上样于层析条带的 样品衬垫，用LED便携式读数计在暗处5分钟内可检测到荧光，激发和检测波长分别是 450nm、590nm〇
[0069] FICT和RDT检测方法在操作性、一致性以及缓冲液使用方面一致且等量，均在15 分钟内肉眼观察结果。与斑点免疫杂交的结果一致。加入10 μ L样本和样品衬垫一样的缓 冲液，用LED-based便携式条带读数计快速检测，优化的时间为5-10分钟，本发明确定的反 应时间为5分钟。
[0070] 将本发明的层析条用于检测IOng/ μ L-50ng/ μ L的标准甲流蛋白NP抗原。为阐 明检测区（T)的反应，因为样品的横向流动的多样性，对各个检测区T峰和各个控制区C峰 进行了归纳，各个控制区的峰值意味单克隆抗体沿免疫层析膜的横向流动。T区各荧光峰和 /C区各荧光峰的比值（T/C比值）因为逐渐增加的甲流病毒NP抗原而增大。实验结表明本 发明法可检测到的NP抗原的最低浓度为IOng/ μ L，是FICT检测的最低可检测浓度（Lowest detectable concentration，LDC)，见图2。在焚光免疫层析条检测区，有非特异的峰，阈值 显示阳性数值和阴性数值。
[0071] 快速流感诊断法（RIDT)检测甲流病毒NP抗原的最低可检测浓度为25ng/ μ L，低 于FICT法的2. 5倍，因此说明本发明的FICT法灵敏度高。
[0072] 实施例2鸡场分离的禽流感病毒检测
[0073] 分离的Η5Ν3、Η7Ν1、Η7Ν7、Η9Ν2用SPF受精鸡胚培养、纯化，使用40HAU/10 μ L病 毒抗原作为检测样本，用本发明的FICT方法以及斑点杂交免疫检测法进行检测。
[0074] 结果：用本发明的FICT方法可检测出Η1Ν1、Η5Ν3、Η7Ν1、Η7Ν7以及Η9Ν2,但Η5Ν3、 H7NUH7N7以及Η9Ν2的荧光强度和HlNl荧光强度比较，远低于HlNl荧光强度，结果见表2 及图3。
[0075] 表 2 本发明的 FICT 方法检测 Η1Ν1、Η5Ν3、Η7Ν1、Η7Ν7 以及 Η9Ν2
[0077] 4种禽流感亚型病毒中，H7N1以及H7N7用斑点杂交免疫检测和FICT检测，显示最 高强度，说明了这2种方法的高度相关性和可操作性。HlNl核蛋白的单克隆抗体与4种禽 流感病毒亚型的免疫反应通过斑点杂交免疫法获得确证。FICT法禽流感病毒T/C值与斑 点杂交的T/C值高度相关。因此，本发明香豆素树状体荧光免疫层析条检测是可用于人甲 型流感病毒和禽流感病毒检测的可靠、准确、快速的诊断工具，可用于鸡场分离禽流感病毒 检测，筛选在人-禽中传播的禽流感亚型。
[0078] 实施例3临床检验
[0079] 为评估FICT定量检测流感病毒的潜能，收集临床病人样本，用FICT法进行检测， 以便诊断数据数字化，使医生能够客观量化诊断。样品如检出流感病毒，进一步通过细胞培 养和PCR确证。
[0080] 中性缓冲液处理拭子样品，包括2份正常样本、5份HlNl感染病人样本、4份不同 呼吸道病毒感染病人样本。采用本发明的荧光免疫层析条检测HlNl感染病人样本，检测区 (T)峰值和控制区（C)峰值比较，显示较高，阴性样品各自检测区⑴峰值和自控制区（C) 峰值比较，显示较低，同样不同呼吸道病毒感染的样本用FICT检测，也显示同样结果，结果 如表3及图4所示。各个T/C比例相对值显示HlNl感染样本（正常和其他呼吸道病毒感 染样本）和阴性对照样本之间的临界值。
[0081] 表3本发明的FICT方法的临床检验结果
[0083] 用FICT定量分析临床样本时，建立了 HAU滴度的校验曲线（图5)。
[0084] 临床样本经荧光免疫层析条法检测获得荧光数据T/C值（％)，与HlNl病毒HAU 系列稀释所产生T/C值（％)回归（R2= 0.945)所产生的标准曲线对比可计算出HAU滴 度。本发明中FICT显示纯化的禽流感病在0. 625-40HAU/10yL范围为线性关系。FICT法 和RDT法的可定量性比较，RDT法定量范围5-40HAU/10 μ L。
[0085] 香豆素树状体为基础的FICT法灵敏性高出胶体金为基础的RDT检测法的2. 5 倍。检测5个HlNl阳性病人样品的HlNl含量分别是6. 09±0. 99、4. 5±0. 49、4. 6±1.3,、 21. 2±3· 03、5· 1±0· 65〇1^&11±50)拟1]/1〇1^，且经血凝法确证。
[0086] 本发明公开的FICT诊断准确性通过与细胞培养检测、PCR检测以及传统快速诊断 检测法（RDT)比较进行了评估，见表4,结果表明，本发明的FICT方法与细胞培养检测、PCR 检测高度相关，当检测同一样本，RDT法在5个HlNl病毒感染阳性样本10 μ L中检测2阴性 结果，而FICT检测、细胞培养、PCR法检测HlNl阳性病例标本，发现全部阳性，并在快速流 感诊断检测（RIDT)法检出阳性结果的样品中检出甲流病毒Η1Ν1-3。常规法因为弱的颜色 反应很少能检出类似病例，而采用本发明的FICT诊断法，T/C value(%)高出临界值。因 此发明的FICT不仅准确，而且可定量检测甲型流感病毒。
[0087] 表4发明的荧光免疫层析条法与常规诊断检测法检测临床样本
【主权项】
1. 一种基于香豆素树状体的荧光免疫层析条，其特征在于，所述层析条按照连接顺序 依次包括样品衬垫，结合衬垫，醋酸纤维素膜，吸水纸及位于下方的作为组装平台使用的 PVC底板，所述醋酸纤维素膜与结合衬垫之间有搭接，所述结合衬垫吸附有表面吸附甲型流 感病毒核蛋白单抗以及香豆素树状体的乳胶圆珠； 其中，所述的醋酸纤维素膜上有羊抗鼠IgG多克隆抗体包被的质控线，以及甲型流感 病毒核蛋白另一单抗包被的检测线，样品衬垫提供了待测样品加入的位置； 其中，所述的香豆素树状体的结构如以下结构式所示：2. 如权利要求1所述的层析条，其特征在于表面吸附甲型流感病毒核蛋白单抗以及香 豆素树状体的乳胶圆珠是通过以下方法制备的： (1) 将0· 8ml直径20nm的乳胶圆珠用0· 8mlpH8. 5的0· 1M碳酸氢钠溶液以及pH7. 4 的PBS先后分别洗涤3次，短暂离心，弃上清； (2) 沉淀中加入0. 8mlpH8. 5的0. 1M碳酸氢钠溶液，再加入128μL溶于DMSO的浓度 为lmg/mL香豆素树状体溶液，室温摇动1小时，得到结合香豆素树状体的乳胶圆珠； (3) 将结合香豆素树状体的乳胶圆珠用PBS洗涤2次，短暂离心，弃上清，沉淀用0. 8ml 含lmg/mL的甲型流感病毒核蛋白单抗溶液重悬，4°C孵育1小时； (4) 缓慢加入0. 5mL戊二醛溶液，涡旋1分钟，4°C孵育2小时； (5) 用PBS洗涤2次，短暂离心，弃上清，沉淀用lmL0. 1%牛血清白蛋白溶液重悬，4°C 保存备用。3. 权利要求1或2所述的荧光免疫层析条在制备检测甲型流感病毒试剂中的用途。4. 如权利要求3所述的用途，其特征在于所述的甲型流感病毒包括甲型H1N1、H5N3、 H7N1、H7N7以及H9N2流感病毒。
【专利摘要】本发明公开了一种基于香豆素树状体的荧光免疫层析条及其制备方法和用途。在本发明中，香豆素树状体被整合到甲型流感病毒核蛋白的单抗上，同时偶联乳胶圆珠，进而制成了一种基于香豆素树状体的荧光免疫层析条，并建立了高度敏感的荧光免疫层析条检测法，通过光散二极管(LEDs)为基础的便携式条读数计即可检测禽和人甲型流感病毒的存在。采用本发明公开的方法在5分钟内可检测到10ng/μL的甲型流感病毒核蛋白，至少可检出5个亚型的甲型流感病毒(H1N1、H5N3、H7N1、H7N7以及H9N2)，临床上可区分甲型流感病毒感染和其他呼吸道病毒感染。此外，可对感染病毒进行定量，增强了甲型流感病毒可检测性。
【IPC分类】G01N33/558, G01N33/577, G01N33/569
【公开号】CN105259352
【申请号】CN201510680926
【发明人】吕宏亮, 张澍
【申请人】山西隆克尔生物制药有限公司, 吕宏亮, 张澍
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月19日