时临床治疗和应急防控意义非凡。
[0004] 目前流感病毒的检测方法有病毒培养、酶联免疫吸附（ELISA)、荧光免疫以及多聚 酶链扩增技术，这些技术多用于医院和实验室，需要培训有素的技术人员和精密的实验室 仪器。检测速度快、方便携带、容易操控、抗体的免疫学方法常被许多医院实验室、应急防治 部门使用。以流感病毒核蛋白为检测靶点的快速流感诊断检测（RIDTs)也广泛在临床实践 中应用。这些方法具有低廉、不需细胞培养、容易床旁或现场立即使用的优点，但由于常规 RIDTs检测在检测甲型流感病毒时，常常会由于对病毒的敏感性不同导致在自动读板仪和 可视观察中约有2. 2%的检测结果不一致，因此RIDTs在作为流感病毒筛选工具使用受到 限制。
[0005] 为进一步改善甲型流感病毒检测的灵敏性，以磁性圆珠、纳米颗粒、荧光为基础的 检测系统不断出现，但在整合到快速筛选的高级方法中时以及在现场使用和床旁检验中面 临多处挑战。而在这些方法中，荧光材料是甲型流感病毒检测中非常出色的标记物。
[0006] 香豆素树状体是一种新的荧光材料，可被光散二极管（LEDs)激活，在荧光酶联免 疫吸附检测诊断中具有潜在的应用价值和良好操作性。
[0007] 在本发明中，香豆素树状体被整合到甲型流感病毒含量丰富的核蛋白（NP)的单 克隆抗体上，同时偶联乳胶圆珠，进而制成了一种基于香豆素树状体的荧光免疫层析条并 建立了高度敏感的焚光免疫层析条检测法（fluorescent immunochromatographic strip test asssay，FICT)。通过LED-为基础的便携式条读数计即可检测禽和人甲型流感病毒的 存在，该高度灵敏的诊断系统可检测定到纳米级含量的流感病毒。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题是提供一种新的用于甲型流感病毒快速检测的方法。
[0009] 为达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
[0010] 本发明的一种基于香豆素树状体的荧光免疫层析条，其特征在于，所述层析条按 照连接顺序依次包括样品衬垫，结合衬垫，醋酸纤维素膜，吸水纸及位于下方的作为组装平 台使用的PVC底板，所述醋酸纤维素膜与结合衬垫之间有搭接，所述结合衬垫吸附有表面 吸附甲型流感病毒核蛋白单抗以及香豆素树状体的乳胶圆珠；
[0011] 其中，所述的醋酸纤维素膜上有羊抗鼠 IgG多克隆抗体包被的质控线，以及甲型 流感病毒核蛋白另一单抗包被的检测线，样品衬垫提供了待测样品加入的位置；
[0012] 其中，所述的香豆素树状体的结构如以下结构式所示：
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[0014] 在本发明中，结合衬垫表面吸附的单抗与检测线包被的单抗分别识别甲型流感病 毒核蛋白的不同抗原表位。
[0015] 在本发明的一个具体实施例中，表面吸附甲型流感病毒核蛋白单抗以及香豆素树 状体的乳胶圆珠可通过以下方法制备的：
[0016] (1)将0· 8ml直径20nm的乳胶圆珠用0· 8ml pH 8. 5的0· IM碳酸氢钠溶液以及 pH 7. 4的PBS先后分别洗涤3次，短暂离心，弃上清；
[0017] ⑵沉淀中加入0· 8ml pH 8. 5的(λ IM碳酸氢钠溶液，再加入128 μ L溶于DMSO的 浓度为lmg/mL香豆素树状体溶液，室温摇动1小时，得到结合香豆素树状体的乳胶圆珠；
[0018] (3)将结合香豆素树状体的乳胶圆珠用PBS洗涤2次，短暂离心，弃上清，沉淀用 0. 8ml含lmg/mL的甲型流感病毒核蛋白单抗溶液重悬，4°C孵育1小时；
[0019] (4)缓慢加入0. 5mL戊二醛溶液，涡旋1分钟，4°C孵育2小时；
[0020] (5)用PBS洗涤2次，短暂离心，弃上清，沉淀用ImL 0. 1%牛血清白蛋白溶液重 悬，4°C保存备用。
[0021] 在碳酸氢钠缓冲液（pH 8. 5)中，香豆素树状体的N-羟基琥珀酰亚胺 (N-hydroxysuccinimide (NHS))醚和乳胶表面的第一氨基团（-NH2)反应形成稳定的酰胺 健，释放NHS。亲水性戊二醛羧基（-C00H)和抗体的氨基（-NH2)结合形成氨基健。在乳胶 上的结合单克隆抗体用高速离心纯化并洗涤。
[0022] 在本发明中，香豆素树状体被整合到乳胶圆珠上，同时偶联甲型流感病毒核蛋白 (NP)的单抗，然后将表面吸附甲型流感病毒核蛋白单抗以及香豆素树状体的乳胶圆珠吸 附在结合衬垫上，羊抗鼠 IgG多克隆抗体以及甲型流感病毒核蛋白另一单抗分别包被在 醋酸纤维膜上形成质控线（控制区（C区））和检测线（检测区（T区）），最后制成了一 种基于香豆素树状体的荧光免疫层析条，同时建立了高度敏感的荧光免疫层析条检测法 (fluorescent immunochromatographic strip test asssay，FICT)。在检测区甲流病毒单 抗包被处，如无目标NP抗原，乳胶结合物将在检测区不能和单抗反应。如有甲流病毒NP抗 原，将形成甲流核蛋白NP-单抗-香豆素树状体-乳胶圆珠结合物，然后该结合物沿膜横向 流动，因为结合有甲流核蛋白NP抗原，结合物将与检测线上的单抗发生抗原抗体反应而停 留于检测区，最后香豆素树状体的荧光密度用光散二极管为基础的便携式读数计检测。读 数计中过滤激发荧光长波散发，变成广谱荧光散发特异区间，散发荧光。在控制区，羊抗鼠 IgG多克隆抗体识别乳胶表面甲流病毒NP单抗，可检验每次检测的有效性。检测区（T)和 控制区（C)荧光密度比例可转换成检测样本中的病毒数量，因此每次检测T区峰值与每次 检测C区峰值比值确定相关诊断数据。
[0023] 采用本发明公开的方法在5分钟内可检测到IOng/ μ L的甲型流感病毒核蛋白，灵 敏度比免疫斑点杂交和传统的快速流感诊断方法（RIDTs)(灵敏度25ng/ μ L)高，更重要 的是FICT法至少可检出5个亚型的甲型流感病毒，即Η1Ν1、Η5Ν3、Η7Ν1、Η7Ν7以及Η9Ν2,临 床上可区分检验甲型流感病毒感染和其他呼吸道病毒感染。
[0024] 本发明的FICT法在检测动物源性甲型流感病毒上具有高度的敏感性，通过提供 许多诊断数据可对感染病毒进行定量，因此增强了甲型流感病毒可检测性。在临床应用中， FICT检测呼吸道感染的拭子，所有HlNl阳性的样品检出结果均为阳性。FICT法因为较高 的最低检测浓度，可对RDT(快速诊断检测）法检出阴性的病人进行诊断。使用标化的HlNl 病毒抗原，所有病人的流感病毒可以定量。总之，本发明公开了一种高效、简单、定量检测或 诊断甲型流感病毒的荧光免疫层析条。
【附图说明】
[0025] 图1为本发明的结合香豆素树状体、抗体的乳胶圆珠结合物的稳定性检测；
[0026] 图2为本发明的荧光免疫层析条的灵敏度检测结果；
[0027] 图3为采用本发明的FICT法对鸡场分离的禽流感病毒进行检测的结果；
[0028] 图4为本发明的FICT方法的临床检验结果；
[0029] 图5为HAU滴度的校验曲线。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合具体实施例来进一步描述本发