度为0. 2mg/ mL，稀释50倍后的工作液的浓度为4ug/mL ;
[0031] 1)检测抗体为小鼠抗人Sema4C单克隆抗体，母液的浓度为0. 2mg/mL，利用生物素 标记后（生物素标记方法：采用生物素标记试剂盒购自日本同仁，型号为LK03,具体实施步 骤参照该产品说明书），使用时，稀释500倍得到的工作液浓度为0. 4ug/mL ;
[0032] 2)链霉亲和素-辣根过氧化物酶标记的驴抗小鼠 IgG多克隆抗体（即 Streptavidin-HRP IgG)，母液的浓度为 0· 5mg/mL ;
[0033] 3)标准品，母液的浓度为100ng/uL，通过昆虫细胞sf9中真核表达并通过亲和纯 化。
[0034] 采用上述进一步方案的有益效果是：
[0035] 在本发明所述的试剂盒中，所述包被抗体的工作浓度为4ug/mL，所述检测抗体的 工作浓度为〇. 4ug/mL，所述酶联抗体的工作浓度为lug/mL，进一步保证了本发明所述的试 剂盒具有良好的特异性、敏感性、稳定性以及使用时的便利性。
[0036] 进一步，还包括包被缓冲液、洗涤液、封闭液、加样缓冲液、显色液、反应终止液。
[0037] 进一步，所述包被缓冲液为磷酸盐缓冲液（PBS)，其成分为140mM NaCl、2. 7mM KCl、IOmM Na2HP04、I. 8mM KH2PO4, pH值为7. 4 ;所述洗涤液为添加了体积分数为0. 05 %的 Tween-20的包被缓冲液；所述封闭液为含有体积分数为1%的牛血清白蛋白的包被缓冲 液；所述加样缓冲液的成分为50mM Tris-HCl、0. 5M KC1、体积分数为1%的牛血清白蛋白、 体积分数0. 05%的Tween-20, pH值为8. 4 ;所述反应终止液的成分为2MH2S04。
[0038] 本发明所用术语"工作浓度"是指在进行检测时所使用的试剂例如抗体的浓度。
[0039] 本发明所述的以分泌型Sema4C蛋白为肿瘤标志物的试剂盒在使用时，包括以下 步骤：收集血清样本，包括正常人样本和患者的血清样本（例如乳腺疾病中乳腺良性病变 和乳腺癌患者的血清样本），按常规血清分离方法处理；96孔酶标板多克隆抗体包被；单克 隆抗体检测分泌型Sema4C蛋白；计算血清中分泌型的Sema4C蛋白的含量。
[0040] 具体操作为：
[0041] 1)在酶标板中加入包被缓冲液（PBS)稀释50倍的绵羊抗人Sema4C多克隆抗体， 每孔100uL，4°C包被24小时；弃去孔中液体，在干净的吸水纸上拍干，并用洗涤液洗涤三 次，每次5分钟；
[0042] 2)每孔加入200uL封闭液，37°C封闭2小时；弃去孔中液体，在干净的吸水纸上拍 干，并用洗涤液洗涤三次，每次5分钟；
[0043] 3)将标准品（浓度分别为 0ng/mL、0. 78125ng/mL、I. 5625ng/mL、3. 125ng/mL、 6. 25ng/mL、12. 5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL)分别加入步骤4)处理的孔中，每孔加入100uL， 用于制作标准曲线；
[0044] 4)将待测样品分别加入步骤3)处理的孔中，每孔加入IOOuL ;加盖封口膜，置于 37°C孵育2小时，用于检测待测样品；
[0045] 5)将步骤3)和步骤4)孔中的液体弃去，在干净的吸水纸上拍干，并用洗涤液洗涤 三次，每次5分钟；
[0046] 6)向步骤5)的孔中，每孔分别加入利用加样缓冲液稀释500倍的生物素标记的 小鼠抗人Sema4C单克隆抗体（浓度为0. 4ug/mL)，每孔加入100uL，37°C反应2h，加盖封口 膜；弃去孔中液体，在干净的吸水纸上拍干，并用洗涤液洗涤三次，每次5分钟；
[0047] 7)每孔分别加入 IOOuL 的 Streptavidin-HRP IgG (浓度为 0· 5mg/mL)，加盖封口 膜，37°C避光反应20min ;
[0048] 8)每孔加入IOOuL显色液TMB，室温反应10-30min ;
[0049] 9)每孔加入50uL 2M H2SO4终止反应；
[0050] 10)在酶标仪中测定OD45。和OD 57。值；
[0051] 11)根据标准品测定的OD45057。值（即利用OD45。测的数值减去OD 57。测得的数值）， 利用统计学绘图软件根据测定的值绘制标准曲线，横坐标为待测样品中分泌型Sema4C蛋 白的浓度，纵坐标为OD 45q 57。值；
[0052] 12)通过标准曲线和未知浓度样品的OD45q 57。值计算待检样品中分泌型Sema4C蛋 白的浓度。
【附图说明】
[0053] 图1为分泌型Sema4C蛋白在乳腺癌组织中蛋白水平的表达情况。
[0054] 图2 Western Blotting方法检测MD-MBA-231细胞总蛋白和上清中Sema4C蛋白。
[0055] 图3质谱分析MD-MBA-231细胞上清中蛋白。
[0056] 图4为分泌型Sema4C蛋白的检测标准曲线。
[0057] 图5 ELISA试剂盒检测分泌型Sema4C蛋白升高的灵敏度和特异度。
[0058] 图6为根据公式计算出肿瘤患者和健康对照的分泌型Sema4C蛋白浓度比较，包括 图6A、图6B和图6C。
【具体实施方式】
[0059] 以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并 非用于限定本发明的范围。
[0060] 实施例1
[0061] 肿瘤组织中SEMA4C核酸水平明显上调，乳腺癌组织中膜型Sema4C蛋白表达上调。
[0062] 前期发明人采用LCM技术从乳腺癌原发灶和正常乳腺的冰冻组织切片中捕获均 一同质性的淋巴管内皮细胞，微量抽提的RNA经RNA无偏性线性扩增获得足量完整的RNA， 有效偶联Affymetrix GeneChip array HG U133 Plus 2.0聚寡核苷酸表达谱芯片，筛选乳 腺癌组织与正常乳腺组织之间淋巴内皮细胞差异表达的功能基因群（Wu，M.，Han，L.，Shi， Υ·，Xu，G.，Wei，J.，You，L.，Chen，Υ·，Zhu，Τ·，Li，Q.，Li，S.，et al. (2010) · Development and characterization of a novel method for the analysis of gene expression patterns in lymphatic endothelial cells derived from primary breast tissues.J Cancer Res Clin Oncol 136,863_872)。首次发现基因 Semaphorin 4C(SEMA4C)在乳腺癌 组织淋巴内皮细胞中高度表达，如表1所示。
[0063] 表1乳腺癌组织与正常乳腺组织之间淋巴内皮细胞差异高表达的部分功能基因
[0064]
[0065] 在芯片结果的基础上，本发明人对差异表达最为显著的基因 SEMA4C进行了进一 步研究。通过免疫组织化学技术（免疫组织化学技术为本领域的常规技术，具体方法可以 参考文献：叶双梅（2012)信号素分子4C在食管癌、胃癌和直肠癌中的表达及其意义。中 华医学杂志，92 (28).)验证了膜型Sema4C在乳腺癌组织中的表达水平的改变，初步发现 Sema4C的表达在肿瘤组织中明显高于癌旁正常组织，如图1所示。
[0066] 实施例2 :分析膜型Sema4C表达与临床病理参数的关系
[0067] 膜型Sema4C在乳腺癌组织中的表达情况与临床病理特征的关系见表2。卡方检 验分析表明，模型Sema4C阳性表达更易发生于淋巴结转移和乳腺癌组织分型为III型的患 者。膜型Sema4C阳性表达组患者的淋巴结转移发生率为82. 9% (68/82)明显高于未转移 组的13. 6% (11/81)。另外，组织分型在两组间的分布率也有差别，乳腺癌组织分型为I 型、乳腺癌组织分型为II型患者中Sema4C的表达阳性率为47. 9% (59/123)和乳腺癌组 织分型为III型患者中的表达阳性率为77. 5% (31/40);在雌激素受体（ER)、孕激素受体 (PR)和人类表皮生长因子受体2 (HER2)阴性的患者中膜型Sema4C的表达高于在雌激素受 体（ER)、孕激素受体（PR)和人类表皮生长因子受体2(HER2)阳性的患者。膜型Sema4C的 表达与患者年龄无明显相关（P > 0. 05)。
[0068] 表2 SEMA4C表达与临床病理参数间的关系（163例乳腺癌患者）
[0069]
[0070] 实施例3 :发现分泌型Sema4c蛋白的存在
[0071] 步骤 1
[0072] 用含EDTA的胰酶（购自Gibco公司，商品名为TYPSIN，其中胰酶的的质量体积比 为0. 25% )消化收集MD-MBA-231细胞（来自ATCC)，使贴壁的细胞从培养瓶壁上面脱落 下来。IXPBS 洗涤（其成分为 140mM NaCl、2.7mM KClUOmM Na2HP04、1.8mM KH2PO4, pH 值 为7. 4)，1000 rpm离心5分钟，弃上清，根据细胞量加入蛋白裂解液（碧云天P0013)，裂解 30min，4°C 12, OOOrpm，离心15分钟，取上清用考马斯亮蓝染液于紫外分光光度测定OD595值 后根据标准曲线计算浓度，蛋白定量分别为30ug和50ug后置于-80°C备用，得到细胞总蛋 白。
[0073] 步骤 2
[0074] 用容积为75cm的培养瓶培养ATCC来源MD-MBA-231细胞，待细胞达到70 %融合度 时换成IOmL无血清1640培养基（购自GIBICO公司）培养24小时，收取5瓶上清约50mL， 利用低温冻干机冻干成粉末状后，加入5mL蛋白裂解液（购自碧云天，货号为P0013)，溶解 后，用考马斯亮蓝染液于紫外分光光度计测定OD 595值后根据标准曲线计算浓度，蛋白定量 分别为30ug和50ug后置-80°C备用，得到上清中的分泌型蛋白。
[0075] 步骤 3
[0076] 分别将步骤1得到的50ug和30ug细胞总蛋白样品以及步骤2得到的50ug和30ug 上清