一种分泌型Sema4C蛋白及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学生物技术领域，尤其涉及一种新发现的分泌型Sema4C蛋白及其 应用，具体地为一种可用于乳腺癌早期检测及术后监测的以分泌型Sema4C蛋白为肿瘤标 志物的ELISA(酶联免疫吸附测定法）试剂盒的制备及应用。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌发病率居女性患者第一位，约占女性所患全部恶性肿瘤的23%。据国家卫 计委资料显示，2004-2005年，中国女性乳腺癌的死亡率为5. 9/10万，居恶性肿瘤死亡率的 第6位。近15年间，我国乳腺癌发病和死亡的年龄调整率及绝对死亡人数均明显上升，是 近年来恶性肿瘤增长幅度最大的肿瘤，且呈年轻化趋势。面对如此严峻的形式，国家卫计委 及时开展两癌筛查以期早期发现乳腺癌，在一定程度上明显降低了局部晚期乳腺癌（LABC) 的发病率，使乳腺癌患者病死率明显降低。但乳腺癌患者术后随访时间长，除影像学外尚无 明确的肿瘤标记物，严重影响了乳腺癌患者的术后监测，导致不易发现的肿瘤局部复发和 转移，是乳腺癌患者的重要死因。因此，临床上迫切需要发现乳腺癌新的血清学肿瘤标志物 用于乳腺癌的无创性早期诊断、术后评价治疗效果和随访监测，以期早期发现乳腺癌的复 发和转移。
[0003] 肿瘤标志物的价值表现在其敏感性和特异性上。理想的肿瘤标志物应该是敏感性 高，特异性强，表达量或血清中水平与肿瘤组织扩散或肿块大小成正相关。临床上目前尚 无乳腺癌特异的肿瘤标志物检测，常常使用肿瘤标志物CEA、CA153用于乳腺癌患者的检 测。由于CEA的多克隆抗体容易与样品中无关抗原结合，造成假阳性结果增多。肿瘤标志 物CA153也存在着同样的问题，特异性不高。因此，寻找一种兼顾敏感性和特异性的血清学 肿瘤标志物，应用于乳腺癌的临床检测，以期达到乳腺癌早期诊断、术后监测及预后评估的 目的是乳腺癌诊治中迫切需要解决的课题。
[0004] ELISA技术自本世纪70年代出现开始，就因其高度的准确性、特异性、适用范围 宽、检测速度快以及费用低等优点，在临床和生物疾病的诊断与控制等领域倍受重视，成为 检验中最为广泛应用的方法之一。特别是随着蛋白质分离纯化技术和基因工程技术的不断 发展，各种高纯度抗体、抗原和抗体复合物得以制备，以及单克隆抗体技术的应用，使得该 诊断检测技术在特异性、灵敏度和客观性等方面都有了大幅度的提高，并且在自动化免疫 技术的推进之下进一步具有了精确的定量分析能力。由于ELISA的技术条件要求低、携带 方便、常以试剂盒的形式出现且易商品化、操作简便和经济实惠，已成为一种应用最为广泛 和发展最为成熟的生物检测与分析技术。
[0005] 膜型Sema4C蛋白（Semaphorin 4C)是一个由833个氨基酸组成的分子量约为 93. 5KDa的酸性蛋白质，属于脑信号蛋白家族，最初是在神经系统研究中而得，对它的深入 研究发现，在健康成人体内膜型Sema4C蛋白表达极微弱，但在各类癌症患者包括乳腺癌、 宫颈癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、膀胱癌和卵巢癌等多种病变组织中可检测到显著高表达。
[0006] 但是，膜型Sema4C蛋白在应用中存在诸多缺陷，例如，膜型Sema4C蛋白不能通过 Elisa检测，必须利用免疫组化技术，免疫组化技术的前提必须把肿瘤组织切除下来后检 测，用于肿瘤转移和术后复发监测极不方便，而分泌型Sema4C蛋白可以很好的克服上述缺 陷。
[0007] SEMA4C基因是发明人早期通过激光捕获、显微切割（LCM)技术从乳腺癌患者及良 性乳腺肿瘤患者中切取人淋巴管内皮细胞，微量RNA提取后经无偏性线性扩增，最后进行 表达谱芯片检测发现，并进行临床标本验证的在乳腺癌中表达上调最为明显的基因。
[0008] 国内外目前关于Sema4C在肿瘤中的研究非常有限，尤其是目前尚无分泌型 Sema4C蛋白的序列、浓度及检测方法的相关报道，更无相关专利。
[0009] 因此，如果能够建立分泌型Sema4C的ELISA检测方法，在基础研究和临床医学检 测方面都有重要的应用价值。
【发明内容】
[0010] 鉴于现有技术存在的问题，本发明提供了一种分泌型Sema4C蛋白，不仅首次证实 了分泌型Sema4C蛋白的存在，并发现该分泌型Sema4C蛋白在正常人和肿瘤患者血清中的 表达有显著差异，尤其在乳腺癌淋巴结转移患者血清中明显升高，并与乳腺癌患者肿瘤负 荷呈显著正相关，因此能作为一种理想的血清学标记物用于乳腺癌患者的术前诊断、术后 治疗效果评估及随访监测，更进一步提供了一种以分泌型Sema4C蛋白为肿瘤标志物的试 剂盒，解决了膜型Sema4C蛋白不能通过Elisa检测而必须利用免疫组化技术使用不便的问 题。
[0011] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
[0012] 一种分泌型Sema4C蛋白，所述分泌型Sema4C蛋白为膜型Sema4C蛋白的胞外段， 包括SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列中包括一段信号肽 序列，所述信号肽序列具有SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列。
[0013] 本发明通过Elisa技术、Western-blot检测及质谱分析技术等多方面证明人血清 中分泌型Sema4C蛋白的存在，并确定其为由600个左右氨基酸组成，大小为90KD左右，略 小于膜蛋白93. 5KD ;此外，在宫颈癌和乳腺癌的患者血清中发明人发现该分泌型Sema4C蛋 白浓度升高，而且具有非常高的敏感性和特异性，分泌型Sema4C在很多方面表现出与肿 瘤发生相关的活性，包括促进细胞增殖和迀移，促进血管和淋巴管生成，抗肿瘤细胞凋亡和 药物作用等。利用反义寡核苷酸链抑制它的表达能够显著抑制肿瘤的生长和转移，这些研 究结果表明分泌型Sema4C蛋白在肿瘤的发生、发展和恶化过程中扮演着极为重要的角色。 目前，发明人首次证实了该分泌型Sema4C蛋白在血清中表达研究。
[0014] 本发明采用LCM技术从乳腺癌原发灶和正常乳腺的冰冻组织切片中捕获均一同 质性的淋巴管内皮细胞，微量抽提的RNA经RNA无偏性线性扩增获得足量完整的RNA，有效 偶联Affymetrix GeneChip array HG U133 Plus 2.0聚寡核苷酸表达谱芯片，筛选乳腺 癌组织与正常乳腺组织之间淋巴内皮细胞差异表达的功能基因群。SEMA4C基因是乳腺癌 和正常组织间淋巴管内皮细胞差异表达显著的基因之一，乳腺癌中淋巴管内皮细胞SEMA4C 基因的核酸水平明显上调。随后，通过实时RT-PCR和免疫组化进一步证实乳腺癌组织中 SEMA4C mRNA和蛋白表达上调。进一步分析SEMA4C表达的蛋白与临床病理参数的关系，发 现肿瘤腺上皮过表达Sema4C与淋巴结转移、病理分期相关。
[0015] 在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
[0016] 进一步，在SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列中插入一段标签序列，优选地，插入的 标签序列为His标签序列，即分泌型Sema4C蛋白包括SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列；更 进一步地，分泌型Sema4C蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列中同时含有信号肽序列以及标签序列，所述信号肽序列具有SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列，信号肽序列更有利于蛋白的分泌表达；所述标签序列具有SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列，由6个His组成，与其他种类的标签序列相比，更有利于分泌型 Sema4C蛋白的纯化。
[0017] 进一步，所述分泌型Sema4C蛋白以分泌形式存在且能够在人血清中被检测到。
[0018] 本发明还提供一种编码上述的分泌型Sema4C蛋白的核苷酸序列。
[0019] 上述的分泌型Sema4C蛋白作为肿瘤标志物的应用。
[0020] 上述的分泌型Sema4C蛋白作为肿瘤标志物在乳腺癌术前检测及术后监测中的应 用。
[0021] 基于上述的分泌型Sema4C蛋白，本发明提供一种以分泌型Sema4C蛋白为肿瘤标 志物的试剂盒，包括：包被到酶标板上的绵羊抗人Sema4C多克隆抗体、检测抗体为小鼠抗 人Sema4C单克隆抗体、链霉亲和素-辣根过氧化物酶标记的驴抗小鼠 IgG多克隆抗体和标 准品，所述标准品Sema4C人重组蛋白，所述Sema4C人重组蛋白包括SEQ ID NO. 2所示的氨 基酸序列，优选地，所述Sema4C人重组蛋白就是由SEQ ID NO. 2所示的氨基酸组成。
[0022] 利用上述试剂盒能通过检测人血清中分泌型Sema4C蛋白的浓度从而协助诊断及 随访乳腺癌患者，克服乳腺癌因缺乏血清学标记物所致的诊断和随访困难的缺点。
[0023] 具体而言，本发明所述的上述试剂盒是用于检测血清中分泌型的Sema4C蛋白的 ELISA试剂盒，其包被一种绵羊抗人Sema4C多克隆抗体，通过包被的Sema4C抗体捕获血清 中的分泌型的Sema4C蛋白，用小鼠抗人Sema4C单克隆抗体检测分泌型的Sema4C蛋白的含 量。
[0024] 本发明所述的试剂盒的检测原理采用双抗体夹心法ELISA。
[0025] 本发明所述的试剂盒的检测对象为表达Sema4C的肿瘤，所述表达Sema4C的肿瘤 包括乳腺癌、宫颈癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、膀胱癌和卵巢癌等，所述肿瘤优选为乳腺癌。
[0026] 本发明所述的试剂盒用于乳腺癌的早期诊断、监测治疗效果和预后随访。
[0027] 在本发明所述的试剂盒中，所述包被抗体的工作浓度为4ug/mL所述检测抗体的 工作浓度为〇. 4ug/mL，所述酶联抗体的工作浓度为lug/mL。
[0028] 本发明所述的试剂盒具有良好的特异性、敏感性和稳定性。
[0029] 本发明所述试剂盒的具体的优点在于：（1)引入一种新的转移相关的乳腺癌分子 标志物分泌型Sema4C蛋白，通过检测该标志物，可以协助乳腺癌的临床诊断，进一步判断 患者预后情况，指导治疗；同时，作为乳腺癌的一个独立预后因子，该标志物也可能成为治 疗新靶点。（2)该标志物的检测只需抽血便可进行，患者所受痛苦较小，且可以随时检测，有 利于监测病情。（3) ELISA检测技术在临床应用已经比较成熟，且简单方便，成本低廉，适合 临床检测。
[0030] 进一步，所述包被到酶标板上的绵羊抗人Sema4C多克隆抗体，母液浓