生产具有改善的分泌效率的重组蛋白质的方法

专利名称：生产具有改善的分泌效率的重组蛋白质的方法
技术领域：
本发明涉及在包括酵母细胞的真菌细胞中以提高的分泌效率生产重组蛋白质的方法和组合物。对电子提交的序列表的引用
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背景技术：
由于当前对生物治疗剂的关注，在真核细胞中表达重组蛋白质变得越来越重要，生物治疗剂是FDA管理的药物中增长最大的部分。无论生产细胞是基于CHO的哺乳动物细胞系还是糖工程化的(glycoengineered)巴斯德毕赤氏酵母(Sethuraman and Stadheim,Curr. Opin. Biotechnol. 17 :341-346 (2006))，最大的分泌滴度都是关键的。提高蛋白质生产的许多努力集中于启动子和重组基因的拷贝数(Daly and Hearn, J. Mol. Recognit. 18 1999-38(2005))，只有重组蛋白质沿着从内质网(ER)到高尔基体、随后反式高尔基网络、最后到细胞外囊泡以递送通过质膜的特定路径转运，才能实现分泌。如果重组蛋白质偏离了这个期望的途径，产量将下降。与哺乳动物细胞相比，糖工程化的酵母提供了用于治疗剂开发的独特的优势。例如，基于哺乳动物细胞的系统的糖基化分布是异源的(Li et al. , Nat. Biotechnol. 24 210-15(2006))，而糖工程化的巴斯德毕赤氏酵母被证明提供了均匀的糖基化(Hamiltonet al. , Science 313:1441-43(2006))。虽然哺乳动物糖基化的遗传学修饰是可能的，例如，消除海藻糖(Shinkawa et al. , J. Biol. Chem 278 :3466-73 (2003)),大多数糖形式选择必需在发酵和/或纯化步骤时发生，常常限制产量。酵母菌中遗传操作的容易性提供了与哺乳动物宿主细胞相比、独立于发酵和纯化来改善蛋白质产量的机会。在酵母中，被递送到液泡的内源蛋白质被蛋白酶类降解。酵母液泡是一种细胞器，类似于哺乳动物溶酶体，对于内吞作用、蛋白质周转和营养物获取以维持细胞自我稳定是非常重要的。液泡蛋白质运输的一种机制是羧肽酶Y途径，其从反式Golgi网络(TGN)递送蛋白质。在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，对TGN中羧肽酶Y的起始相互作用负责的蛋白质受体被称为VpslO (也称为P印I或Vptl)、Vthl和Vth2。在酿酒酵母中，VpslO起作用来将居于液泡中的蛋白酶递送到前液泡区室，弓I起液泡中最终的蛋白水解作用(综述参见，Bowers and Stevens, Biochim. Biophys. Acta 1744:438-54(2005) ；Li andKane,Biochim.Biophys. Acta. 1983 :650-663(2009)，epub Aug. 2008)。
Marcusson 等人(Cell 77 :579-586 (1994))显示了在酿酒酵母中，VpslO 是 Cpy 向酵母液泡的分选所需的。Marcusson等人进一步显示了 VPSlO基因的突变引起内源Cpy的缺陷性液泡蛋白质分选，引起它的分泌。然而，还显示的是，VPSlO的破坏和VpslO活性的丧失对液泡酶PrA和PrB的分选没有任何影响，在VPSlO基因被敲除的酿酒酵母菌株中它们适当地通过通往液泡的途径。Iwaki等人(Microbiology 152 :1523-32(2006))也显示了在粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中VPSlO的删除引起了 Cpy的错误分选和分泌,表明VpslO是将Cpy分选到液泡所需的。VpslO分选受体也显示了在Cpy分选中以类似于粟酒酵母(Saccharomyces pombe)的方式起作用(Takegawa et al. , Curr Genet. 42 (5)252-9(2003) ；Iwaki et al. , Microbiology 152(5) : 1523-32(2006))。J. Denecke (美国专利申请No. 2005/0019855)公开了通过防止蛋白质输出到ER之外和/或将蛋白质从液泡分选途径重定向回到ER或细胞表面来限制蛋白水解作用的方法。、它进一步提出了，液泡分选受体VpslO可以被这样修饰，从而将蛋白质重定向回到ER，从而提闻异源蛋白质表达。Idiris 等人(Appl Microbiol. Biotechnol. 85 (3) :667-77 (2010), Epub 2009 Aug11)描述了在菌株A8-vpslOA中2倍提高的人生长激素(hGH)分泌，与仅有八个蛋白酶删除的AS菌株相比，这是一种包含VPS10删除以及八个蛋白酶基因删除的粟酒裂殖酵母菌株。然而，细胞内地保持了低水平的r-hGH分泌，这表明与细胞内蛋白质滞留相关的几种VPS基因必需被删除以完全地阻断液泡积累途径。Takegawa等人(上文)还描述了粟酒裂殖酵母的vpslO缺陷菌株,显示了 Cpy在这种突变株中不被加工成其成熟形式。然而，这项研究没有描述在vpslOA菌株中异源治疗蛋白质的表达。Agaphonov 等人(FEMS Yeast Research 5:1029-1035(2005))灭活了多形汉逊酵母(Hansenula poIymorpha)中的VPS10基因，没有观察到人类尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)的分泌提高。在这项研究中，在VPS10缺陷菌株中观察到了 uPA的蛋白水解加工的提高。高度希望的是通过消除或降低液泡分选活性来开发提高真菌或酵母细胞中产生的异源蛋白质产量的方法。发明概述本发明特别地涉及在酵母或真菌宿主细胞中生产重组蛋白质的方法，包括(a)用编码蛋白质的表达载体转化遗传修饰的酵母或真菌宿主细胞来产生宿主细胞，其中相对于相同物种的未修饰的酵母或真菌宿主细胞，所述遗传修饰的酵母或真菌细胞缺乏液泡分选活性，或具有降低的液泡分选活性；(b)在诱导发酵条件中蛋白质表达的条件下在培养基中培养所述转化的酵母或真菌宿主细胞；以及(C)从所述转化的酵母或真菌宿主细胞或培养基分离所述蛋白质。在本发明的这个方面的某些实施方式中，所述酵母或真菌宿主细胞选自以下构成的组巴斯德毕赤氏酵母、酿酒酵母、黑曲霉(Aspergillusniger)、粟酒酵母(Saccharomyces pombe)、白色念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces Iactis)和多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)(也称为安格斯毕赤酵母,Pichia angusta)。在一个优选的实施方式中，宿主细胞是毕赤氏酵母细胞，在特定的实施方式中，宿主细胞是巴斯德毕赤氏酵母。
在其他实施方式中，本发明涉及在酵母或真菌宿主细胞中生产重组蛋白质的方法，包括(a)在遗传修饰的酵母或真菌宿主细胞中表达所述重组蛋白质，其中相对于相同物种的未修饰的酵母或真菌宿主细胞，所述遗传修饰的酵母或真菌宿主细胞缺乏液泡分选活性或具有降低的液泡分选活性；(b)在诱导发酵条件中蛋白质表达的条件下在培养基中培养所述遗传修饰的酵母或真菌宿主细胞；以及(c)从所述酵母或真菌宿主细胞或培养基分离所述蛋白质。在本发明的方法的特定的实施方式中，通过从真菌或酵母细胞基因组中删除或破坏编码VpslO或VpslO同源物例如VpslO-I的基因，来消除或降低液泡分选活性。本发明还涉及在毕赤氏酵母宿主细胞中生产重组蛋白质的方法，包括(a)用编码蛋白质的表达载体转化遗传修饰的毕赤氏酵母细胞来产生宿主细胞，其中相对于相同物种的未修饰的毕赤氏酵母细胞，所述遗传修饰的毕赤氏酵母细胞缺乏液泡分选活性；(b)在诱导所述蛋白质表达的条件下在培养基中培养所述转化的毕赤氏酵母宿主细胞；以及(c)从所述转化的细胞或培养基分离所述蛋白质。在本发明的这个方面的某些实施方式中， 所述宿主细胞是巴斯德毕赤氏酵母细胞。本发明进一步提供了相对于野生型巴斯德毕赤氏酵母细胞缺乏液泡分选活性或具有降低的液泡分选活性的巴斯德毕赤氏酵母细胞，其中所述宿主细胞包含液泡蛋白质分选受体10-1 (VpslO-I)的功能性删除，例如，在SEQ ID NO 20中列出的VpslO-I蛋白质。在某些实施方式中，巴斯德毕赤氏酵母细胞被进一步修饰以表达糖蛋白，在所述糖蛋白中糖基化模式是人类样的。在更进一步的实施方式中，编码VpslO-I的基因被删除，编码VpslO-2的基因是完整的(即，不删除)。在整个说明书中和在附随的权利要求中使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数的内容，除非上下文中明显地另外指示了。如在整个说明书和附随的权利要求书中使用的，采用以下定义和缩写定义“ ‘QRPL-样’分选信号”是指容许重组蛋白质结合VpslO的液泡分选信号。在羧肽酶Y(CpY)中，序列QRPL(SEQ ID NO :176)结合VpslO，引起Cpy被导向液泡。“QRPL-样”分选信号与QRPL序列具有同源性，容许重组蛋白质与VpslO或VpslO同源物的结合。“QRPL-样”分选信号的实例包括但不限于“QSFL” (SEQ ID NO :179)和“QVAF” (SEQ ID NO :180)。“VpslO-1”是指巴斯德毕赤氏酵母细胞中的液泡分选受体10-1，例如，SEQ ID NO:20所列氨基酸序列所定义的VpslO-I蛋白质。本领域技术人员将了解，VpslO-I序列中的微小变异可以在不同的巴斯德毕赤氏酵母细胞系中存在，将不会改变蛋白质的功能。因而，提及VpslO-I包括在SEQ ID NO 2中列出的蛋白质序列，以及结构上和功能上相似的，即，以等同的方式起作用的(例如，参与液泡分选)，并具有与SEQ ID NO: 20的至少90%序列同一性,更优选的至少92%的同一性，至少94%的同一性，再更优选的至少96%的同一性，至少98%的同一性或至少99%的同一性的氨基酸序列的蛋白质序列。" Vps 10-2"是指巴斯德毕赤氏酵母细胞中的液泡分选受体10-2，例如，SEQ IDNO 21中所列氨基酸序列所定义的VpslO-2蛋白质。本领域技术人员将了解，VpslO-2序列中的微小变异可以在不同的巴斯德毕赤氏酵母细胞系中存在，将不会改变蛋白质的功能。因而，提及VpslO-2包括在SEQ ID NO :21中列出的蛋白质序列，以及结构上和功能上相似的，即，以等同的方式起作用的，并具有与SEQ ID NO :21的至少90%序列同一性，更优选的至少92%的同一性，至少94%的同一性，再更优选的至少96%的同一性，或至少98%的同一性的氨基酸序列的蛋白质序列。如在此使用的“同源物”是指与参考序列享有结构和功能相似性的基因或蛋白质序列。术语“同源物”包括直系同源体(orthologs)，其是在不同物种中由于从共同的祖先进化而结构上相似的序列，以及旁系同源体(Paralogs)，其是同一基因组内的相似序列。“蛋白质功能的降低”，包括“降低的液泡分选活性”，是指相对于不包含该修饰的相同物种的宿主细胞，在“修饰的”宿主细胞中蛋白质功能的降低。当在标准的分析中测量时，相对于未修饰的蛋白质，当修饰的蛋白质具有低至少20%到50%的活性，在特定的方面，低至少40%的活性或低至少50%的活性，特定蛋白质的功能被称为是“降低的”。本领域技术人员理解的是，“修饰的宿主细胞”和“未修饰的宿主细胞”可能包含其他的突变，所述突变与被功能评估的蛋白质不相关。例如，当评估VpslO蛋白质功能的降低时,包含VpslO删除、并进一步包含BMTl删除以消除具有a -甘露糖苷酶抗性N-聚糖的糖蛋白的 “修饰的”巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，与不包含VpslO删除、但是包含BMTl删除的“未修饰的”宿主细胞相比较。“蛋白质功能的消除”是指，相对于不包含对要评估的特定蛋白质的修饰的相同物种的宿主细胞，在“修饰的”宿主细胞中蛋白质功能或活性的消除。在特定的实施方式中，相对于没有修饰的蛋白质，当具有低至少90%到99%的活性时，修饰的蛋白质被称为具有“消除的功能”。在特定的方面，当在标准的分析中测量时，修饰的蛋白质具有低至少95%的活性，或低至少99%的活性。在某些方面中，修饰的蛋白质具有完全消除的蛋白质活性或功倉泛。如在此使用的术语“删除或破坏的”以及“删除或破坏”或“功能性删除”是指特定蛋白质的活性或功能的任何破坏或抑制，所述蛋白质例如巴斯德毕赤氏酵母VpslO-I和VpslO-2蛋白质、在其他物种如酿酒酵母中的VpslO同源物，或参与液泡分选的其他蛋白质，所述蛋白产自酵母细胞基因组，其中相对于不包含所述删除或破坏的相同物种的未修饰的酵母细胞，所述蛋白质活性的抑制使得所述蛋白质不能进行它的预期的功能，或仅能以更低的程度进行它的预期功能。它们的实例是酵母宿主细胞，其中液泡分选活性可以被取消或破坏，包括但不限于，D控制参与液泡分选的基因表达的上游或下游调节序列的删除或破坏；2)编码蛋白质活性的基因的突变，使得所述基因无功能，其中“突变”包括删除、取代、插入、或添加到基因中，使得编码的蛋白质没有液泡分选活性；3)通过化学、肽或蛋白质抑制物的液泡分选活性的取消或破坏；4)通过基于核酸的表达抑制物，例如，反义RNA、RNA干扰和siRNA，液泡分选活性的取消或破坏；5)通过转录抑制物或调节因子的表达或活性的抑制物，液泡分选活性的取消或破坏，所述调节因子控制或调节编码酶活性的基因的表达；6)已知结合VpslO的肽或蛋白质，例如，Cpy的共同表达，来饱和液泡受体并降低分泌的重组蛋白质的分选；7)不是膜相关的突变VpslO蛋白质、或者起作用来阻止正常的液泡分选模式的优势-阴性VpslO蛋白质的共同表达；8)感兴趣的重组蛋白质的氨基酸序列的改变，来消除VpslO-结合结构域并阻止液泡分选；和9)通过任何方式，其中获得的蛋白质，即使被表达，不同于从未修饰的酵母细胞获得的蛋白质，并且功能被减弱。缩写
VPS10-1液泡蛋白质分选受体I
VPS10-2液泡蛋白质分选受体2
ScSUC2酿酒酵母转化酶
OCHla-l，6-甘露糖基转移酶K1MNN2-2: K. Iactis UDP-GlcNAc转运蛋白
BMT 1\P-甘露糖-转移物I ( P-甘露糖消除)
BMT2:p 甘露糖-转移物2 ( (3-甘露糖消除)
BMTS'.P-甘露糖-转移物3 ( P-甘露糖消除)
BMT4:P-甘露糖-转移物4 ( P-甘露糖消除)
MNN4LI:MNN4-样I (电荷消除)
UmSLC35A3 UDP-GlcNAc转运蛋白的小鼠同源物
PNOl:N-连接的寡聚糖的磷酸甘露糖化(电荷消除)
MNN4',甘露糖基转移酶(电荷消除)
FB53:融合到ScMNN2前导区的MmMNSlA
TvMDSl:分泌的T. reseei MNSl
Shble:zeocin抗性标志物
HSAss:人血清白蛋白信号序列
DAP2:二肽基氨肽酶
STEl 3:二肽基氨肽酶
CLPl:巴斯德毕赤氏酵母纤维素酶样蛋白质I
5-FOA5 氟乳清酸
TNFRII-Fc与IgG I的Fe区融合的肿瘤坏死因子受体2胞外结构域
ER内质网
GCSF粒细胞集落刺激因子
rhGCSF重组人粒细胞集落刺激因子
附图的简要描述

附图I显示了 pGLY5192 (vpslO-1敲除质粒)和pGLY5194 (vpslO-2敲除质粒)的 构建。显示了用于产生pGLY5192和pGLY5194的构建体的质粒图，包括限制性内切酶位点 和插入的DNA。附图2A-2B显示了编码rHuMetGCSF并且靶向巴斯德毕赤氏酵母AOXl基因座的质粒载体PGLY5178 (rhGCSF表达质粒)的构建。显示了用于产生pGLY5178的构建体的质粒图，包括限制性内切酶位点和插入的DNA。

附图3显示了 pGLY3465 (TNFRII-Fc表达质粒)的构建。描述了用于产生pGLY3465的质粒图、限制性内切酶和插入的DNA。附图4A-4E描绘了 yGLY8538的产生，是一种表达rhGCSF的糖工程化的巴斯德毕赤氏酵母菌株。如所列出的，菌株构建涉及运用亲本菌株和遗传改变(通过质粒或培养基选择)来产生具有正确基因型的最后菌株。基因型中所列的基因的注释在本发明的概述中描述了。最终的菌株yGLY8538是重组的人粒细胞集落刺激因子(rhGCSF)表达菌株，其被用于产生随后的突变菌株。附图5A- 描绘了 yGLY9993的产生。如所列出的，菌株构建涉及运用亲本菌株和遗传改变(通过质粒或培养基选择)来产生具有正确基因型的最后菌株。基因型中所列的基因的注释在本发明的概述中描述了。最终的菌株yGLY9992和yGLY9993是yGLY8292的同基因的vpslO-1突变体。这些菌株是zeocin敏感的，因而不含有rhGCSF或TNFRII-Fc。附图6描绘了 yGLY8538突变菌株的产生。rhGCSF表达菌株yGLY8538在基因vpslO-1 (yGLY9933), vpslO-2 (yGLY10566)或两者(yGLY10557)中突变。如对于 yGLY8538所列出的，菌株构建涉及运用亲本质粒和遗传改变(通过质粒或培养基选择)来产生具有 正确基因型的最后菌株。附图7显示了 VpslO活性对rhGCSF滴度(画面A)和细胞裂解(画面B)的作用。参见实施例14。列出的数据是从Sixfors (0.5L)发酵实验产生的。画面A:列出的菌株在相同条件下发酵，通过ELISA分析无细胞上清液来定量rhGCSF的水平。每一个的ELISA值除以亲本对照yGLY8538 ELISA值来获得相对滴度。画面B :列出菌株在相同条件下发酵，通过PicoGreen 分析来分析无细胞上清液,来定量双链DNA的水平。每一个的PicoGreen dsDNA值除以亲本对照yGLY8538 PicoGreen dsDNA值来获得相对细胞裂解值。附图8显示了 VpslO活性对TNFRII-Fc滴度的影响(参见实施例15)。列出的数据产自96孔深孔诱导平板实验。列出的菌株用PGLY3465转化，数据代表了来自至少十一个独立的菌落的相对滴度。通过ELISA分析无细胞上清液来定量TNFRII-Fc的水平。每个亲本菌株的ELISA值被平均，然后除以亲本对照yGLY8292的平均ELISA值来获得相对滴度。yGLY9992和yGLY9993菌株都是vpslO-1的独立的突变体。附图9A-B显示了巴斯德毕赤氏酵母中VpslO活性的模型。在野生型(画面A)和vpslO-1 A突变体(画面B)菌株中VpslO受体功能的示意图。在核中的mRNA转录之后，蛋白质多肽被翻译并转位到内质网的腔中。在转运到晚期的高尔基体之后，在野生型细胞(A)中GCSF与VpslO-I相互作用。VpslO-I通过细胞质的尾部从高尔基体循环到前液泡区室(PVC)，在此GCSF与受体解离。当VpslO-I循环回到高尔基体时，PVC中的GCSF迁移到液泡，被蛋白水解降解。在突变的细胞中(B)，VpslO-I蛋白质是缺乏的，因而更多的GCSF被分泌到培养物上清液部分中。附

图10列出了用于产生实施例中描述的质粒的引物序列(SEQ ID N0:l_13)。附图11列出了实施例中使用的质粒(画面A)和菌株(画面B)。附图12提供了在与酿酒酵母VpslO相比时，真菌VpslO同源物之间的长度、相似性百分比和同一性百分比的比较。附图13A-13E显示了巴斯德毕赤氏酵母VPS10-1区域的核苷酸序列(SEQ ID NO
14)，包括上游同源片段、启动子、开放阅读框(核苷酸1610-6238)和下游同源片段。附图14A-14D显示了巴斯德毕赤氏酵母VPS10-2区域的核苷酸序列(SEQ ID NO 15)，包括上游同源片段、启动子、开放阅读框(核苷酸830-4509)和下游同源片段。附图15显示了巴斯德毕赤氏酵母VpslO-I的氨基酸序列(SEQ ID NO 20)。附图16显示了巴斯德毕赤氏酵母VpslO-2的氨基酸序列(SEQ ID NO 21)。附图17显示了酿酒酵母VpslO的氨基酸序列(也称为P印I或Vptl，SEQ ID NO
22)。附图18显示了黑曲霉VpslO的氨基酸序列(SEQ ID NO 26)。附图19显示了粟酒酵母VpslO的氨基酸序列(SEQ ID NO 27)。附图20显示了白色念珠菌VpslO的氨基酸序列(SEQ ID NO 28)。 附图21显示了光滑念珠菌VpslO的氨基酸序列(SEQ ID NO 29)。附图22显示了树干毕赤酵母VpslO的氨基酸序列(SEQ ID NO 30)。附图23显示了汉逊德巴利酵母VpslO的氨基酸序列(SEQ ID NO :181)。附图24显示了乳酸克鲁维酵母VpslO的氨基酸序列(SEQ ID NO :182)。附图25提供了与CPY液泡分选途径相关的蛋白质的氨基酸序列的SEQ ID NO。附图26显示了与VpslO从PVC到晚期高尔基体的再循环相关的蛋白质的氨基酸序列的SEQ ID NO。附图27显示了与适当的MVB功能和/或液泡融合相关的蛋白质的氨基酸序列的SEQ ID NO。附图28提供了与通过未知机制的适当的Cpy液泡靶向相关的蛋白质的氨基酸序列的 SEQ ID NO。发明的详细说明本发明特别地提供了在遗传修饰的酵母或真菌宿主细胞中生产重组蛋白质的方法，所述酵母或真菌宿主细胞相对于相同物种的未修饰的酵母或真菌宿主细胞缺乏液泡分选活性或具有降低的液泡分选活性，其中所述酵母或真菌细胞被修饰以消除酿酒酵母VpslO、或VpslO同源物，包括但不限于巴斯德毕赤氏酵母VpslO-I的功能。在本发明的某些实施方式中，所述酵母或真菌细胞被修饰，从而编码VpslO或VpslO同源物的基因被删除或破坏，如下文所描述的。在真核细胞中重组蛋白质的高效、高产量的表达对于许多生物治疗产品的开发是关键的。为了实现治疗蛋白质的商业性开发所需的蛋白质高产量，重要的是获得蛋白质的最大分泌滴度。随着大量基因功能被阐明，酿酒酵母的分泌路径被很好地表征了。在mRNA分子被翻译以及蛋白质进入ER腔之后，对蛋白质发生许多加工，包括天冬酰胺连接的聚糖(N-连接的)、丝氨酸/苏氨酸连接的甘露糖(0-连接的)的添加，由ER内伴侣蛋白辅助的折叠，二硫键形成，出ER的逆转位，结合到货运受体，通过COPII泡囊输送到高尔基体，等等。本发明的目标是提高酵母细胞培养物中，包括发酵条件下的酵母细胞培养物中异源表达的治疗蛋白质的滴度。异源表达的蛋白质经由胞吐作用的分泌受到对液泡的可选择性输送的消极影响。重组蛋白质的液泡分选可以降低上清液部分中的分泌产量。为了开发提高酵母或真菌细胞中表达的重组蛋白质分泌的方法，我们起初考虑修饰三种潜在的可选择性运输途径，它们可以将重组蛋白质导向液泡(I)细胞质向液泡的靶向(CVT)，(2)碱性磷酸酶途径(ALP) (Piper et al. J Cell Biol 138 :531-45 (1997))，和(3)羧肽酶 Y (CPY)途径 (Marcusson et al.,上文，and Cooper & Stevens, J Cell Biol 133 :529-41 (1996))。CVT是特定类型的自体吞噬，通过CVT，在蛋白质合成之后，正常的细胞功能将居于液泡中的蛋白质从细胞质导向液泡。然而，这种途径一般不与去往分泌途径的重组蛋白质相互作用；因而，它不是提高蛋白质产量的机会。通过膜结合的ALP底物的羧基末端细胞质结构域中特定的信号相互作用，ALP途径将高尔基体中的膜结合蛋白质，例如，碱性磷酸酶递送到液泡。由于这种途径仅将跨膜蛋白质分选到液泡中，而跨膜蛋白质一般不是重组治疗蛋白质，这也不是提高治疗蛋白质生产的分泌产量的机制。酿酒酵母中第三种可选择的分选机制，CPY途径是一种过程，通过该过程，在晚期高尔基体中，前羧肽酶y(pro-Cpy，也称为Prcl)与液泡蛋白质分选受体VpslO (也称为P印I或Vptl)相互作用。通过许多具有VpslO的羧基末端细胞质结构域的蛋白质所介导的泡囊运输的方式，pro-Cpy被靶向称为前液泡复合物(PVC)(也称为多囊体(MVB))的中间区室。在PVC中pro-Cpy从VpslO解离之后,通过一组特定的蛋白质,VpslO被循环回晚期高尔基体。含有pro-Cpy的PVC泡囊然后被运输到液泡，与其他的蛋白质成分发生融合事件。pro-Cpy然后在液泡中成熟为活性的Cpy，分选完成。在起初考虑的三种途径中，CPY途径是与可溶性、分泌的重组蛋白质最相关的。由于分泌途径中的重组蛋白质在胞吐作用之前通过晚期高尔基体，它们有与VpslO相互作用的可能性。如果重组蛋白质含有与VpslO结合的序列，重组蛋白质将通过CPY途径被分选到液泡或溶酶体，并可能被蛋白酶降解，从而降低分泌率并限制滴度。我们猜测，通过消除通过这种途径的液泡分选，更多的重组蛋白质可以通过胞吐作用分泌，从而提高细胞生产力。虽然对于酿酒酵母中内源蛋白质的分泌途径已经了解很多，在本发明之前尚不知道的是异源表达的重组治疗蛋白质的滴度是否可以通过在发酵条件下在vpslO酵母突变体中表达编码异源蛋白质的基因来提高。也不知道的是在毕赤氏酵母细胞中vpslO同源物的功能性删除是否可以提高由细胞中表达载体内含有的基因所编码的重组蛋白质的分泌。为此，本发明的实施方式涉及酵母中重组蛋白质表达的主要瓶颈的鉴定。如上所述，在酿酒酵母中，VpslO负责结合前-Cpy以及将蛋白质定位到液泡。在巴斯德毕赤氏酵母中鉴定了 VPSlO基因的两种同源物，称为VPS10-1和VPS10-2。构建了在两个基因座vpslO-1和vpslO-2处产生无效突变的载体。质粒转化到巴斯德毕赤氏酵母中来产生这些基因的无效突变体。vpslO-1遗传突变体显示了 rh-GCSF和TNFRII-Fc的提高的分泌。vpslO-2敲除菌株不引起rhGCSF的提高的分泌，因此，在这个菌株中没有测试TNFRII-Fc分泌。我们的数据表明，通过在巴斯德毕赤氏酵母的反式-高尔基体网络(TGN)中的VpslO-I结合，rhGCSF和TNFRII-Fc都被靶向液泡用于降解。因而，在此展现的是，在毕赤氏酵母宿主细胞中，通过 VpslO 相互作用(Marcusson et al. , Cell 77 :579-86 (1994)), 一部分重组表达的蛋白质从正确的分泌途径中被重新确定路线到导向酵母液泡的可选择途径中。一旦蛋白质被分选到液泡或溶酶体，它们被从分泌途径中除去，并且被蛋白酶降解，因而降低了重组蛋白质的分泌率。在此显示的是，通过消除通过CPY途径的液泡分选，更多的重组蛋白质可以通过胞吐作用分泌，从而提高细胞生产力。根据本发明的实施方式，显示的是，巴斯德毕赤氏酵母VPSlO同源物VPS10-1的遗传灭活显著地提高了重组hGCSF和TNFRII-Fc向培养基的分泌。根据GCSF和TNFRII-Fc的已知氨基酸序列，在这些蛋白质的氨基末端附近鉴定出与“QRPL”共有VpslO结合序列高度同源的序列(参见实施例13，van Voorst etal. ,J.Biol.Chem. 271 :841-6 (1996))。此外，这些蛋白质的报道的晶体结构(Hill et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5167-71 (1993), Tamada et al. Proc. Acad. Sci. USA 103 3135-40(2006))表明它们含有表面暴露的肽。这些观察结果引致了在此描述的方法改进，其中，包含结合液泡蛋白质分选受体VpslO的“QRPL”样序列的重组蛋白质的分泌率，可以通过在所选宿主细胞中VPSlO或VPSlO同源物的遗传学改变来提高。因而，本发明提供了在酵母宿主细胞中生产重组蛋白质的方法，包括(a)用编码蛋白质的表达载体转化遗传修饰的真菌或酵母宿主细胞来产生宿主细胞，其中相对于相同物种的未修饰的真菌或酵母宿主细胞，所述遗传修饰的真菌或酵母细胞缺乏液泡分选活性，或具有降低的液泡分选活性；(b)在诱导发酵条件中蛋白质表达的条件下在培养基中培养所述转化的宿主细胞；以及(c)从所述转化的宿主细胞或培养基分离所述蛋白质。本发明还提供了一种在酵母或真菌宿主细胞中生产重组蛋白质的方法，所述方法包括(a)在遗传修饰的酵母或真菌宿主细胞中表达所述重组蛋白质，其中相对于相同物种的未修饰的酵母或真菌宿主细胞，所述遗传修饰的酵母或真菌宿主细胞缺乏液泡分选活性或具有降低的液泡分选活性；(b)在诱导发酵条件中蛋白质表达的条件下在培养基中培养所述遗传修饰的酵母或真菌宿主细胞；以及(c)从所述酵母或真菌宿主细胞或培养基分 离所述蛋白质。 在如上所述的本发明的方法的实施方式中，所述宿主细胞是酵母细胞。在特定的实施方式中，所述宿主细胞是毕赤氏酵母细胞，例如，巴斯德毕赤氏酵母。本发明进一步提供了一种在毕赤氏酵母宿主细胞中生产重组蛋白质的方法，包括(a)用编码蛋白质的表达载体转化遗传修饰的毕赤氏酵母细胞来产生宿主细胞，其中相对于相同物种的未修饰的毕赤氏酵母细胞，所述遗传修饰的毕赤氏酵母细胞缺乏液泡分选活性，或具有降低的液泡分选活性；(b)在诱导所述蛋白质表达的条件下在培养基中培养所述转化的毕赤氏酵母宿主细胞；以及(C)从所述转化的宿主细胞或培养基分离所述蛋白质。在本发明的这个方面的特定实施方式中，所述宿主细胞是巴斯德毕赤氏酵母细胞。根据在如上所述的本发明的方法，通过编码VpslO或VpslO蛋白质同源物的基因的遗传删除或破坏，可以从所选宿主细胞中消除或降低液泡分选活性。在本发明的这个实施方式中，例如，利用在翻译的核苷酸数据库中搜索相似蛋白质的计算机搜索程序，例如TBLASTN,使用已知的VpslO或已知的VpslO蛋白质同源物序列来搜索合适的酵母或真菌基因组，在期望的宿主细胞中鉴定出VpslO蛋白质同源物(参见实施例3)。本领域技术人员还可以通过基于酿酒酵母VPSlO的已知序列设计PCR引物或DNA探针，并筛选包含期望宿主的DNA的DNA文库，来鉴定期望的宿主细胞中的VPSlO基因同源物。酿酒酵母VpslO氨基酸序列在附图17中显示(SEQ ID NO 22) 0 一旦在期望的宿主细胞中鉴定出VpslO蛋白质同源物，如在此描述的，通过VPSlO基因同源物的删除或破坏，可以从该宿主细胞中功能上地删除液泡分选活性。在此提供了作为VpslO同源物的许多早先已知的序列，在附图15和16中显示了巴斯德毕赤氏酵母的((VpslO-I和VpslO-2，分别为SEQ ID NO 20和21)，附图18为黑曲霉的(SEQ ID NO 26)，附图19为粟酒酵母的(SEQ ID NO 27)，附图20为白色念珠菌的(SEQ ID NO 28)，附图21为光滑念珠菌的(SEQ ID NO 29)，附图22为树干毕赤酵母的(附图30)，附图23为汉逊德巴利酵母的(SEQ ID NO :181)，以及附图24为乳酸克鲁维酵母的(SEQ ID NO :182)。因而，这些序列的任何可以被靶向在合适的宿主细胞中删除或破坏，以开发缺乏液泡分选活性的宿主细胞。在本发明的方法中使用所述宿主细胞预计产生更高水平的重组蛋白质生产。另外，在酿酒酵母中与VpslO具有同源性的其他基因可以进行类似的功能，因而可以根据本发明来删除或破坏，以降低液泡分选活性和提高异源蛋白质产量。例如，酿酒酵母 Vthlp (SEQ ID NO :23)、酿酒酵母 Vth2p(SEQ ID NO :24)和酿酒酵母 YNR065C (SEQ IDNO :25)与VpslO具有同源性，被认为以与VpslO类似的方式起作用。期望的宿主细胞中VPSlO或VPSlO基因同源物的遗传灭活可以通过利用同源重组删除VpslO开放阅读框(ORF)来实现。做为选择，VPSlO基因或VPSlO基因同源物也可以包含功能性删除，其中不删除完整的0RF，而是存在取消或破坏VpslO功能的可选择的突变，例如，VPSlO基因或同源物的部分删除，包括单密码子删除、点突变和取代。可以用于取消VpslO的功能的其他方法包括但不限于控制参与液泡分选的基因表达的上游或下游调节序列的删除或破坏；2)通过化学、肽或蛋白质抑制物，液泡分选活性的取消或破坏；3)通过基于核酸的表达抑制物，例如，反义RNA、RNA干扰或siRNA，液泡分选活性的取消或破坏；4)通过转录抑制物或调节因子的表达或活性的抑制物，液泡分选活性的取消或破坏，所述调节因子控制或调节编码酶活性的基因的表达。虽然在此举例地显示了在缺乏液泡分选活性的酵母细胞中提高重组蛋白质hGCSF和TNFRII-Fc的分泌的方法，本领域技术人员将认识到,相对于野生型细胞中产生的重组蛋白质的水平，更高水平的任何重组蛋白质可以通过本发明的方法来实现，所述方法利用了缺乏或包含降低的液泡分选活性的遗传修饰的真菌或酵母宿主细胞。包含与“QRPL”共有VpslO结合序列具有同源性的氨基酸序列的重组蛋白质可在宿主细胞中与VpslO结合，导致向液泡的可选择输送，最终降低蛋白质产量。如在实施例13中讨论的,van Voorst和同事们(J Biol Chem 271 :841-6(1996))进行了氨基末端附近Cpy “QRPL”肽的诱变，来测定液泡分选有效性对序列保守性的要求。他们的分析显示了，除了在位置Gln24处，可以进行多个取代而不影响与VpslO的相互作用或不引起错误分选。因而，为与宿主细胞中的VpslO相互作用，重组蛋白质不需要与QRPL共有序列的绝对同源性，从而产生更低的产量。另外，显示了酿酒酵母液泡分选受体VpslO以不涉及“QRPL-样”分选结构域的未知机制与重组蛋白质如E. coli ￠-内酰胺酶相互作用(Holkeri and Makarow,FEBS Lett 429 162-6(1998))。由于在期望的宿主细胞中重组蛋白质与VpslO或VpslO同源物相互作用的广泛可能性，本发明的实施方式提供了通过VpslO的灭活或功能删除来对大范围的重组蛋白质提高重组产量的广泛方法，所述蛋白质例如治疗剂或生物蛋白质产品。通过将包含编码期望的蛋白质的核苷酸序列的表达载体转化到野生型酵母或真菌宿主细胞中以及缺乏功能性VpslO蛋白质活性的相同物种的宿主细胞中，以及通过例如ELISA分析、Western印迹、功能活性分析或任何其他标准的蛋白质检测分析来测试蛋白质表达，本领域技术人员可以容易地测试提高的蛋白质滴度。在本发明的这个实施方式的特定的方面中，通过将VpslO和/或Vps 10同源 物蛋白质，包括巴斯德毕赤氏酵母VpslO-I的位置改变到晚期高尔基体中它们的作用位点，从期望的宿主细胞中消除或降低液泡分选活性。已知的是在酿酒酵母中，VpslO通过蛋白质的羧基末端处的细胞质尾部通过蛋白质-蛋白质相互作用定位到晚期高尔基体(Jorgensen et al. ,Eur J Biochem 260 :461-9(1999) ；Cereghino et al. ,Mol Biol Cell6 1089-102(1995) ；Cooper et al. , J Cell Biol 133 :529-41, (1996) ；Dennes et al.，JBiol Chem 277 12288-93 (2002)) 0因而，根据本发明，通过VpslO细胞质尾部中单个氨基酸突变和/或删除可以消除液泡分选活性，这将改变VpslO的位置并阻止重组蛋白质分选到液泡中。因而，本发明的这个实施方式涉及在酵母或真菌宿主细胞中生产重组蛋白质的方法，包括(a)用编码所述蛋白质的表达载体转化遗传修饰的酵母或真菌宿主细胞来产生宿主细胞，其中相对于相同物种的未修饰的酵母或真菌宿主细胞，所述遗传修饰的酵母或真菌细胞缺乏液泡分选活性，或具有降低的液泡分选活性，其中所述遗传修饰的宿主细胞包含VpslO细胞质结构域的改变，所述改变改变VpslO的正常运输模式；(b)在诱导蛋白质的表达的条件下在培养基中培养所述转化的宿主细胞；以及(C)从所述转化的宿主细胞或培养基分离所述蛋白质。
在本发明的再其他的实施方式中，通过遗传学的改变从宿主细胞中降低或消除液泡分选活性，所述遗传学的改变功能性地删除编码与CPY液泡分选途径相关的蛋白质的一种或更多种基因，包括Ggal, Gga2(Dell ' Angelica et al. , J Cell Biol149 :81-94(2000)), Mvpl(Bonangelino et al.，Mol Biol Cell 13:2486-501(2002))，P印12(Robinson et al.，Mol Cell Biol 8 :4936-48 (1988)), Vpsl, Vps8, Vps9, VpslO,Vpsl5, Vps21 (Robinson et al.,上文),Vpsl9 (ffeisman, L. S. & Wickner, ff. J Biol Chem267 :618-23(1992)), Vps34(Schu et al. , Science 260 :88-91(1993))，Vps38(Rothmanet al. , Embo J 8 :2057-65 (1989)), Vps45 (Bryant et al. , Eur J Cell Biol 76 43-52 (1998))，和 Vtil (von Mollard et al. ,J Cell Biol 137:1511-24(1997))。在此提供了与CPY液泡分选途径相关的蛋白质的氨基酸序列(参见附图25)。在本发明进一步的实施方式中，通过遗传学的改变从宿主细胞中降低或消除液泡分选活性，所述遗传学的改变功能性地删除编码与VpslO从PVC到晚期高尔基体的再循环相关的蛋白质的一种或更多种基因(Seaman et al.，J Cell Biol 137:79-92，(1997)；Mullins et al. Bioessays 23 :333-43 (2001))，包括 Grdl9 (Hettema et al. Embo J 22:548-57(2003))，Rgpl，Ricl(Bonangelino et al. Mol Biol Cell 13:2486-501(2002))，Vps5, Vpsl7, Vps26 (Robinson et al.，Mol Cell Biol 8 :4936-48 (1988)),Vps29(Rothman et al. , Embo J 8 :2057-65 (1989)), Vps30, Vps35(Robinson et al.,上文)，Vps51(Conibear et al.，Mol Biol Cell 14 :1610-23 (2003))，Vps52，Vps53 和Vps54(Conibear et al. ,Mol Biol Cell 11 :305-23 (2000))。在此提供了与 VpslO 再循环相关的蛋白质的氨基酸序列(参见附图26)。在本发明的更进一步的实施方式中，通过遗传学的改变从宿主细胞中降低或消除液泡分选活性，所述遗传学的改变功能性地删除编码与适当的MVB功能和/或液泡融合相关的蛋白质的基因，包括Cczl(Kucharczyk et al. , J Cell Sci 113 Pt23 :4301-11 (2000)), Fabl (Yamamoto et al. , Mol Biol Cell 6:525-39 (1995))，Hsel (Bilodeau et al. ,J Cell Biol 163 :237-43 (2003)),Mrll(Bonangelino et al. ,MolBiol Cell 13 :2486-501(2002)), Vam3(Nichols et al. , Nature 387 199-202 (1997)),Vps2, Vps3, Vps4 (Robinson et al.,上文)，Vpsll (Rothman et al.,上文)，Vpsl3, Vpsl6,Vpsl8 (Robinson et al.，上文)，Vps20 (Yeo et al. , J Cell Sci 116 :3957-70 (2003)),Vps22, Vps23, Vps24, Vps25, Vps27, Vps28, Vps31, Vps32, Vps33, Vps36 (Robinson et al.，上文)，Vps37,Vps39 (Rothman et al.,上文)，Vps41 (Nakamura et al. , J Biol Chem 272 11344-9(1997)),Vps43(Sato et al. ,Mol Cell Biol 18 :5308-19(1998)),Vps44(Bowerset al.，Mol Biol Cell 11 :4277-94(2000))，Vps46 (Amerik et al.，Mol Biol Cell 11 3365-80(2000)), Vtal (Yeo et al.，上文)和 Ypt7 (Tsukada et al.，J Cell Sci 109 (Pt10) :2471-81 (1996)) o在此提供了与适当的MVB功能和/或液泡融合相关的蛋白质的氨基酸序列(参见附图27)。在此处描述的方法的可选择的实施方式中，通过遗传学的改变从宿主细胞中降低或消除液泡分选活性，所述遗传学的改变功能性地删除编码通过未知机制的适当Cpy液泡、革巴向所需的蛋白质的一种或更多种基因，包括Vps61, Vps62, Vps63, Vps64, Vps65, Vps66,Vps68, Vps69, Vps70,Vps71,Vps72,Vps73,Vps74 和 Vps75 (Bonangelino et al. ,Mol BiolCell 13:2486-501(2002))。在此提供了与通过未知机制的适当Cpy液泡靶向相关的蛋白质的氨基酸序列(参见附图28)。本发明还涉及通过消除或降低液泡分选活性来提高酵母细胞中产生的异源蛋白质产量的方法，其中通过化学、肽或蛋白质抑制物取消或破坏液泡分选活性。在本发明的这个方面中，可以利用阻断VpslO、VpslO-I或VpslO的其他同源物的肽抑制物，例如，Pro-Cpy的肽可以在表达感兴趣的异源蛋白质时被表达。Pro-Cpy肽将结合VpslO-I并饱和VpslO-1，从而阻止异源蛋白质的结合。化学抑制物对于取消液泡分选活性也是有用的。在本发明的这个方面的优选的实施方式中，所述化学抑制物是称为sortin的小的化学抑制物。已知的是sortins干扰植物和酵母中蛋白质的液泡递送(Norambuena et al. , BMCChem Biol 8 :1(2008) ；Zouhar et al. Proc Natl Acad Sci U S A 101 :9497-501 (2004))。根据本发明，sortins被添加到细胞培养物中，例如在酵母发酵期间，从而通过消除液泡分选和降解来提高感兴趣的异源蛋白质的产量。本领域技术人员将认识到，当使用这种方法用于治疗蛋白质生产时，sortins此后应当从纯化的重组蛋白质中清除。本发明进一步涉及提高异源蛋白质生产的产量的方法，其中所述异源蛋白质包含VpslO结合位点，包括向所述异源蛋白质的氨基酸序列中引入修饰，所述修饰阻止所述蛋白质与酿酒酵母VpslO或VpslO同源物例如巴斯德毕赤氏酵母VpslO-I结合。如在实施例13中描述的，如果分选肽被表面暴露，包含“QRPL-样”分选信号的重组蛋白质将可能结合VpslO,并将所述重组蛋白质导向酵母液泡。如上文描述的，消除液泡分选活性的早先的方法包括通过使编码VpslO或VpslO同源物的基因遗传学灭活而针对VpslO的方法。在此处描述的可选择的实施方式中，重组蛋白质或编码重组蛋白质本身的基因被突变以防止与VpslO 或 VpslO 同源物如 VpslO-I 结合。与 van Voorst 等人的论文(J. Biol. Chem. 271 841-6(1996)) 一致，在本发明的这个实施方式中，针对Gln-Arg-Pro-Leu (SEQ ID NO :176)VpslO分选信号的Gln残基来破坏，因为这个残基是VpslO相互作用所需的。因而，本发明还涉及包含“QRPL-样”分选信号的修饰的重组蛋白质，其中通过删除或取代，所述“QRPL-样”分选信号的Q残基被修饰。在其他方面中，本发明涉及生产相对于未修饰的蛋白质更高水平的包含QRPL-样分选信号的修饰的重组蛋白质的方法；所述方法包括(I)在促进所述蛋白质表达的条件下，在培养基中酵母或真菌宿主细胞中表达编码所述蛋白质的修饰的核苷酸序列；其中所述核苷酸序列被突变，从而使得所述重组蛋白质的QRPL-样分选信号无功能；以及(2)从所述宿主细胞或培养基分离所述蛋白质。任何真菌或酵母菌株可以被用作开发本发明的方法中使用的遗传修饰的宿主细胞的基础。所述遗传修饰的宿主细胞通过灭活液泡分选活性来修饰，例如，通过功能性删除VpslO或VpslO同源物，例如，通过删除或破坏编码VpslO或VpslO蛋白质同源物的基因。在本发明的方法中有用的酵母宿主细胞包括但不限于巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒酵母(Saccharomycespombe)、白色念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyvermyces fragilis)、克鲁维酵母属物种(Kluyveromyces sp.)、乳酸克鲁维酵母(Kluveromyces Iactis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、Pichia finlandica、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、Pichia thermotolerans、Pichiasalictaria、Pichia minuta(Ogataea minuta、Pichia lindneri)、Pichia guercuum、Pichia pi jperi、毕赤酵母属物种(Pichia sp.)、酵母属物种(Saccharomyces sp.)、Pichia membranaefaciens、Pichia opuntiae 和 Pichia methanolica。在此处描述的方法中有用的其他真菌宿主细胞包括构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、李氏木霉(Trichoderma reesei)、Chrysosporium lucknowense、键抱菌属物种(Fusarium sp.)、Fusarium gramineum、Fusarium venenatum 和粗糖链抱霉(Neurospora crassa)。在此处描述的方法的优选的实施方式中，所述酵母或真菌宿主细胞选自以下构成的组巴斯德毕赤氏酵母、酿酒酵母、黑曲霉、粟酒酵母、白色念珠菌、光滑念珠菌、树干毕赤酵母、汉逊德巴利酵母、乳酸克鲁维酵母和多形汉逊酵母。在进一步优选的实施方式中，所述宿主细胞是毕赤氏酵母细胞。在某些优选的实施方式中，所述宿主细胞是巴斯德毕赤氏酵母或酿酒酵母。在特定的实施方式中，所述宿主细胞是巴斯德毕赤氏酵母。在其他方面中，本发明涉及修饰的真菌宿主细胞，其包含VpslO活性的功能性删除或敲除，其中所述宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码异源蛋白质的核苷酸序列。在特定的实施方式中，本发明涉及相对于野生型巴斯德毕赤氏酵母细胞、缺乏液泡分选活性或具有降低的液泡分选活性的巴斯德毕赤氏酵母细胞，其中所述宿主细胞包含VpslO-I蛋白质，例如SEQ ID NO 20中所列的VpslO-I的功能性删除。所述巴斯德毕赤氏酵母细胞可以通过用表达载体转化细胞来进一步修饰来产生修饰的宿主细胞，所述表达载体包含编码异源蛋白质的核苷酸的序列，所述异源蛋白质例如生物蛋白质或治疗蛋白质。所述细胞对于通过提高它的分泌效率来生产高滴度异源蛋白质是有用的。在本发明的这个方面的优选的实施方式中，所述宿主细胞包含不被删除的VPS10-2基因，例如，SEQ ID NO:21中所列的VPS10-2。在本发明的进一步的实施方式中，在宿主细胞中生产的异源蛋白质是糖蛋白。在所述实施方式中，可能有用的是进一步修饰宿主细胞，以生产糖基化模式为人类样的糖蛋白，如下文所描述的。
相对于相同物种的未修饰的酵母细胞缺乏液泡分选活性或具有降低的液泡分选活性的本发明的修饰的酵母宿主细胞，可以被进一步修饰以表达糖蛋白，在所述糖蛋白中糖基化模式是人类样的或人源化的。照这样修饰酵母宿主细胞可以通过消除选定的内源糖基化酶和/或提供外源的酶来实现，由例如Gerngross，美国专利No. 7，029，872以及Gerngross等美国公开的申请No. 20040018590所描述的。例如，可以选择或工程化宿主细胞以耗尽1，6_甘露糖基转移酶活性(例如A0CH1)，不然其将在糖蛋白上的N-聚糖上添加甘露糖残基。在一个实施方式中，所述宿主细胞进一步包括融合到细胞靶向信号肽的al，2-甘露糖苷酶催化结构域，所述细胞靶 向信号肽通常不与所述催化结构域相连，并且被选择以将所述a 1，2_甘露糖苷酶活性靶向到宿主细胞的ER或高尔基体，在其中它可以最佳地起作用。这些宿主细胞产生包含Man5GlcNAc2糖形式的糖蛋白。例如，美国专利No. 7，029，872和美国公开的专利申请No. 2004/0018590和2005/0170452公开了能够生产包含Man5GlcNAc2糖形式的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。在进一步的实施方式中，宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的GlcNAc转移酶I(GnT I)催化结构域，所述信号肽通常不与该催化结构域相连，并且被选择以将GIcNAc转移酶I活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体，在此它可以最佳地起作用。这些宿主细胞产生包含GlcNAcMan5GlcNAc2糖形式的糖蛋白。美国专利No. 7，029, 872和美国公开的专利申请No. 2004/0018590和2005/0170452公开了能够生产包含GlcNAcMan5GlcNAc2糖形式的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。在又一个实施方式中，宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的甘露糖苷酶II催化结构域，所述信号肽通常不与该催化结构域相连，并且被选择以将甘露糖苷酶II活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体，在此它可以最佳地起作用。这些宿主细胞产生包含GlcNAcMan3GlcNAc2糖形式的糖蛋白。美国专利No. 7,029,872和美国公开的专利申请No. 2004/0230042公开了表达甘露糖苷酶II酶、并且能够生产主要具有GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形式的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。在进一步的实施方式中，宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的GlcNAc转移酶II(GnT II)催化结构域，所述信号肽通常不与该催化结构域相连，并且被选择以将GIcNAc转移酶II活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体，在此它可以最佳地起作用。这些宿主细胞产生包含GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形式的糖蛋白。例如，美国专利No. 7，029, 872和美国公开的专利申请No. 2004/0018590和2005/0170452公开了能够生产包含GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形式的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。在进一步的实施方式中，宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的半乳糖基转移酶催化结构域，所述信号肽通常不与该催化结构域相连，并且被选择以将半乳糖基转移酶活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体，在此它可以最佳地起作用。这些宿主细胞生产包含GalGlcNAc2Man3GlcNAc2或Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形式，或其混合物的糖蛋白。美国专利No. 7,029,872和美国公开的专利申请No. 2006/0040353公开了能够生产包含Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形式的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。在进一步的实施方式中，宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的唾液酸转移酶催化结构域，所述信号肽通常不与该催化结构域相连，并且被选择以将唾液酸转移酶活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。这些宿主细胞生产主要包含NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 糖形式或 NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 糖形式或其混合物的糖蛋白。有用的是所述宿主细胞进一步包括提供CMP-唾液酸用于向N-聚糖转移的手段。美国公开的专利申请No. 2005/0260729公开了遗传工程化低等真核生物以具有CMP-唾液酸合成途径的方法，美国公开的专利申请No. 2006/0286637公开了遗传工程化低等真核生物来生产唾液酸化的糖蛋白的方法。前述宿主细胞的任一种可以进一步包括选自由GnT III、GnT IV、GnT V、GnT VI和GnT IX构成的组的一种或更多种GIcNAc转移酶，以生产具有二分的(GnT III)和/或多触角的(GnT IV、V、VI和IX)的N-聚糖结构的糖蛋白，例如在美国公开的专利申请No. 2004/074458 和 2007/0037248 中公开的。在更进一步的实施方式中，产生主要具有GlcNAcMan5GlCNAC2N-聚糖的糖蛋白的宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的半乳糖基转移酶催化结构域，所述信号肽通常不与该催化结构域相连，并且被选择以将半乳糖基转移酶活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。这些宿主细胞产生主要包含GalGlcNAcMan5GlcNAc2糖形式的糖蛋白。 在进一步的实施方式中，产生主要具有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的糖蛋白的宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的唾液酸转移酶催化结构域，所述信号肽通常不与该催化结构域相连，并且被选择以将唾液酸转移酶活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。这些宿主细胞产生包含NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2糖形式的糖蛋白。各种前述宿主细胞进一步包括一种或更多种糖类转运蛋白，例如UDP-GlcNAc转运蛋白(例如，乳酸克鲁维酵母和小家鼠(Mus musculus)UDP_GlcNAc转运蛋白)、UDP-半乳糖转运蛋白(例如，果蚬(Drosophila melanogaster)UDP_半乳糖转运蛋白)和CPM-唾液酸转运蛋白(例如，人类唾液酸转运蛋白)。由于巴斯德毕赤氏酵母缺乏上述转运蛋白，优选的是，巴斯德毕赤氏酵母被遗传工程化以包括上述转运蛋白。为了降低或消除与针对宿主细胞蛋白质的抗体可检测的交叉反应性，重组的糖工程化酵母宿主细胞可以被遗传工程化，以通过删除或破坏一种或更多种3 -甘露糖基转移酶基因(例如，BMTU BMT2、BMT3和BMT4)(参见，美国公开的专利申请No. 2006/0211085)来消除具有a -甘露糖苷酶抗性N-聚糖的糖蛋白，和通过删除或破坏磷酸甘露糖基转移酶基因PNOl和MNN4B的一个或两者(参见，例如，美国专利No. 7，198，921和7，259，007)来消除具有磷酸甘露糖残基的糖蛋白，在进一步方面中其也可以包括删除或破坏MNN4A基因。破坏包括通过使用干扰RNA、反义RNA等等来破坏编码特定酶的开放阅读框，或破坏开放阅读框的表达，或取消编码3 -甘露糖基转移酶和/或磷酸甘露糖基转移酶的一种或更多种的RNA的翻译。宿主细胞可以进一步包括被修饰以产生特定N-聚糖结构的前述宿主细胞的任一种。可以在此处公开的方法的实践中使用的调节序列包括信号序列、启动子和转录终止子序列。启动子的实例包括来自许多物种的启动子，包括但不限于醇调节的启动子、四环素调节的启动子、类固醇调节的启动子(例如，糖皮质激素、雌激素、蜕皮激素、类视黄醇、甲状腺)、金属调节的启动子、病原体调节的启动子、温度调节的启动子和光调节的启动子。本领域公知的可调节启动子系统的特定实例包括但不限于金属可诱导的启动子系统(例如，酵母铜-金属硫蛋白启动子)、植物除草剂safner活化的启动子系统、植物热可诱导的启动子系统、植物和哺乳动物类固醇可诱导的启动子系统、Cym抑制物-启动子系统(Krackeler Scientific, Inc. Albany, NY)、RheoSwitch 系统(New England Biolabs,Beverly MA)、苯甲酸盐可诱导的启动子系统(参见W02004/043885)和逆转录病毒可诱导的启动子系统。本领域公知的其他特定的可调节启动子系统包括四环素可调节的系统(参见，例如，Berens & Hillen,Eur J Biochem 270 :3109-3121 (2003))、RU 486-可诱导系统、蜕皮激素-可诱导系统和卡那霉素-可调节系统。低等真核生物特异性启动子包括但不限于酿酒酵母TEF-I启动子、巴斯德毕赤氏酵母GAPDH启动子、巴斯德毕赤氏酵母GUTl启动子、PMA-I启动子、巴斯德毕赤氏酵母PCK-I启动子和巴斯德毕赤氏酵母A0X-1和A0X-2启动子。转录终止子序列的实例包括来自许多物种和蛋白质的转录终止子，包括但不限于酿酒酵母细胞色素C终止子；以及巴斯德毕赤氏酵母ALG3和PMAl终止子。酵母可选择标记物包括药物抗性标志物以及遗传功能，其容许所述酵母宿主细胞合成必需的细胞营养物，例如氨基酸。通常在酵母中使用的药物抗性标志物包括氯霉素、卡 那霉素、甲氨蝶呤、G418(geneticin)、Zeocin,等等。容许酵母宿主细胞合成必需细胞营养物的遗传功能，与在相应基因组功能中具有营养缺陷突变的现有酵母菌株一起使用。常见的酵母可选择标记物提供了合成亮氨酸(LEU2)、色氨酸(TRP1和TRP2)、脯氨酸(PROl)、尿嘧啶(URA3、URA5、URA6)、组氨酸(HIS3)、赖氨酸(LYS2)、腺嘌呤(ADE1或ADE2)的遗传功能，等等。其他酵母可选择标记物包括来自酿酒酵母的ARR3基因，其为在存在亚砷酸盐的情况下生长的酵母细胞赋予亚砷酸盐抗性(Bobrowicz et al. ,Yeast, 13 :819-828(1997)；Wysocki et al.，J. Biol. Chem. 272 :30061-30066(1997))。许多适合的整合位点包括在美国公开的申请No. 2007/0072262中例举的那些，包括酿酒酵母和其他酵母或真菌已知的座位的同源物。将载体整合到酵母中的方法是公知的，例如，参见美国专利No. 7，479，389、PCT公开的申请No. W02007136865和PCT/US2008/13719。插入位点的实例包括但不限于毕赤氏酵母ADE基因；毕赤氏酵母TRP(包括TRPl到TRP2)基因；毕赤氏酵母MCA基因；毕赤氏酵母CYM基因；毕赤氏酵母PEP基因；毕赤氏酵母PRB基因；和毕赤氏酵母LEU基因。毕赤氏酵母ADEl和ARG4基因已经在LinCereghino et al.，Gene 263 :159-169(2001)和美国专利 No. 4，818，700 中描述，HIS3 和TRPl 基因已经在 Cosano et al.，Yeast 14 :861-867(1998)中描述，HIS4 已经在 GenBankAccession No. X56180 中描述。为了描述和公开可以与本发明相联系使用的方法和材料，在此提及的所有出版物通过引用合并。在此的任何内容都不能解释为承认本发明没有资格根据在先的发明在日期上早于这种公开。参考附图描述了本发明的优选的实施方式，要理解的是本发明不限于这些明确的实施方式，由本领域的技术人员可以实行各种改变和修改而不背离如附随的权利要求中所定义的本发明的范围和精神。以下实施例说明但不限制本发明。材料和方法:实施例I菌株和培养基
E. coli菌株T0P10被用于重组DNA工作。这项研究中使用的所有引物和质粒以及选择的巴斯德毕赤氏酵母菌株在附图10和11中列出。蛋白质表达用缓冲的甘油-复合培养基(BMGY)和缓冲的甲醇-复合培养基(BMMY)来进行。BMGY培养基由2% martone、pH 6. 0的IOOmM磷酸钾缓冲液、I. 34%酵母氮基质、0. 00002%生物素和2%甘油组成作为生长培养基。BMMY含有与BMGY相同的成分，只是1%甲醇用作诱导介质代替甘油。YMD培养基由2% martone、2%葡萄糖和2%琼脂组成，用于在琼脂平板上生长巴斯德毕赤氏酵母菌株。限制和修饰酶购自New England BioLabs (Beverly, MA)。寡核昔酸获自IntegratedDNA Technologies (Coralville, IA) 盐和缓冲剂获自 Sigma (St. Louis, MO)。实施例2酵母菌株的转化使用表达/整合载体的酵母转化如下文中讨论了(Cregg et al. , Mol.Biotechnol. 16 :23-52 (2000))。巴斯德毕赤氏酵母菌株在50mL YMD培养基中生长过夜到 OD 0. 2到6. 0的范围。在冰上孵育30分钟之后，细胞通过在2500-3000rpm离心5分钟团粒化。除去培养基，细胞用冰冷的无菌IM山梨醇洗涤三次。细胞团粒然后重悬浮在0. 5mL冰冷的无菌IM山梨醇中。10 ii L线性化的DNA(1-10 u g)和100 u L细胞悬浮液组合到电穿孔比色杯中，在冰上孵育 5 分钟。使用 Bio-Rad GenePulser Xcell (Bio-Rad Laboratories,Hercules, CA)根据预设的巴斯德毕赤氏酵母方案(2kV，25 y F，200 Q )进行电穿孔在电穿孔之后立即地，ImL YMDS恢复培养基(YMD培养基加IM山梨醇)添加到混合物中。容许转化的细胞在室温下(26°C )恢复四小时到过夜的一段时间。在细胞恢复之后，细胞平铺在选择培养基上。实施例3巴斯德毕赤氏酵母中VpslO同源物的鉴定酿酒酵母中四种VpslO 同源物(Vpsl0p/P印lp/Vptlp(SEQ ID NO :22)、Vthlp (SEQID NO 23)、Vth2p (SEQ ID NO :24)和 YNR065C(SEQ ID NO :25)的蛋白质序列获自Genbank 。如在实施例14中讨论的，使用四种酿酒酵母蛋白质(上文)在拥有的巴斯德毕赤氏酵母基因组的TBLASTN计算机检索(Altschul et al. , J. Mol. Biol. 215(3)403-10(1990) ；Altschul et al.，Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402(1997))中鉴定了巴斯德毕赤氏酵母中可能的VPSlO基因同源物。鉴定了称为VPS10-1和VPS10-2的两种毕赤氏酵母基因同源物。VPS10-1 (SEQ ID NO 14)和VPS10_2(SEQ ID NO :15)的基因组DNA序列分别在附图 13 和 14 中提供。VpslO-Ip (SEQ ID NO 20)和 Vpsl0_2p (SEQ ID NO :21)的翻译的蛋白质序列分别在附图15和16中提供。巴斯德毕赤氏酵母VpslO同源物与酿酒酵母VpslOp，以及与其他真菌菌株的氨基酸序列比较在附图12中显示。实施例4基因删除质粒的产生构建质粒PGLY5192来删除VPS10-1基因的开放阅读框(参见附图I)，以及产生液泡分选受体(VpslO-lp)活性缺陷的酵母菌株。为了产生vpslO-lA敲除质粒pGLY5192，上游5'侧翼区域首先使用常规PCR条件用引物MAM338 (SEQ ID NO 1)和MAM339 (SEQ IDNO 2)以及巴斯德毕赤氏酵母NRRL-Y11430菌株基因组DNA作为模板来扩增。巴斯德毕赤氏酵母VPS10-1基因组区域，包括上游同源片段、启动子、开放阅读框(核苷酸1610-6238)以及下游的同源片段的核苷酸序列在附图13A-13G和SEQ ID NO 14中提供。产生的PCR片段使用限制性内切酶SacI和PmeI克隆到pGLY22b中来产生PGLY5191。下游的 3'侧翼区域使用引物 MAM340(SEQ ID NO 3)和 MAM341 (SEQ ID NO 4)以及巴斯德毕赤氏酵母NRRL-Y11430菌株基因组DNA作为模板来扩增。产生的片段使用限制性内切酶SalI和SwaI克隆至IJ pGLY5191中来产生pGLY5192。pGLY5192上游5'和下游3'片段进行测序来验证精确度。构建质粒PGLY5194来删除VPS10-2基因的开放阅读框(参见附图I)，以及产生液泡分选受体同源物(Vpsl0-2p)活性缺陷的酵母菌株。为了产生vpslO-2A敲除质粒PGLY5194，上游5'侧翼区域首先使用常规PCR条件用引物MAM439 (SEQID NO :5)和MAM343(SEQ ID NO 6)以及巴斯德毕赤氏酵母NRRL-Y11430菌株基因组DNA作为模板来扩增。巴斯德毕赤氏酵母VPS10-2基因组区域，包括上游同源片段、启动子、开放阅读框(核苷酸830-4509)以及下游的同源片段的核苷酸序列在附图14A-14E和SEQ IDNO 15中提供。产生的片段使用限制性内切酶SacI和PmeI克隆到pGLY22b中来产生pGLY5193。下游的V侧翼区域使用引物MAM440(SEQ ID NO :7)和MAM345 (SEQ ID NO 8)以及巴斯德毕赤氏酵母NRRL-Y11430菌株基因组DNA作为模板来扩增。产生的片段使用限制性内切酶SphI和SwaI克隆到pGLY5193中来产生pGLY5194。pGLY5194上游和下游片段进行测序来验证精确度。实施例5表达GCSF的巴斯德毕赤氏酵母菌株的产生编码智人(Homo sapiens)粒细胞-细胞因子刺激因子蛋白质(GCSF, GenbankNP_757373)的 DNA 由 DNA2. 0，Inc. (Menlo Park, CA)合成，插入到 pUC19 质粒中来制得称为 pGLY4316 的质粒(参见附图 2，SEQ ID NO 16 和 SEQ ID NO :168)。构建含GCSF的随后的质粒，所述GCSF是用引物MAM227 (SEQ ID NO : 10)和MAM228 (SEQ ID NO :11)使用常规PCR条件从pGLY4316扩增的。PCR引物MAM27在编码成熟GCSF蛋白质(GCSFp)的DNA的5'末端引入XhoI和MlyI限制性位点，以及在编码GCSFp的DNA的3'末端引入FseI位点。编码将GCSF导向分泌途径的偶配因子-ILl P信号肽(Han et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 18 ；337 (2) :557-62. (2005) ；Lee et al.,Biotechnol Prog. 15(5) :884-90(1999))的 DNA 片段用 EcoRI 和 MlyI 消化从质粒 pGLY4321中除去。PCR扩增的产物用FseI和MlyI消化，与信号肽编码片段三重连接到用EcoRI和FseI消化的质粒pGLY1346中，来产生质粒pGLY4335 (参见附图2)，其中编码成熟GCSF的开放阅读框(ORF)的5'末端按阅读框连接到编码信号肽的ORF的3'末端，这产生融合蛋白质，其中成熟GCSF的N-末端被融合到信号肽的C-末端。利用引物MAM281(SEQ ID NO9)和MAM228(SEQ ID NO :11)通过PCR从pGLY4335扩增GCSF开放阅读框。PCR扩增的产物用MlyI和FseI限制性内切酶消化(附图2)。引物MAM281含有与GCSF ORF处于阅读框中的ATG密码子。因而，产生的消化的扩增PCR产物含有向编码成熟GCSF的开放阅读框(0RF)5'末端按阅读框添加的ATG翻译起始密码子。产生片段含有“ATG”核苷酸的按阅读框的添加，其编码N-末端甲硫氨酸，与Neupogen (filgrastim, Amgen Inc. , ThousandOaks, CA)蛋白质序列(SEQ ID NO :172)相同。
巴斯德毕赤氏酵母CLPl基因(SEQ ID NO 17)使用常规PCR条件从来自巴斯德毕赤氏酵母菌株NRRL-Y11430的染色体DNA中，使用引物MAM304(SEQ ID N0:12)和MAM305 (SEQ ID NO : 13)扩增，用EcoRI和StuI限制性内切酶消化。使用编码巴斯德毕赤氏酵母CLPl (PpCLPl)的EcoRI/StuI消化的片段、编码rHuMetGCSF的Mlyl/Fsel消化的片段以及质粒pGLY1346(用EcoRI和FseI消化的)进行三段连接反应来产生质粒PGLY5178，如附图2中所示。插入的DNA进行测序来验证精确性。pGLY5178质粒中还含有的是AOXl (醇氧化酶)启动子，其驱动CLP1-GCSF融合物的完整ORF的表达，其包括跟随着接头序列 “GGGSLVKR”(SEQ ID NO :175)和 rhMet_GCSF(SEQ ID NO :18 和 170)的完整PpClpl蛋白质序列。在含有甲醇的培养基中DNA转录时，转录的mRNA通过Clplp信号妝进入内质网。所述多妝在闻尔基体中被Kex2蛋白酶进一步加工，所述酶在接头序列中的精氨酸残基之后裂解，将Clpl和Met-GCSF两种蛋白质释放到上清液部分中(参见US2006/0252069)。加工的和分泌的Clpl和Met-GCSF的蛋白质序列在SEQ ID NO :171和172中提供。为了表达Met-GCSF，质粒pGLY5178用限制性内切酶PmeI线性化，用于通过滚卷单交叉同源重组转化菌株YGLY8069来产生菌株yGLY8538 (参见附图4)。该菌株含有几个拷贝的、编码整合到AOX I基因座中的rHuMetGCSF的表达盒。菌株将rHuMetGCSF分 泌到培养基中。菌株 YGLY8538 的基因型是 ura5 A ScSUC2 ochl A lacZbmt2 A IacZ/K1MNN2-2 mnn4LlA lacZ/MmSLC35A3 pnolAmnn4A IacZ PROl::lacZ/TrMDSI/FB53bmtlA IacZ bmt4 A IacZ bmt3 A IacZ dap2A ::lacZ_URA5_lacZ stel3 A :NatRAOXl:Shble/AOXlp/CLPl-GGGSLVKR-MetGCSF。实施例6yGLY8538突变菌株的产生通过如早先描述的同源重组自yGLY8538产生同基因的突变酵母菌株(参见附图 4) (Nett and Gerngross, Yeast 20:1279-90(2003))。亲本 ura5A 菌株用线性化的质粒转化，所述质粒含有期望的开放阅读框的上游和下游大约IOOObP的侧翼DNA。在获得lacZ-URA5-lacZ盒之后在URA漏失(drop out)平板上选择突变转化体(Nett andGerngross,上文)，通过PCR分析来验证正确的遗传分布。质粒pGLY5192 (vpslO-1 A )和pGLY5194(vpslO-2A)在这项研究中用于诱变。突变菌株扩增的流程图在附图6中显示。菌株 yGLY9933 和 yGLY10566 分别产自用 pGLY5192 (vpslO-1 A )和 pGLY 5194 (vpslO-2 A )对yGLY8538的转化。此外，通过yGLY9933的反选择构建了双敲除(vpslO-1 A/VpS10-2 A )来产生yGLY9982。质粒pGLY5194电穿孔到yGLY9982中来产生具有vpslO-1 A /vpslO-2 A基因型的菌株yGLY10557。实施例7表达TNFRII-Fc的巴斯德毕赤氏酵母菌株的产生编码肿瘤坏死因子拮抗剂TNFRII-Fc (美国申请系列号No. 61/256369)的DNA由GeneArt AG (Regensburg, Germany)合成。全蛋白 T0P0 克隆(Invitrogen)来产生pGLY3452。TNFRII-Fc开放阅读框用PvuII和FseI释放，以与HSA信号肽和质粒主干pGLY2198 (EcoRI和FseI) —起克隆，所述信号肽获自合成的寡核苷酸并用EcoRI和MlyI消化。E. coli中的三重连接和转化产生表达质粒pGLY3465(参见附图3)。分别在SEQ ID NO 19和174中提供了 TNFRII-Fc的DNA和蛋白质序列。为了表达TNFRII-Fc，pGLY3456用SpeI线性化，并电穿孔到菌株 yGLY8292 (VPSlO-I)、yGLY9992 (vpslO-1 A )和 yGLY9993 (vpslO-1 A )中。来自yGLY8292的vpslO-1 A突变菌株如附图5所示使用质粒pGLY5192产生。 实施例8 生物反应器筛选和发酵过程牛物反应器筛诜用于rhGCSF表汰的牛物反应器筛诜在以下条件下在SIXF0RS多发酵系统(ATR Biotech, Laurel, MD)中在0. 5L容器中进行pH 6. 5、24°C、0. 3标准升每分钟，以及550rpm的初始搅拌子速度。初始工作体积是350mL，其由330mL BMGY培养基和20mL接种物组成。IRIS多发酵器软件(ART Biotech, Laurel,MD)用于在10小时内线性地将搅拌子速度从550rpm提高到1200rpm,在接种一小时后开始。种子培养物(在IL挡板烧瓶中200mL的BMGY)直接从琼脂平板接种。种子烧瓶在24°C孵育72小时来达到95到100之间的光密度(0D_)。发酵器与200mL稳定期烧瓶培养物接种，所述培养物是通过离心浓缩到20mL的。分批期在初始进料甘油(18-24h)发酵完成时结束，继之以第二分批期，其通过添加17mL的甘油给料溶液(50% [w/w]甘油，5mg/L生物素，12. 5mL/LPTMl盐(65g/L FeSO4. 7H20, 20g/L ZnCl2,9g/L H2SO4,6g/L CuSO4. 5H20, 5g/L H2SO4, 3g/L MnSO4. 7H20,500mg/L CoCl2. 6H20，200mg/L NaMoO4. 2H20，200mg/L 生物素，80mg/L Nal，20mg/L H3BO4))来启动。在由溶解氧中的尖峰所指示的第二分批期完成时，通过以0. 6g/h饲喂甲醇给料溶液(100% MeOH 5mg/L生物素，12. 5mL/L PTM1) 32-40小时来启动诱导期。通过离心收获培养物。平台发酵过稈牛物反应器培养在3L和15L玻璃生物反应器(Applikon，FosterCity, CA)和40L不锈钢蒸汽生物反应器(Applikon, Foster City, CA)中进行。种子培养物通过直接用冷冻的储备小瓶以I %体积比接种BMGY培养基来制备。种子烧瓶在24°C孵育48小时来获得20±5的光密度(0D600)以确保细胞在转移时指数地生长。培养基每升含有 40g 甘油、18. 2g 山梨醇、2. 3g K2HPO4Ul. 9g KH2P04、IOg 酵母提取物(BD, FranklinLakes,NJ)、20g蛋白胨(BD,Franklin Lakes,NJ)、4X l(T3g生物素和 13. 4g酵母氮基质(BD,Franklin Lakes,NJ) 0生物反应器用种子与初始培养基10%的体积比来接种。培养在以下条件下以进料-分批方式进行温度设置在24±0. 5°C，pH值用NH40H控制到6. 5±0. 1，溶解氧通过在添加02时分级调整(cascading)搅动速率来维持在I. 7±0. lmg/L。空气流速维持在0. 7vvm。在初始进料甘油(40g/L)耗尽之后，50% (w/w)甘油溶液(含有12. 5mL/LPTM2盐和12. 5ml/L 25XBiotin)以0. 08h_l的速率，自5. 33g/L/hr开始(极限生长速度的50% )指数地饲喂八小时。在30分钟饥饿期之后启动诱导，此时甲醇(含有12. 5ml/L的PTM2盐和12. 5ml/L的25XBiotin)自2g/L/hr开始指数地饲喂以维持0. OltT1的比生长速率。对于YGLY8538，使用高甲醇给料速率(在6小时期间从2. 33g/L/hr到6. 33g/L/hr的上升的甲醇给料速率,诱导的全过程维持在6. 33g/L/hr)和通过将0. 68g/L Tween 80添加到甲醇中来产生rHuMetGCSF。发酵pH值减低到5. 0，作为这种和随后的菌株的工艺改进。对于YGLY9933，使用高甲醇给料速率、0. 68g/L Tween 80和发酵pH值5. O。实施例9深孔诱导平板 TNFRII-Fc的滴度改进利用深孔平板筛选来测定。转化体接种到600 U L BMGY中，在840rpm下的微平板摇动器上24°C生长两天。产生的50 y L种子培养物转移到每孔含有600 u L新鲜BMGY的两个96孔平板，在如上相同的培养条件下孵育两天。两个扩增平板组合为一个平板，然后在IOOOrpm下离心5分钟。在每孔600 y L BMMY中诱导细胞团粒两天，然后离心400 u L，通过ELISA分析澄清的上清液。实施例10GCSF滴度测定澄清的上清液部分用标准的ELISA方案分析GCSF滴度。简要地，多克隆抗GCSF(R&D Systems ,Minneapolis,MN, Cat#MAB214)包被在 96 孔高结合平板(Corning ，Corning, NY, Cat#3922)上，阻断并洗涤。rhGCSF 蛋白质标准物(R&D Systems ,Cat. #214-CS)和无细胞上清液的连续稀释物施加到上述平板，孵育I小时。在洗涤步骤之后，单克隆的抗-GCSF(R&D Systems ，Cat#AB-214-NA)添加到平板并孵育I小时。在洗漆之后，添加碱性磷酸酶轭合的山羊抗-小鼠IgG Fe (Thermo Fisher Scientific ,Waltham,MA, Cat#31325)并孵育I小时。洗涤平板，添加荧光检测试剂4-MUPS，在无光的情况下孵育。在 TECAN 突光计(Tecan Group, Ltd. ,Mannedorf, Switzerland)上以 340nm激发和465nm发射性质测量荧光强度。实施例11TNFRII-Fc 滴度测定澄清的上清液部分用标准的ELISA方案分析TNFRII-Fc滴度。简要地，单克隆的抗人 sTNFRII/TNFRSF1B(R&D Systems , Cat#MAB726)包被在 96 孔高结合平板(Corning ,Cat# 3922)上，阻断并洗涤。TNFRII-Fe 蛋白质标准物(商业 ENBREL ，Amgen，ThousandOaks,CA)和无细胞上清液的连续稀释物施加到上述平板，孵育I小时。在洗涤步骤之后，多克隆抗人sTNFRII/TNFRSF1B(R&D Systems ，Cat#AB_26_PB)添加到平板并孵育I小时。在洗涤之后，添加碱性磷酸酶轭合的驴抗山羊IgG(Santa Cruz ，Cat#SC_2022)，孵育I小时。洗涤平板，添加荧光检测试剂4-MUPS，在无光的情况下孵育。在TECAN荧光计上以340nm激发和465nm发射性质测量荧光强度。实施例12细胞裂解测定通过分析发酵上清液中双链DNA的量来测量细胞裂解。根据厂家的建议，Quant-iT PicoGreen 分析试剂盒(Invitrogen Corp. , Carlsbad, CA)用于分析 dsDNA。结果:实施例13人类GCSF和TNFRII-Fc含有典型的VpslO结合序列在酿酒酵母中，VpslO (也称为P印I或Vptl)受体负责通过“QRPL-样”分选信号(Gln24-Arg-Pro-Leu27, SEQ ID NO :176)结合前羧肽酶 y (pro-Cpy，也称为 Prcl)，并将 pro-Cpy 转运到液泡(Marcusson et al. Cell 77 :579-86 (1994) ；Valls et al. Cell48 :887-97 (1987))。早先的研究集中于酿酒酵母中Cpy的分选，来检查结合相互作用。这些研究鉴定了 VpslO腔受体结构域的两个区域，每一个具有独特的配体结合亲和性(Jorgensen et al. Eur J Biochem 260:461-9(1999) ；Cereghino et al. Mol Biol Cell6 :1089-102(1995) ；and Cooper & Stevens J Cell Biol 133:529-41(1996))。另外，vanVoorst和同事们(J Biol Chem 271 :841-6(1996))进行了氨基末端附近Cpy “QRPL”肽的诱变，来测定液泡分选有效性对序列保守性的要求。他们的分析显示了，除了在位置Gln24处，可以进行多个取代而不影响与VpslO的相互作用或引起错误分选。酿酒酵母VpslO受体也显示了以不涉及“QRPL-样”分选结构域的未知机制与重组蛋白质，例如，E. coli3 _ 内酸胺酶相互作用(Holkeri and Makarow, FEBS Lett 429:162-6(1998))。在酿酒酵母中，早先的研究鉴定了具有潜在分选活性的VpslO的三种其他的同源物(Vthl、Vth2、YNR065C，参见附图 12) (Cooper & Stevens J Cell Biol 133 :529-41 (1996) ;Westphalet al. J Biol Chem 271(20) :11865-70(1996) ；Tarassov K, et al. Science 320(5882)1465-70(2008))。我们在重组人类粒细胞-集落刺激因子(rhGCSF)和TNFRII-Fc的氨基末端附近鉴定出具有VpslO分选序列特征的序列(van Voorst et al (1996),上文)。这些序列是 GCSF (参见 Genbank NP_757373 或 SEQ ID NO :168)的 “QSFL” (SEQ ID NO :177)，以及TNFRII-Fc (参见 SEQ ID NO :174)的“QVAF”(SEQ ID NO :178)。如在表 I 中显示的，rhGCSF和TNFRII-Fc的推定的Vps 10结合结构域中每四个氨基酸位置与早先的Cpy液泡靶向诱变结果相比较(Tamada et al. Proc Natl Acad Sci USA 103:3135-40,11(2006) ；vanVoorst et al. (1996)，上文)。当rhGCSF和TNFRII-Fc中的分选肽的氨基酸与相应突变的 pro-Cpy蛋白质相比时,所有的突变体都被报道显示不低于85%的活性(参见上文的vanVoorst et al. (1996)附图3)。这些数据表明，如果是表面暴露的，rhGCSF和TNFRII-Fc中分选肽将可能结合VpslO受体，并将重组蛋白质导向酵母液泡。表I可能的VpslOp-结合基序
I白盾 N.太端序歹I]_对S.c. Cdv “ORPL”的相对效率％
hGCSF iTpLGPASSLPOSFLLK ( SEQ ID NO: 179 ) 100-85-90-100 TNFRH-Fc iLpaovaftp (seq id no i so)100-100-90-100此外，两种肽都被定位到相应蛋白质的能够与VpslO相互作用的表面暴露区域中(Hill et al. Proc Natl Acad Sci U S A 90:5167-71(1993)，Tamada et al. (2006)，上文)。基于GCSF和TNFRII-FC通过N-末端分选序列和它们的表面暴露而与VpslO受体结合的可能性，我们猜测，P. P. VPS10同源物中的突变将通过消除液泡分选而改善rhGCSF和TNFRII-Fc的分泌产量。实施例14巴斯德毕赤氏酵母中VpslO的同源物巴斯德毕赤氏酵母基因组DNA序列的TBlastN检索显示了在巴斯德毕赤氏酵母中VPS10的两个基因同源物，称为VPSlO-I和VPS10-2(参见实施例3)。酿酒酵母和巴斯德毕赤氏酵母VpslO蛋白质同源物的比较在附图12中显示。酿酒酵母VpslO是1579aa,巴斯德毕赤氏酵母VPS10-1为29. 99%相同的(1542aa)，巴斯德毕赤氏酵母VpslO-2是25. 4%相同的(1502aa)。巴斯德毕赤氏酵母VpslO-I与VpslO-2蛋白质之间的比对显不了 41.0%的相似性和26. 8%的同一性。类似于酿酒酵母VpslO，两种巴斯德毕赤氏酵母蛋白质具有用于进入内质网的预测的N-末端信号肽，两个C-末端富有区域，以及接近C-末端的单个预测的跨膜结构域(Horazdovsky et al. Curr Opin Cell Biol 7 :544-51 (1995))(数据未显示)。
如以上讨论的，巴斯德毕赤氏酵母VpslO蛋白质(VpslO-I和VpslO-p)与酿酒酵母VpslO的比对展现了相对低的37-43的同一性百分比；而其他酿酒酵母VpslO同源物(Vthlp、Vth2p、YNR065C)与酿酒酵母VpslO的比对展现了 58-75同一性百分比(附图12)。因而，根据单独的序列分析，不能确定两种巴斯德毕赤氏酵母Vps 10同源物是否与酿酒酵母VpslO类似地起作用。从Genbank (National Center for Biotechnology Information (NCBI),Bethesda，MD)中鉴定了其他真菌VpslO同源物，并与酿酒酵母VpslO比对(附图12)。以下GenBank 登记号被确定为VpslO同源物黑曲霉(CAK38444，SEQ ID NO :26，附图18)、粟酒裂殖酵母(CAA16914. I，SEQ ID NO :27，附图 19)、白色念珠菌(EAK91536, SEQ ID NO :28，附图20)、光滑念珠菌(CAG60842. I, SEQ ID NO :29，附图21)、树干毕赤酵母(NC_009068. 1，SEQ ID NO :30，附图 22)、汉逊德巴利酵母(XP_002770499.，SEQ ID NO 181, SEQ ID NO:
23)和乳酸克鲁维酵母(XP_454425，SEQ ID NO :182，附图24)。粟酒裂殖酵母的数据表明，虽然VpslO受体与酿酒酵母VpslO仅有23. 6的同一性百分比，它展现了类似的功能(Iwaki et al. Microbiology 152:1523-32(2006) ；Takegawa et al. Cell Struct Funct 28 :399-417(2003) ；Takegawa et al. Curr Genet 42:252-9(2003))。总之，生物信息学数据表明，两种巴斯德毕赤氏酵母VpslO同源物可能具有类似于酿酒酵母VpslO受体的功能。实施例15VpslO-I 活性降低 rhGCSF 滴度亲本rhGCSF表达菌株yGLY8538利用了 AOXl启动子来转录GCSF。亲本菌株利用5-氟乳清酸(5-F0A)反选择来产生突变菌株(参见附图6和11B)。巴斯德毕赤氏酵母vpslO-1 A (yGLY9933)和vpslO_2A (yGLY10566)的同基因的突变体(URA5+)分别通过质粒PGLY5192和pGLY5194的电穿孔来产生(参见实施例1-11，附图I) ^pslO-IA和vpslO_2A突变对 rhGCSF 分泌的作用使用 Sixfors 发酵器(ATR Biotech, Laurel,MD)和 GCSF ELISA分析(参见实施例10)来测定。结果显示了，vpslO-lA突变体yGLY9933相对于yGLY8538分泌了超过七倍的rhGCSF (附图7A)。令人惊讶地，vpslO-2 A突变体yGLY10566不分泌任何可检测的rhGSCF。来自yGLY10566的发酵上清液经过SDS-PAGE分析，显示了总分泌蛋白质的显著的消失(数据未显示)。这些结果表明，VpslO-I和VpslO-2的功能在它们与rhGCSF相互作用方面不是冗余的。来自vpslO-lA vpslO-2A双突变体(yGLY10557)的结果展现了，vpslO_2A突变相对于vpslO-1 A突变是优势的，从而rhGCSF(附图7A)和所有分泌蛋白质的大部分被剧烈地降低(未显示)。还分析了这些发酵样品的细胞裂解，通过从细胞释放到上清液部分的双链DNA来测量。由于我们没有见到在发酵条件中酵母vpslO突变体的任何公开文献，可能的是在高生物质发酵条件期间，如果正常的液泡功能被改变，细胞适应性可能变得受损。这一点如果发生，细胞可能裂解并释放双链DNA到上清液部分中。然而，附图7B中显示的数据表明，vpslO-1 A和/或VpslO-2A的突变不诱导细胞裂解。实施例16VpslO-I 活性降低 TNFRII-Fc 滴度由于TNFRII-Fc也含有N-末端中的推定的VpslO结合基序，我们在有和没有功能性VpslO-I的细胞谱系中转化了表达载体PGLY3465。诱导至少i^一个独立的转化体的蛋白质表达。独立地计算了 ELISA滴度，然后对每个宿主菌株进行平均。根据每个宿主菌株的平均ELISA滴度除以野生型亲本菌株yGLY8292的平均ELISA滴度，测定相对ELISA滴度。(附图8)这个数据清楚地显示了，vps 10-1 A突变菌株(yGLY9992和yGLY9993)展现了相比亲本野生型菌株yGLY8292大约10倍高的TNFRII-Fc分泌水平。实施例17巴斯德毕赤氏酵母VpslO-I功能的模型数据表明，VpslO-I能够与穿越巴斯德毕赤氏酵母的分泌途径的重组蛋白质相互作用。附图9A表明，使用rhGCSF作为模型蛋白质，重组蛋白质向具有VpslO-I正常功能的液泡的改变的递送。相比之下，附图9B说明了当VpslO-I的活性被消灭或降低，rhGCSF向上清液部分的高效的分泌。从而VpslO-I活性的降低使得细胞在重组蛋白质分泌方面是更 有生产力的。
权利要求
1.ー种相对于野生型巴斯德毕赤氏酵母细胞缺乏液泡分选活性或具有降低的液泡分选活性的巴斯德毕赤氏酵母细胞，其中所述宿主细胞包含液泡蛋白质分选受体10-KVPS10-1)的功能性删除。
2.权利要求I的巴斯德毕赤氏酵母细胞，其中所述细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码异源蛋白质的核苷酸的序列。
3.权利要求2的巴斯德毕赤氏酵母细胞，其中所述异源蛋白质是糖蛋白。
4.权利要求3的巴斯德毕赤氏酵母细胞，其中所述细胞被修饰以表达糖蛋白，在所述糖蛋白中糖基化模式是人类样的。
5.权利要求1-4的任一项的巴斯德毕赤氏酵母细胞，其中编码VPS10-1的基因被删除，以及编码VPS10-2的基因不被删除。
6.权利要求1-4的任一项的巴斯德毕赤氏酵母细胞，其中编码VPS10-1的基因包含使得编码的VpslO-I蛋白质无功能或没有液泡分选活性的突变。
7.权利要求1-4的任一项的巴斯德毕赤氏酵母细胞，其中所述VpslO-I活性的功能性删除包括选自以下构成的组的改变=VPSlO-I基因的上游或下游调节序列的删除或破坏，通过VpslO-I蛋白质的化学、肽或蛋白质抑制物的液泡分选活性的取消，通过基于核酸的表达抑制物的液泡分选活性的取消，以及通过转录抑制物的液泡分选活性的取消。
8.ー种在酵母或真菌宿主细胞中生产重组蛋白质的方法，包括 a.用编码蛋白质的表达载体转化遗传修饰的酵母或真菌细胞来产生宿主细胞，其中相对于相同物种的未修饰的酵母或真菌细胞，所述遗传修饰的酵母或真菌细胞缺乏液泡分选活性，或具有降低的液泡分选活性； b.在诱导发酵条件中蛋白质表达的条件下在培养基中培养所述转化的酵母或真菌宿主细胞；以及 c.从所述转化的宿主细胞或培养基分离所述蛋白质。
9.权利要求8的方法，其中所述酵母或真菌宿主细胞选自以下构成的组巴斯德毕赤氏酵母、酿酒酵母、黑曲霉、粟酒裂殖酵母、白色念珠菌、光滑念珠菌、树干毕赤酵母、汉逊德巴利酵母、乳酸克鲁维酵母和多形汉逊酵母。
10.权利要求8或9的方法，其中通过从酵母或真菌细胞基因组中删除或破坏编码VPSlO或VPSlO同源物的基因，来消除或降低液泡分选活性。
11.权利要求10的方法，其中所述酵母或真菌宿主细胞是巴斯德毕赤氏酵母。
12.权利要求11的方法，其中VPSlO同源物VPSlO-I被删除。
13.—种在毕赤氏酵母宿主细胞中生产重组蛋白质的方法，包括 a.用编码蛋白质的表达载体转化遗传修饰的毕赤氏酵母细胞来产生宿主细胞，其中相对于相同物种的未修饰的毕赤氏酵母细胞，所述遗传修饰的毕赤氏酵母细胞缺乏液泡分选活性，或具有降低的液泡分选活性； b.在诱导所述蛋白质表达的条件下在培养基中培养所述转化的毕赤氏酵母宿主细胞；以及 c.从所述转化的宿主细胞或培养基分离所述蛋白质。
14.权利要求13的方法，其中所述宿主细胞是巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞。
15.权利要求14的方法，其中所述遗传修饰的巴斯德毕赤氏酵母细胞包含VPS10-1的删除。
16.权利要求8-11的任ー项的方法，其中所述遗传修饰的宿主细胞包含VpslO或VpslO同源物的细胞质结构域的改变，所述改变改变它的正常运输模式。
17.权利要求8或权利要求9的方法，其中通过删除或破坏与CPY液泡分选途径相关的ー种或更多种基因来降低或消除液泡分选活性，其中所述ー种或更多种基因编码选自以下构成的组的蛋白质Ggal、Gga2、Mvpl、Pepl2、Vpsl、Vps8、Vps9、Vpsl5、Vps21、Vpsl9、Vps34、Vps38、Vps45和 VtiI。
18.权利要求8或权利要求9的方法，其中通过删除或破坏编码与VpslO向晩期高尔基体的再循环相关的蛋白质的ー种或更多种基因来降低或消除液泡分选活性，其中所述ー种或更多种基因编码选自以下构成的组的蛋白质Grdl9、Rgpl、Ricl、VpS5、VpS17、VpS26、Vps29、Vps30、Vps35、Vps51、Vps52、Vps53 和 Vps54。
19.权利要求8或权利要求9的方法，其中通过删除或破坏编码与MVB功能相关的蛋白质的ー种或更多种基因来降低或消除液泡分选活性，其中所述ー种或更多种基因编码选自以下构成的组的蛋白质Cczl、Fabl、Hsel、Mrll、Vam3、Vps2、Vps3、Vps4、Vpsll、Vpsl3、Vpsl6、Vpsl8、Vps20、Vps22、Vps23、Vps24、Vps25、Vps27、Vps28、Vps31、Vps32、Vps33、Vps36、Vps37、Vps39、Vps41、Vps43、Vps44、Vps46、Vtal 和 Ypt7。
20.权利要求8或9的方法，其中所述表达载体编码糖蛋白，以及其中所述修饰的宿主细胞被进ー步修饰以表达糖基化模式为人类样的糖蛋白。
全文摘要
本发明涉及在修饰的酵母宿主细胞，例如巴斯德毕赤氏酵母中生产高滴度重组蛋白质的方法，其中相对于相同物种的未修饰的酵母宿主细胞，所述修饰的酵母细胞缺乏液泡分选活性或具有降低的液泡分选活性。在特定的实施方式中，通过删除或破坏编码Vps10或Vps10同源物的基因来降低或消除液泡分选活性。本发明还涉及根据在此公开的方法被修饰的修饰的酵母细胞。
文档编号C12N1/00GK102686731SQ201080051951
公开日2012年9月19日 申请日期2010年10月25日 优先权日2009年10月30日
发明者B-K·蔡, H·林, M·米尔 申请人:默沙东公司