蛋白质的分泌产生方法

蛋白质的分泌产生方法
【专利摘要】开发了一种改善棒状杆菌型细菌对异源蛋白质的分泌产生的新技术，从而提供了一种异源蛋白质分泌产生的方法。培养这样的棒状杆菌型细菌来分泌产生异源蛋白质，该细菌具有基因构建体，该构建体包含：在该棒状杆菌型细菌中发挥功能的启动子序列；连接在该启动子序列下游的、在该棒状杆菌型细菌中发挥功能的、编码信号肽的核酸序列；和连接在该编码信号肽的核酸序列下游的、编码包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列与所述异源蛋白质所成的融合蛋白质的核酸序列。
【专利说明】蛋白质的分泌产生方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及异源蛋白质的分泌产生方法。
【背景技术】
[0002]作为利用微生物的异源蛋白质分泌产生，迄今为止已经有用芽孢杆菌属细菌(非专利文献I)、金属同化性酵母、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(非专利文献2)、曲霉属丝状真菌(非专利文献3和4)等分泌产生异源蛋白质的报道。
[0003]也已经有用棒状杆菌型细菌(coryneform bacteria)分泌产生异源蛋白质的尝试。关于用棒状杆菌型细菌分泌产生异源蛋白质，已经报道了谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)(下面也缩写为C.glutamicum)分泌核酸酶和脂肪酶(专利文献1，非专利文献5)，枯草杆菌蛋白酶等蛋白酶的分泌(非专利文献6)，利用棒状杆菌型细菌的细胞表层蛋白质PSl和PS2(也称CspB)的信号肽的蛋白质分泌(专利文献2)，利用PS2(CspB)的信号肽的纤连蛋白结合蛋白的分泌(非专利文献7)、使用PS2 (CspB)和SlpA (又称C spA)的信号肽的转谷氨酰胺酶原的分泌(专利文献3)，使用变异型分泌系统的蛋白质分泌(专利文献4)，利用突变株的转谷氨酰胺酶原的分泌(专利文献5)，使用Tat依赖性信号肽的蛋白质分泌(专利文献6)等等。
[0004]还已知在通过将异源蛋白质与信号肽连接来分泌产生异源蛋白质的方法中，在信号肽与异源蛋白质之间插入由来自芽孢杆菌属细菌细胞壁蛋白质的N端序列的一个或多个氨基酸残基组成的序列，由此分泌产生该异源蛋白质(专利文献7和8)。
[0005]CspB (PS2)是一种见于谷氨酸棒状杆菌的细胞表层蛋白质(非专利文献8)。棒杆菌属细菌中既有存在细胞表层蛋白质CspB的同源物的菌株，也有不存在此类同源物的菌株，而且关于28个谷氨酸棒状杆菌菌株已经报道了 CspB同源物的氨基酸序列(非专利文献9)。对来自这28个菌株的CspB同源物的N末端氨基酸序列进行比较发现，信号肽的30个氨基酸残基以及成熟蛋白质的N端3个氨基酸残基(Gln-Glu-Thr)是完全保守的(非专利文献9) ο
[0006]如前文所述，通过将异源蛋白质与CspB (PS2)的信号肽连接来分泌产生异源蛋白质的方法是已知的(例如专利文献2和3，非专利文献7)。此外，还有报道称，在一项通过将异源蛋白与CspB(PS2)的信号肽连接来分泌产生异源蛋白质的方法中，将谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的成熟CspB蛋白(SEQ ID NO:96)的N端1、14或38个氨基酸残基插入信号肽与异源蛋白(转谷氨酰胺酶原)之间，以通过分泌产生来产生该异源蛋白质，并且当插入38个氨基酸残基时，转谷氨酰胺酶原的分泌产生量得到增加(专利文献3)。然而，除了专利文献3中描述的发现之外，尚不知晓在通过连接异源蛋白质与信号肽来分泌产生异源蛋白质的方法中将包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列插入信号肽与异源蛋白质之间来表达该异源蛋白质。
[0007]已经有人报道，谷氨酸棒状杆菌的细胞表层蛋白CspB的成熟蛋白的N端氨基酸残基对于Edman降解是封闭的，因此有人提出该原本的N端氨基酸残基，即谷氨酰胺残基，被转化为焦谷氨酸残基(非专利文献8)。然而，尚不知晓通过将Gln-Glu-Thr的氨基酸序列插入信号肽与异源蛋白质之间而表达的异源蛋白质的N端谷氨酰胺残基被转化为焦谷氨
酸残基。
[0008]现有技术文献
[0009]专利文献
[0010]专利文献1:美国专利号4，965，197
[0011]专利文献2:日本专利申请特表平6-502548
[0012]专利文献3:日本特许4320769
[0013]专利文献4:日本专利申请特开平11-169182
[0014]专利文献5:日本特许4362651
[0015]专利文献6:日本特许4730302
[0016]专利文献7:日本专利申请特开平11-341991
[0017]专利文献8:日本专利申请特开2000-316579
[0018]非专利文献
[0019]非专利文献l:Microbiol.Rev.，57，109-137(1993)
[0020]非专利文献2:Biotechnol.，11, 905-910(1993)
[0021]非专利文献3:Biotechnol.，6，1419-1422(1988)
[0022]非专利文献4:Biotechnol.，9，976-981 (1991)
[0023]非专利文献5: J.Bacteriol.，174，1854-1861 (1992)
[0024]非专利文献6: Appl.Environ.Microbiol., 61, 1610-1613 (1995)
[0025]非专利文献7: Appl.Environ.Microbiol., 63, 4392-4400 (1997)
[0026]非专利文献8:Mol.Microbiol.,9,97-109(1993)
[0027]非专利文献9: J.Biotechnol., 112, 177-193 (2004)

【发明内容】

[0028]本发明要解决的问题
[0029]本发明的一个目的是开发改进棒状杆菌型细菌的异源蛋白质的分泌产生的新技术，从而提供一种利用棒状杆菌型细菌来分泌产生异源蛋白质的方法。
[0030]用于解决问题的手段
[0031]本发明的
【发明者】为了实现上述目的进行了多方研究。最后他们发现，在通过将异源蛋白质与信号肽连接来分泌产生异源蛋白质的方法中，通过将包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列插入信号肽与异源蛋白质之间，增加了异源蛋白质的分泌产生量，从而完成了本发明。
[0032]因此，本发明涉及下述。
[0033][I] 一种产生异源蛋白质的方法，包括:
[0034]培养具有用于分泌表达异源蛋白质的基因构建体的棒状杆菌型细菌；和
[0035]收集分泌产生的异源蛋白质，
[0036]其中所述基因构建体包含:在棒状杆菌型细菌中发挥功能的启动子序列，连接在所述启动子序列下游的、编码在棒状杆菌型细菌中发挥功能的信号肽的核酸序列，以及连接在所述编码信号肽的核酸序列下游的、编码包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列与所述异源蛋白质的融合蛋白质的核酸序列，
[0037]条件是所述包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列不是由SEQ ID NO:96的1_14位或1-38位的氨基酸残基组成的氨基酸序列。
[0038][2]如上所述的方法，其中所述包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列是选自下述氨基酸序列(A)-(H)的氨基酸序列:
[0039](A)Gln-Glu-Thr
[0040](B)Gln-Glu-Thr-Xaal(SEQ ID NO:102)
[0041](C)Gln-Glu-Thr-Xaal-Xaa2(SEQ ID NO:103)
[0042](D)Gln-Glu-Thr-Xaal-Xaa2-Xaa3(SEQ ID NO:104)
[0043](E)由Gln-Glu-Thr与成熟CspB的4_7位的氨基酸残基融合而构成的氨基酸序列，
[0044](F)由Gln-Glu-Thr与成熟CspB的4_8位的氨基酸残基融合而构成的氨基酸序列，
[0045](G)由Gln-Glu-Thr与成熟CspB的4_17位的氨基酸残基融合而构成的氨基酸序列，
[0046](H)由Gln-Glu-Thr与成熟CspB的4_50位的氨基酸残基融合而构成的氨基酸序列，
[0047]其中Xaal 是 Asn、Gly、Thr、Pro 或 Ala,Xaa2 是 Pro、Thr 或 Val,且 Xaa3 是 Thr 或Tyr0
[0048][3]如上所述的方法，其中所述包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列选自下组的氨基酸序列:Gln-Glu-Thr-Asn-Pro-Thr(SEQ ID NO:97), Gln-Glu-Thr-Gly-Thr-Tyr (SEQ IDNO:98), Gln-Glu-Thr-Thr-Val-Thr (SEQ ID NO:99), Gln-Glu-Thr-Pro-Val-Thr (SEQ IDNO: 100)、和 Gln-Glu-Thr-Ala-Val-Thr (SEQ ID NO: 101)。
[0049][4]如上所述的方法，其中所述基因构建体在所述编码包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列的核酸序列与所述编码异源蛋白质的核酸序列之间还包含编码用于酶消化的氨基酸序列的核酸序列。
[0050][5]如上所述的方法，其中所述用于酶消化的氨基酸序列是因子Xa蛋白酶的识别序列，或者ProTEV蛋白酶的识别序列。
[0051][6]如上所述的方法，其中蛋白酶的识别序列是SEQ ID NO: 105或106中所示的氨
基酸序列。
[0052][7]如上所述的方法，其中所述在棒状杆菌型细菌中发挥功能的信号肽是来源于棒状杆菌型细菌的CspB的信号肽。
[0053][8]如上所述的方法，其中所述CspB的信号肽具有SEQ ID N0:92中所示的氨基酸序列。
[0054][9]如上所述的方法，其中要培养的棒状杆菌型细菌是属于棒状杆菌属或短杆菌属的细菌。
[0055][10]如上所述的方法，其中要培养的棒状杆菌型细菌是谷氨酸棒状杆菌或Corynebacterium stationis。[0056]附图简要说明
[0057]图1是显示在谷氨酸棒状杆菌YDK010株中表达的、与谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的CspB的信号序列以及谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的成熟CspB的N端序列融合的胰岛素原的SDS-PAGE的结果的照片。
[0058]图2是显示在谷氨酸棒状杆菌YDK010株中表达的、与谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的CspB的信号序列、谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的成熟CspB的N端序列、以及蛋白酶识别序列融合的人生长激素(hGH)的SDS-PAGE结果的照片。
[0059]图3是显示在谷氨酸棒状杆菌YDK010株中表达的、与产氨棒状杆菌(C.ammoniagenes) (C.stationis) ATCC6872 的信号序列、谷氛酸棒状杆菌 ATCC13869 的成熟CspB的N端序列、以及蛋白酶识别序列融合的人生长激素(hGH)的SDS-PAGE结果的照片。
[0060]图4是显示在谷氨酸棒状杆菌ATCC13032或谷氨酸棒状杆菌ATCC6872中表达的、与谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的CspB的信号序列、谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的成熟CspB的N端序列、以及蛋白酶识别序列融合的人生长激素(hGH)的SDS-PAGE结果的照片。
[0061]图5是显示在谷氨酸棒状杆菌YDK010株中表达的、与谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的CspB的信号序列、 谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的成熟CspB的N端序列、以及蛋白酶识别序列融合的生理活性肽特立帕肽(Teriparatide)的SDS-PAGE结果的照片。
[0062]发明的实施方式
[0063]本发明提供一种产生异源蛋白质的方法，包括培养具有用于分泌产生异源蛋白质的基因构建体的棒状杆菌型细菌，和收集通过分泌产生而产生的所述异源蛋白质，其中所述基因构建体包含:在所述棒状杆菌型细菌中发挥功能的启动子序列；连接在该启动子下游的、编码在所述棒状杆菌型细菌中发挥功能的信号肽的核酸序列；以及连接在该编码信号肽的核酸序列下游的、编码包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列与所述异源蛋白质的融合蛋白的核酸序列(下文中又称“本发明的方法”或“本发明的产生异源蛋白质的方法”)。
[0064]用于本发明的方法的棒状杆菌型细菌具有所述用于分泌表达异源蛋白质的基因构建体，因此具有分泌产生该异源蛋白质的能力。
[0065]用于本发明的方法的棒状杆菌型细菌又称“本发明的细菌”或“本发明的棒状杆菌型细菌”。此外，本发明的细菌所携带的用于异源蛋白质分泌表达的基因构建体又称“用于本发明的基因构建体”。此外，包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列与异源蛋白质的融合蛋白又称“本发明的融合蛋白”。
[0066]在本发明中，蛋白质被“分泌”的表述意指蛋白质被转运到细菌细胞之外(胞外转运)。蛋白质被“分泌”的表述当然包括该蛋白质的所有分子最终以完全游离的形式存在于培养基中的情况，还包括该蛋白质的全部分子都存在于细胞表面层中的情况，以及该蛋白质一部分分子存在于培养基中、其余的分子存在于细胞表面层中的情况。
[0067]因此，在本发明中“分泌产生异源蛋白质的能力”是指在培养基中培养本发明的细菌时，该细菌将异源蛋白质分泌到培养基中或细胞表层，并将异源蛋白质积累到能够从培养基或细胞表层回收的程度的能力。积累量可为，例如，以培养基中积累的量计，优选10 μ g/L或更高,更优选lmg/L或更高,优选100mg/L或更高,更优选lg/L或更高。此外，例如，积累量以细胞表层中的积累量计可以是这样的量，如果收集细胞表层中的异源蛋白质并将其重悬于与培养基体积相同的液体中，异源蛋白质在该悬液中的浓度优选为IOyg/L或更高，更优选lmg/L或更高，特别优选100mg/L或更高。此外，在本发明中，术语被分泌产生的“蛋白质(蛋白)”是还包括称为肽或者多肽等实施方案的概念。
[0068]在本发明中，“异源蛋白质”指相对于表达或分泌该蛋白质的棒状杆菌型细菌而言是外来的(exogenous)的蛋白质。异源蛋白质可以是，例如，来源于微生物的蛋白质、来源于植物的蛋白质、来源于动物的蛋白质、来源于病毒的蛋白质、或甚至人工设计序列的蛋白质。异源蛋白质可以是单体蛋白质或多聚体蛋白质。多聚体蛋白质指可作为由两个或更多个亚单位组成的多聚体存在的蛋白质。在所述多聚体中，多个亚单位可以通过共价键如二硫键连接、通过非共价键例如氢键和疏水相互作用连接、或者通过共价键和非共价键的组合连接。所述多聚体优选包含一个或多个分子间二硫键。所述多聚体可以是由单一一种亚单位组成的同多聚体，或者可以是由两种或更多种亚单位组成的异多聚体。在多聚体蛋白为异多聚体的情况下，只要在选自构成该多聚体的亚单位中有至少一个亚单位是异源蛋白质即可。也就是说，可以是所有的亚单位都是异源的，或者只有一部分亚单位是异源的。虽然异源蛋白质可以是天然的分泌性蛋白质，或者也可以是天然中的非分泌性蛋白质，但优选其是天然的分泌性蛋白质。“异源蛋白质”的具体实例将会在下文中提及。
[0069]要生产的异源蛋白质可以由单一一种蛋白质组成，或者由两种或更多中蛋白质组成。此外，当异源蛋白质是异多聚体时，可以只生产其中一种亚单位，也可以产生两种或更多种亚单位。换言之，“异源蛋白质的分泌产生”包括组成目标异源蛋白质的所有亚单位的分泌产生，以及组成目标异源蛋白质的一部分亚单位的分泌产生。
[0070]在本发明中，棒状杆菌型细菌是需氧性革兰氏阳性杆菌(bacilli)，包括棒状杆菌属(Corynebacterium)细菌、短杆菌属(Brevibacterium)细菌、微杆菌属(Microbacterium)细菌等等。棒状杆菌型细菌包括先前被归类于短杆菌属(Brevibacterium)但目前被整合到棒状杆菌属的细菌(Int.J.Syst.Bacteriol., 41, 255(1991))使用棒状杆菌属细菌细菌的优势包括:与常规用于蛋白质分泌产生的真菌、酵母、芽孢杆菌属细菌等等相比，它们固有分泌的蛋白质的量极低，因此可以预期能够简化或省略对通过分泌产生的异源蛋白质的纯化过程；它们可以利用含有糖、氨、矿物盐等的简单培养基良好生长，因此从培养基成本、培养方法和培养生产率等方面考虑是非常优秀的。棒状杆菌型细菌的具体实例包括下列物种:
[0071]嗜乙酸乙酸棒状杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)
[0072]醋谷棒状杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)
[0073]解烧棒状杆菌(Corynebacteriumalkanolyticum)
[0074]颈棒状杆菌(CorynebacteriumcalIunae)
[0075]谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)
[0076]百合棒状杆菌(CorynebacteriumIilium)
[0077]栖糖蜜棒状杆菌(Corynebacteriummelassecola)
[0078]嗜热产氨棒状杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes (Corynebacteriumefficiens)
[0079]力士棒状杆菌(Corynebacteriumherculis)
[0080]叉分短杆菌(Brevibacterium divaricatum)[0081]黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)
[0082]Brevibacterium immariophilum
[0083]乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)(谷氨酸棒状杆菌)
[0084]玫瑰色短杆菌(Brevibacteriumroseum)
[0085]解糖短杆菌(BrevibacteriumsaccharoIyticum)
[0086]生硫短杆菌(Brevibacteriumthiogenitalis)
[0087]产氨棒状杆菌(Corynebacteriumammoniagenes) (Corynebacterium stationis)
[0088]白色短杆菌(Brevibacteriumalbum)
[0089]多角短杆菌(Brevibacteriumcerinum) [0090]嗜氨微杆菌(Microbacteriumammoniaphilum)
[0091]棒状杆菌型细菌的具体实例包括下列菌株:
[0092]嗜乙酰乙酸棒状杆菌ATCC13870
[0093]醋谷棒状杆菌ATCC15806
[0094]解烷棒状杆菌ATCC21511
[0095]颈棒状杆菌ATCC15991
[0096]谷氨酸棒状杆菌ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060, ATCC13869, FERM BP-734
[0097]百合棒状杆菌ATCC15990
[0098]栖糖蜜棒状杆菌ATCC17965
[0099]嗜热产氨棒状杆菌AJ12340(FERM BP-1539)
[0100]力士棒状杆菌ATCC13868
[0101]叉分短杆菌ATCC14020
[0102]黄色短杆菌ATCC13826, ATCC14067, AJ12418(FERM BP-2205)
[0103]Brevibacterium immariophilum ATCC14068
[0104]乳发酵短杆菌ATCC13869
[0105]玫瑰色短杆菌ATCC13825
[0106]解糖短杆菌ATCC14066
[0107]生硫短杆菌ATCC19240
[0108]产氨棒状杆菌(Corynebacteriumstationis) ATCC6871, ATCC6872
[0109]白色短杆菌ATCC15111
[0110]多角短杆菌ATCC15112
[0111]嗜氛微杆菌ATCC15354
[0112]这些菌株可获自，例如，美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection (地址:12301Parklawn Drive, Rockville, Maryland20852, P.0.Boxl549, Manassas, VA20108, United States of America)。具体地说，每个菌株都被给予登录号，可以利用这些登录号(参见http://www.atcc.0rg/)订购这些菌株。这些菌株的登录号列于美国典型培养物保藏中心的目录中。
[0113]尤其是，谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum) AJ12036株(FERM BP-734)，其原先是从野生型株谷氨酸棒状杆菌ATCC13869作为链霉素(Sm)抗性突变株分离的，被预测在负责蛋白质分泌的功能基因中具有突变，并且显示极高的异源蛋白质分泌产生能力，以最适条件下的积累量计与亲本株(野生株)相比约为2-3倍，因此它是优选的宿主细菌。AJ12036株最初于1984年3月26日作为国际保藏物保藏于日本通商产业省工业技术院微生物工业技术研究所(现为独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，Tsukuba Central6,1-1, Higashil-Chome, Tsukuba-shi, Ibarak1-ken, 305-8566，Japan),并给予保藏号 FERMBP-734ο
[0114]此外，可以使用诱变方法或基因重组方法从作为亲本株的如上所述的棒状杆菌型细菌选择增强了蛋白质分泌产生能力的菌株，并用作宿主。例如，用紫外线照射或化学诱变剂如N-甲基-N’ -亚硝基胍处理亲本株后，可以选择蛋白质分泌产生能力得到了增强的菌株。
[0115]此外，如果使用通过修饰上述菌株使其不产生细胞表层蛋白质而得到的菌株作为宿主，分泌到培养基中或细胞表层上的异源蛋白质的纯化会变得容易，因此它是特别优选的。这样的修饰可以这样实施:通过诱变或基因重组向染色体上的细胞表层蛋白质的编码区域或其表达调控区域导入突变。经过修饰而不产生细胞表层蛋白的棒状杆菌型细菌的例子包括谷氨酸棒状杆菌YDKOlO株(W02004/029254)，它是谷氨酸棒状杆菌AJ12036株(FERMBP-734)的细胞表层蛋白PS2缺陷的菌株。
[0116]即，本发明的细菌可以是其细胞表层蛋白质活性降低了的细菌。所述细胞表层蛋白质是构成细菌或古细菌的细胞表层(S层)的蛋白质。棒状杆菌型细菌的细胞表层蛋白质的例子包括谷氨酸棒状杆菌的PSl和PS2 (又称CspB)，以及C.stationis的SlpA (又称CspA)。在这些之 中，降低PS2蛋白的活性是优选的。谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的cspB基因的核苷酸序列以及该基因编码的PS2蛋白的氨基酸序列分别示于SEQ ID N0:94和95。其他谷氨酸棒状杆菌菌株中cspB基因的同源物的例子将在下文提到。
[0117]由于编码细胞表层蛋白质的基因的核苷酸序列可能随棒状杆菌型细菌所属的种或株而不同，编码细胞表层蛋白的基因可以是前述的核苷酸序列的变异体，只要该基因编码维持原始功能的蛋白质。表述“维持原始功能”可以意指蛋白质具有当该蛋白质在棒状杆菌型细菌中的活性被降低时，异源蛋白质的分泌产生相比于非修饰株所见的量增加的性质。此外，表述“维持原始功能”还可以意指，在CspB的情况下，例如，异源蛋白质的分泌产生量的增加可以通过如后文所述的本发明的插入序列来实现。后述的涉及CspB变异体及其编码基因的描述也可以适用于其他细胞表层蛋白质及其编码基因。
[0118]“当该蛋白质棒状杆菌型细菌中的活性被降低时，异源蛋白质的分泌产生相比于非修饰株中所见的量增加的性质”是指这样的性质:在棒状杆菌型细菌中活性被降低时，赋予该棒状杆菌型细菌相比于非修饰菌株(例如野生株或亲本株)中所见的量分泌产生更多量的异源蛋白质的能力。对于表述“相比于非修饰菌株中所见的量分泌产生更多量的异源蛋白质”，只要异源蛋白质的分泌产生量相比于非修饰株增加就没有特别限制，可以表示，例如，以培养基中和/或细胞表层中的积累量计，异源蛋白质的分泌产生量相比于非修饰株增加优选10%以上，更优选20%以上，特别优选30%以上，更优选100%以上。此外，表述“相比于非修饰菌株分泌产生更多量的异源蛋白质”还可以指:将未经浓缩的非修饰株的培养上清液进行SDS-PAGE并用CBB染色后不能检出异源蛋白质，而将未经浓缩的修饰株的培养上清液进行SDS-PAGE并用CBB染色后能检出异源蛋白质。
[0119]某种蛋白质是否具有当其在棒状杆菌型细菌中的活性降低时异源蛋白质的分泌产生量相比于非修饰株中所见的量增加的性质可以这样来确认:从属于棒状杆菌型细菌的菌株通过修饰使得该蛋白质的活性降低而制备菌株，对将该修饰菌株在培养基中培养时观察到的异源蛋白质的分泌产生量进行定量，并将该确定的量与修饰之前的该菌株(未修饰株)在该培养基中培养时观察到的异源蛋白质的分泌产生量进行比较。
[0120]在本发明中，表述“细胞表层蛋白的活性降低”包括棒状杆菌型细菌已经过修饰从而降低了细胞表层蛋白质的活性的情况，以及棒状杆菌型细菌中细胞表层蛋白质的活性已经固有地降低的情况。“棒状杆菌型细菌中细胞表层蛋白质的活性已经固有地降低的情况”包括了棒状杆菌型细菌固有地缺乏细胞表层蛋白质的情况。即，已降低了细胞表层蛋白质的活性的棒状杆菌型细菌包括固有地缺乏细胞表层蛋白质的棒状杆菌型细菌。“固有地缺乏细胞表层蛋白质的棒状杆菌型细菌”的例子包括棒状杆菌型细菌固有地缺乏编码细胞表层蛋白质的基因的情况。表述“棒状杆菌型细菌固有地缺乏细胞表层蛋白质”可意指棒状杆菌型细菌固有地缺乏选自该棒状杆菌型细菌所属物种的其他菌株中出现的一种或多种细胞表层蛋白质。例如，“谷氨酸棒状杆菌固有地缺乏细胞表层蛋白质”可以表示谷氨酸棒状杆菌菌株固有地缺乏选自在其他谷氨酸棒状杆菌菌株中出现的细胞表层蛋白质的一种或多种蛋白质，例如，缺乏PSl和/或PS2 (CspB)。固有地缺乏细胞表层蛋白质的棒状杆菌型细菌的实例包括谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，其固有地缺乏cspB基因。
[0121]以下，说明用于降低蛋白质活性的手段。
[0122]表述“蛋白质的活性降低”表示目标蛋白质的活性相比于非修饰菌株，例如野生型菌株和亲本菌株有所减少，包括活性完全消失的情况。具体地，“蛋白质的活性降低”意指与非修饰菌株相比每个细胞的该蛋白质的分子数降低，和/或该蛋白质的每个分子的功能降低。即，与表述“蛋白质的活性降低”相关的术语“活性”可以表示编码该蛋白质的基因的转录量(mRNA的量)或该蛋白质的量，以及该蛋白质的催化活性。此外“每个细胞的蛋白质分子数降低”的情况包括该蛋白质完全不存在的情况。此外，“蛋白质的每个分子的功能降低”的情况包括该蛋白质的每个分子的功能完全消失的情况。
[0123]为了降低蛋白质的活性的修饰可以通过例如降低编码该蛋白质的基因的表达来实现。“降低基因表达”又称“弱化基因表达”。降低基因表达可以通过，例如，降低转录效率、降低翻译效率、或它们的组合来诱导。降低基因的表达可以通过修饰基因的表达调控序列，诸如启动子和Shine-Dalgarno(SD)序列来实现。当修饰表达调控序列时，优选修饰表达调控序列的一个核苷酸或更多，更优选两个核苷酸或更多，尤其优选3个核苷酸或更多。此外，可以缺失表达调控序列的一部分或全部。基因表达的降低可以通过例如对负责表达调控的因子进行操控来实现。负责表达调控的因子的例子包括负责转录或翻译调控的低分子(诱导剂、抑制剂，等等)，负责转录或翻译调控的蛋白质(转录因子等等)，负责转录或翻译调控的核酸(siRNA等)，诸如此类。
[0124]为了降低蛋白质活性的修饰可以通过，例如，破坏编码该蛋白的基因来实现。破坏基因可通过，例如，将染色体上该基因的编码区的一部分或全部缺失来实现。此外，可以缺失染色体上的整个基因，包括基因的上游和下游序列在内。作为缺失对象的区域可为任何区域，诸如N末端区域，内部区域，或C末端区域，只要能实现蛋白质活性的降低。一般而言缺失的区域越长能够越切实地使基因失活。此外，优选作为缺失对象的区域的上游和下游序列的阅读框不同。[0125]基因的破坏还可以通过，例如，向染色体上的基因的编码区中导入取代氨基酸的突变(错义突变)、终止密码子(无义突变)、添加或缺失一个或多个核苷酸的移框突变，等等(Journal of Biological Chemistry, 272:8611-8617 (1997) ；Proceedings of theNational Academy of Sciences,USA, 955511-5515(1998) ；Journal of Biological Chemistry, 26116, 20833-20839(1991))。
[0126]基因的破坏还可以通过，例如，向染色体上的基因的编码区域中插入其他序列来实现。插入的位点可以是基因的任何区域，且插入的区域越长通常可以越切实地使基因失活。优选插入位点的上游和下游序列的阅读框不同。所述其他序列没有特别限定，只要是选择可降低或消除被编码蛋白的活性的序列即可，实例包括，例如，标志物基因例如抗生素抗性基因、对异源蛋白质的生产有用的基因，等等。
[0127]对染色体上的基因进行如上所述的修饰可以通过例如这样来实现:制备缺陷型基因，其中缺失该基因的部分序列，使得其不能表达正常发挥功能的蛋白质，并用含有该缺陷型基因的重组DNA转化细菌，导致该缺陷型基因与染色体上的基因之间发生同源重组，从而用缺陷型基因替代染色体上的基因。在此情况下，如果在重组DNA中包含根据宿主的特性(如营养缺陷型等)选择的标志物基因，则操作变得容易。由缺陷型基因编码的蛋白质即使产生，也具有不同于野生型蛋白质的构象，因此其功能降低或消除。此类基于利用同源重组的基因取代的基因破坏是确立的方法，有所谓“Red驱动的整合”(Datsenko，K.A, and Wanner, B.L.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 97:6640-6645 (2000))、使用线性 DNA 的方法，例如利用Red驱动整合与λ噬菌体来源的切出系统的方法(Cho，E.H.，Gumport, R.1., Gardner, J.F., J.Bacteriol.，184:5200-5203 (2002))，使用含温度敏感型复制起点的质粒的方法，使用能够接合转移的质粒的方法，使用不具有在宿主中有功能的复制起点的自杀载体的方法(美国专利号6，303，383，日本专利申请特开平05-007491)，等等。
[0128]为了降低蛋白质活性的修饰也可以通过例如诱变处理来实现。诱变处理的例子包括常规诱变处理例如X射线辐照或紫外线照射，以及诱变剂处理例如N-甲基-N’ -硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、甲磺酸乙酯(EMS)、和甲磺酸甲酯(MMS)处理。
[0129]目标蛋白质的活性的降低可以通过测量该蛋白质的活性来确认。具体地，该蛋白质的活性减少到例如非修饰株中所见的活性的例如50%或更低，优选20%或更低，更优选10%或更低,更优选5%或更低,或特别优选0%。
[0130]目标基因的表达的降低可以通过确认基因转录量的降低或从该基因表达的目标蛋白量的降低来确认。
[0131]目标基因的转录量的降低可以通过将从该基因转录的mRNA量与非修饰株中所见的量比较来加以确认。用于测量mRNA的量的方法的实例包括Northern杂交、RT-PCR、等等(Molecular Cloning, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor (USA) ,2001)。mRNA的量优选减少到，例如，非修饰株中所见的量的50%或更低，20%或更低，10%或更低，5%或更低，或0%。
[0132]目标蛋白的量的减少可以使用抗体通过Western印迹(Molecular Cloning, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA) 2001)来确认。蛋白质的量优选减少至，例如，非修饰株中所见的量的50%以下、20%以下、10%以下、5%以下、或0%。
[0133]取决于破坏所用的手段，靶基因的破坏可以通过测定该基因的部分或全部的核苷酸序列、限制酶图谱、或基因全长等来确认。
[0134]具有分泌产生异源蛋白质能力的棒状杆菌型细菌可以通过向如上所述的棒状杆菌型细菌中导入本发明使用的基因构建体，使该细菌携带该构建体而获得。
[0135]已知分泌性蛋白质一般被翻译为前蛋白质(又称前肽)或者前原蛋白质(又称前原肽)，然后通过加工变为成熟蛋白质。具体地，分泌性蛋白质一般被翻译为前蛋白质或前原蛋白质，然后作为前体部分(pre-moiety)的信号肽被蛋白酶(一般称为信号肽酶)所切断，从而将该分泌性蛋白质转化为成熟蛋白质或原蛋白质(proprotein)。对于原蛋白质,其原部分被蛋白酶进一步切断，从而使原蛋白质变为成熟蛋白质。因此，在本发明的方法中，利用信号肽进行异源蛋白质的分泌产生。在本发明中，可以将分泌性蛋白质的前蛋白质和原蛋白质统称为“分泌性蛋白质前体”。在本发明中，“信号肽”(又称“信号序列”)是指存在于分泌性蛋白质前体的N末端、而通常不存在于天然成熟蛋白质中的氨基酸序列。
[0136]用于本发明的基因构建体包含:在棒状杆菌型细菌中发挥功能的启动子序列，连接在该启动子序列下游的、编码在棒状杆菌型细菌中发挥功能的信号肽的核酸序列，以及连接在该编码信号肽的核酸序列下游的、编码包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列与异源蛋白质所成的融合蛋白的核酸序列。所述编码信号肽的核酸序列可以连接在所述启动子序列的下游，使得信号肽在该启动子的控制下表达。所述编码融合蛋白的核酸序列可以连接在所述编码信号肽的核酸序列下游，使得所述融合蛋白作为进一步与所述信号肽融合的融合蛋白表达。用于本发明的基因构建体还可以包含对于在棒状杆菌型细菌中表达异源蛋白质有效的调控序列(操纵基因、终止子，等等)，位于其可发挥作用的合适位置。 [0137]本发明中使用的启动子没有特殊限定，只要是选用在棒状杆菌型细菌中发挥功能的启动子即可，且其可以是来源于棒状杆菌型细菌的启动子，或者是异源启动子。“在棒状杆菌型细菌中发挥功能的启动子”是指在棒状杆菌型细菌中具有启动子活性的启动子。异源启动子的具体实例包括，例如，源自大肠杆菌的启动子，例如tac启动子、Iac启动子、trp启动子和araBAD启动子。在这些之中，优选强启动子诸如tac启动子,也优选诱导型启动子诸如araBAD启动子。
[0138]源自棒状杆菌型细菌的启动子的例子包括，例如，细胞表层蛋白质PS1、PS2(又称CspB)、以及SlpA(又称CspA)的基因的启动子，以及各种氨基酸生物合成系统基因的启动子。各种氨基酸生物合成系统基因的启动子的具体实例包括，例如，下列基因的启动子:谷氨酸生物合成系统的谷氨酸脱氢酶基因，谷氨酰胺生物合成系统的谷氨酰胺合酶基因、赖氨酸生物合成系统的天冬氨酸激酶基因、苏氨酸生物合成系统的高丝氨酸脱氢酶基因、异亮氨酸和缬氨酸生物合成系统的乙酰羟酸合成酶基因、亮氨酸生物合成系统的2-异丙基苹果酸合成酶基因、脯氨酸和精氨酸生物合成系统的谷氨酸激酶基因、组氨酸生物合成系统的磷酸核糖基-ATP焦磷酸化酶基因、以及芳香族氨基酸生物合成系统例如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的生物合成系统的脱氧阿拉伯糖庚酮酸磷酸(DAHP)合成酶基因，核酸生物合成系统如肌苷酸和鸟苷酸生物合成系统的磷酸核糖基焦磷酸(PRPP)氨基转移酶基因、以及鸟苷酸合成酶基因。
[0139]作为启动子，可以利用各种报道基因获得现有启动子的高活性型并加以使用。例如，可以通过使启动子区域中的-35和-10区更接近共有序列，可以提高启动子的活性(国际专利申请公布W000/18935)。用于评价启动子的强度的方法以及强启动子在Goldstein 等人的论文(Prokaryotic promoters in biotechnology, Biotechnol.Annu.Rev.，I, 105-128(1995))等中有记载。此外，已知核糖体结合位点(RBS)与起始密码子之间的间隔区域中、尤其是起始密码子直接上游的序列(5，-UTR)中几个核苷酸的取代、插入或缺失会显著影响mRNA的稳定性和翻译效率，也可以修饰这些序列。
[0140]本发明使用的信号肽没有特别限制，只要选用在棒状杆菌型细菌中发挥功能的信号肽即可，其可以是源自棒状杆菌型细菌的信号肽，或者其可以是异源信号肽。“在棒状杆菌型细菌中发挥功能的信号肽”是指这样的肽，当它与目标蛋白质的N末端连接时，容许棒状杆菌型细菌分泌该蛋白质。信号肽优选是作为宿主的棒状杆菌型细菌的分泌性蛋白质的信号肽，更优选是棒状杆菌型细菌的细胞表层蛋白质的信号肽。棒状杆菌型细菌的细胞表层蛋白质的例子包括来源于谷氨酸棒状杆菌的PSl和PS2 (CspB)(日本专利申请特表平6-502548)和来源于产氨棒状杆菌(C.stationis)的SlpA(CspA)(日本专利申请特开平10-108675)。PSl的信号肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 91 ；PS2 (CspB)的信号肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO:92 ；SlpA(CspA)的信号肽的氨基酸序列示于SEQ ID N0:93。此外，美国专利号4，965，197记载了由来源于棒状杆菌型细菌的DNA酶的信号肽，这样的信号肽也可以用于本发明。虽然信号肽具有跨越生物物种的一定的共同序列特征，但是在某种生物物种中表现分泌功能的信号肽并不一定在另一种生物物种中表现分泌功能。因此，当使用异源信号肽时，可以合适地选择在棒状杆菌型细菌中发挥功能的信号肽。某种信号肽是否在棒状杆菌型细菌中发挥功能可以通过，例如，将目标蛋白质表达为与该信号肽的融合蛋白，再确定该蛋白是否分泌来加以确认。
[0141]当翻译产物被分泌到细胞外时，信号序列通常被信号肽酶切断。作为编码信号肽的基因，虽然直接使用天然形态的基因，但可以根据要使用的宿主的密码子频度对其进行修饰以使其具有最优的密码子。
[0142]在本发明使用的基因构建体中，在编码信号肽的核酸序列与编码异源蛋白质的核酸序列之间插入编码包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列的核酸序列。在本发明中，包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列又称“本发明使用的插入序列”。
[0143]本发明使用的插入序列没有特别限制，只要其包含Gln-Glu-Thr即可。此外，然后本发明使用的插入序列中的Gln-Glu-Thr的位置没有特别限制，优选插入序列的N端第I至第3个氨基酸是Gln-Glu-Thr。即，优选的是，在表达出的异源蛋白质中，Gln-Glu-Thr在信号肽的紧邻下游存在。
[0144]本发明使用的插入序列优选为由棒状杆菌型细菌的细胞表层蛋白质CspB的成熟蛋白质(下文也称“成熟CspB”或“CspB成熟蛋白质”)的自N端起的3个或更多个氨基酸残基组成的序列。“自N端起的3个或更多个氨基酸残基”指从N端第I位的氨基酸残基到第3位及更远位置的氨基酸残基的氨基酸序列。
[0145]CspB的具体实例包括，例如，谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的CspB。CspB与PS2同义。谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的cspB基因的核苷酸序列示于SEQ ID N0:94，而CspB蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID N0:95o在SEQ ID N0:95所示的氨基酸序列中，位置1_30的氨基酸残基对应于信号肽，而位置31-469的氨基酸残基对应于CspB成熟蛋白质。谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的CspB成熟蛋白质的氨基酸序列，除了作为信号肽部分的30个氨基酸残基之外，示于SEQ ID N0:96。CspB成熟蛋白质的N端是指CspB成熟蛋白质上除C端侧的29个氨基酸残基的疏水区之外的其余部分。在棒状杆菌型细菌ATCC13869的成熟CspB中,N端1-3位的氨基酸残基对应于Gln-Glu-Thr。在本发明中,可以使用在cspB基因的核苷酸序列的如下所述的部分:该部分编码成熟CspB的氨基酸序列中包含于本发明插入序列中的部分。
[0146]由于cspB基因的核苷酸序列可根据棒状杆菌型细菌所属的物种或菌株而不同，本发明中使用的cspB基因可以是前述的核苷酸序列的变异体，只要用本发明的插入序列能增加异源蛋白质的分泌产生量。cspB基因的变异体包括该基因的同源物。cspB基因的同源物可以通过使用，例如，前述的谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的cspB基因(SEQ ID NO: 94)作为查询序列进行BLAST检索或FASTA检索从公共数据库容易地获得，还可以利用棒状杆菌型细菌的染色体作为模板、以及基于已知的基因序列(例如如上所述的那些)的寡核苷酸作为引物，通过PCR来获得。
[0147]例如，已经报道了 28种谷氨酸棒状杆菌菌株的CspB同源物的氨基酸序列(J.Biotechnol., 112, 177-193 (2004))。与来源于这28种菌株的CspB同源物的N端氨基酸序列相t匕，可见成熟蛋白质的信号序列30个氨基酸残基和N端3个氨基酸残基(Gln-Glu-Thr)是完全保守的。此外，通过对CspB同源物的成熟蛋白质的N端到6个氨基酸为止进行比较，这些氨基酸序列分为5个模式，即=Gln-Glu-Thr-Asn-Pro-Thr (以下亦表示为QETNPT (SEQ IDNO:97)), Gln-Glu-Thr-Gly-Thr-Tyr (以下亦表示为 QETGTY (SEQ ID NO:98)), Gln-Glu-Thr-Thr-Val-ThH 以下亦表示为 QETTVT (SEQ ID NO:99) )，Gln-Glu-Thr-Pro-Val-Thr (以下亦表示为 QETPVT (SEQ ID NO: 100))，和Gln-Glu-Thr-Ala-Val-Thr (以下亦表示为 QETAVT (SEQID NO: 101))。这28个谷氨酸棒状杆菌菌株和cspB基因同源物在NCBI数据库中的GenBank登录号例示如下(GenBank登录号示于括号内)。
[0148]谷氨酸棒状杆菌ATCC13058 (AY524990)
[0149]谷氨酸棒状杆菌ATCC13744(AY524991)
[0150]谷氨酸棒状杆菌ATCC13745 (AY524992)
[0151 ]谷氨酸棒状杆菌 ATCC14017 (AY524993)
[0152]谷氨酸棒状杆菌ATCC14020 (AY525009)
[0153]谷氨酸棒状杆菌ATCC14067 (AY524994)
[0154]谷氨酸棒状杆菌ATCC14068 (AY525010)
[0155]谷氨酸棒状杆菌ATCC14747 (AY525011)
[0156]谷氨酸棒状杆菌ATCC14751 (AY524995)
[0157]谷氨酸棒状杆菌ATCC14752 (AY524996)
[0158]谷氨酸棒状杆菌ATCC14915 (AY524997)
[0159]谷氨酸棒状杆菌ATCC15243 (AY524998)
[0160]谷氨酸棒状杆菌ATCC15354 (AY524999)
[0161 ]谷氨酸棒状杆菌 ATCC17965 (AY525000)
[0162]谷氨酸棒状杆菌ATCCl7966 (AY525001)
[0163]谷氨酸棒状杆菌ATCC19223 (AY525002)
[0164]谷氨酸棒状杆菌ATCC19240 (AY525012)
[0165]谷氨酸棒状杆菌ATCC21341 (AY525003)[0166]谷氨酸棒状杆菌ATCC21645 (AY525004)
[0167]谷氨酸棒状杆菌ATCC31808 (AY525013)
[0168]谷氨酸棒状杆菌ATCC31830 (AY525007)
[0169]谷氨酸棒状杆菌ATCC31832 (AY525008)
[0170]谷氨酸棒状杆菌LP-6 (AY525014)
[0171]谷氨酸棒状杆菌DSM20137(AY525015)
[0172]谷氨酸棒状杆菌DSM20598 (AY525016)
[0173]谷氨酸棒状杆菌DSIM63O7 (AY525017)
[0174]谷氨酸棒状杆菌22220 (AY525005)
[0175]谷氨酸棒状杆菌22243 (AY525006)
[0176]cspB基因可以是编码具有在上述的氨基酸序列中的一个或几个位置上取代、缺失、插入或添加了一个或几个氨基酸而得到的氨基酸序列的蛋白质的基因，只要通过本发明的插入序列异源蛋 白质的分泌产生量能够增加即可。虽然“一个或几个”的数目可根据蛋白质的三维结构或氨基酸残基的类型而不同，具体而言，其优选为1-20个，优选1-10个，更优选1-5个。
[0177]上述的一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加是维持蛋白质的正常功能的保守突变。保守突变的典型实例是保守取代。保守取代是这样的突变，其中，如果取代位点是芳香族氨基酸，则取代发生在Phe、Trp和Tyr之间；如果是疏水氨基酸，则发生在Leu、Ile和Val之间；如果其是极性氨基酸，则发生在Gln和Asn之间；如果其是碱性氨基酸，则发生在Lys、Arg和His之间；如果其是酸性氨基酸，则发生在Asp和Glu之间；如果其是具有羟基的氨基酸，则发生在Ser和Thr之间。被视为保守取代的取代实例包括，具体而言，以 Ser 或 Thr 取代 Ala ；以 Gin、His,或 Lys 取代 Arg ；以 Glu、Gin、Lys> His,或 Asp 取代 Asn ；以 Asn、Glu,或 Gln 取代 Asp ；以 Ser 或 Ala 取代 Cys ；以 Asn、Glu、Lys> His、Asp,或 Arg 取代 Gln ；以 Gly、Asn、Gin、Lys,或 Asp 取代 Glu ；以 Pro 取代 Gly ；以 Asn、Lys>Gln> Arg,或 Tyr 取代 His ;以 Leu、Met、Val,或 Phe 取代 lie ;以 lie、Met、Val,或 Phe 取代 Leu ；以 Asn、Glu、Gin、His,或 Arg 取代 Lys ；以 lie、Leu、Val,或 Phe 取代 Met ；以 Trp>Tyr> Met、He,或 Leu 取代 Phe ；以 Thr 或 Ala 取代 Ser ；以 Ser 或 Ala 取代 Thr ；以 Phe 或Tyr取代Trp ;以His、Phe,或Trp取代Tyr ;和以Met、lie,或Leu取代Val。此外，如上所述的此类氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加、倒位等等包括由于个体差异或基因来源的细菌的物种差异而天然发生的突变(突变异体或变异体)。
[0178]此外，具有上述的保守突变的基因可以是编码与总编码氨基酸序列显示80%以上，优选90 %以上，更优选95 %以上，还更优选97 %以上，特别优选99 %以上的同源性的蛋白质的基因，只要通过本发明的插入序列能够增加异源蛋白质的分泌产生量。此外，在本说明书中，“同源性”可以意指“同一性”。
[0179]此外，cspB基因可以是能够与这样的探针在严格条件下杂交的DNA，只要通过本发明的插入序列能够增加异源蛋白质的分泌产生量:所述探针能够从已知的基因序列，例如与前述的核苷酸序列的一部分或者全部互补的序列制备。术语“严格条件”是指这样的条件，在该条件下形成所谓的特异性杂交体，而不形成非特异性杂交体。严格条件的实例包括这样的条件，在该条件下高度同源的DNA，例如不少于80%同源，优选不少于90%同源，更优选不少于95%同源，还更优选不少于97%同源，特别优选不少于99%的DNA同源彼此杂交，而同源性低于上述的DNA彼此不杂交；或者指在与典型的Southern杂交的洗漆条件(即 Ix SSC、0.1% SDS、60°C，优选 0.1x SSC、0.1 % SDS、60°C，更优选 0.1x SSC、0.1%SDS、68°C )相当的盐浓度或温度下，洗涤I次，优选2-3次。
[0180]用于上述杂交的探针可以是与如上所述的基因互补的序列的一部分。这样的探针可以使用基于已知的基因序列制备的寡核苷酸作为探针、含有所述核苷酸序列的DNA片段作为模板，通过PCR来制备。例如，当使用长度大约300bp的DNA片段作为探针时，杂交的洗涤条件可为，例如，50°C，2xSSC和0.1% SDS。
[0181 ] 此外，虽然可以直接使用天然存在的cspB基因，但也可以使用任意密码子被替换为等效密码子的cspB基因。例如，可以使用根据要使用的宿主中的密码子频度进行了修饰，从而具有最优密码子的cspB基因。
[0182]上文关于基因和蛋白质的变异体的描述也可以在适当变化后适用于任意蛋白质，例如细胞表层蛋白质和本发明中作为分泌 产生的对象的异源蛋白质，以及它们的编码基因。
[0183]术语“通过本发明的插入序列异源蛋白质的分泌产生量能够增加”可以表示，但不特别限于(只要与没有插入序列相比异源蛋白质的分泌产生量增加即可)，例如，异源蛋白质的分泌产生量以培养基中和/或细胞表层中的积累量计比非修饰菌株中所见的量高优选10%以上，更优选20%以上，尤其优选30%以上，进一步更优选100%以上，或甚至100%以上、300%以上、500%以上、或1000%以上。此外，表述“通过本发明的插入序列异源蛋白质的分泌产生量能够增加”还可以表示，当将导入了不含本发明的插入序列的异源蛋白质表达基因构建体的菌株的非浓缩培养上清液施加到SDS-PAGE并用CBB染色时无法检测到异源蛋白质，而当将导入了具有本发明的插入序列的异源蛋白质表达基因构建体的菌株的非浓缩培养上清液施加到SDS-PAGE并用CBB染色时能够检测到异源蛋白质。在本发明中，通过本发明的插入序列是否能增加异源蛋白质的分泌产生量可以这样确认:将具有本发明的插入序列的异源蛋白质表达基因构建体导入属于棒状杆菌型细菌的菌株，对将该导入了基因构建体的菌株在培养基中培养时观察到的异源蛋白质的分泌产生量进行定量，并将该测定的量与将该导入了不含本发明的插入序列的异源蛋白质基因构建体的菌株在培养基中培养时观察到的异源蛋白质的分泌产生量进行比较。
[0184]在本发明中，“成熟CspB的X位的氨基酸残基”表示对应于SEQ ID NO:96中的位置X的氨基酸残基。氨基酸序列中的“X位”表示从氨基酸序列的N端起的第X个位置，且位于N端的氨基酸残基是I位的氨基酸残基。即，上面所说的氨基酸残基的位置表示相对位置，且位置可能由于氨基酸残基的缺失、插入、添加等等而移动。例如“成熟CspB的50位的氨基酸残基”表示对应于SEQ ID NO: 96的50位的氨基酸残基，而当50位的N端一侧缺失了一个氨基酸残基时，则从N端起的第49个氨基酸残基是“成熟CspB的50位的氨基酸残基”。此外，当50位的N端一侧插入了一个氨基酸残基时，则从N端起的第51个氨基酸残基是“成熟CspB的50位的氨基酸残基”。即，例如，“由Gln-Glu-Thr与成熟CspB的4_50位的氨基酸残基融合而构成的氨基酸序列”表示由Gln-Glu-Thr与对应于SEQ ID N0:96的4-50位的氨基酸残基融合而构成的氨基酸序列。
[0185]本发明使用的插入序列优选是从成熟CspB的I位的氨基酸残基起、到3-50位的任意氨基酸残基止的氨基酸序列。本发明使用的插入序列更优选是从成熟CspB的I位的氨基酸残基起、到3-8、17和50位中的任意氨基酸残基止的氨基酸序列。本发明使用的插入序列特别优选是从成熟CspB的I位的氨基酸残基起、到4、6、17和50位中的任意氨基酸残基止的氨基酸序列。
[0186]本发明使用的插入序列的长度优选为3-50个氨基酸残基，更优选3-8、17或50个氨基酸残基，特别优选4、6、17或50个氨基酸残基。
[0187]当本发明使用的插入序列的N端起第I至第3个氨基酸残基是Gln-Glu-Thr时，本发明使用的插入序列长度为4、5或6个氨基酸残基，本发明使用的插入序列的N端起第4个氨基酸残基优选为Asn, Gly, Thr, Pro或Ala,第5个氨基酸残基优选为Pro, Thr或Val,而第6个氨基酸残基优选为Thr或Tyr。当本发明使用的插入序列中Gln-Glu-Thr的N端一侧存在一个或多个氨基酸残基时，上面所说的第4个氨基酸残基应当为与Gln-Glu-Thr的氨基酸残基Thr相邻的氨基酸残基，上述的第5和第6个氨基酸残基也类似地定义。
[0188]本发明使用的插入序列优选是选自下列氨基酸序列(A)至(H)的氨基酸序列:
[0189](A) Gln-Glu-Thr
[0190](B)Gln-Glu-Thr-Xaal(SEQ ID NO:102)
[0191](C)Gln-Glu-Thr-Xaal-Xaa2(SEQ ID NO:103)
[0192](D)Gln-Glu-Thr-Xaal-Xaa2-Xaa3(SEQ ID NO:104)
[0193](E)由Gln-Glu-Thr 与成熟CspB的4-7位的氨基酸残基融合而构成的氨基酸序列，
[0194](F)由Gln-Glu-Thr与成熟CspB的4-8位的氨基酸残基融合而构成的氨基酸序列，
[0195](G)由Gln-Glu-Thr与成熟CspB的4_17位的氨基酸残基融合而构成的氨基酸序列，
[0196](H)由Gln-Glu-Thr与成熟CspB的4_50位的氨基酸序列融合而构成的氨基酸序列。
[0197]在氨基酸序列(A)- (H)中，Xaal 为 Asn, Gly, Thr, Pro 或 Ala ；Xaa2 为 Pro, Thr 或Val ;而Xaa3为Thr或Tyr。对于氨基酸序列(A)-(H), "Gln-Glu-Thr与成熟CspB的4-X位的氨基酸残基融合〃表示成熟CspB的N端的4-X位的氨基酸残基融合于Gln-Glu-Thr的Thr。成熟CspB的N端的第一至第三个氨基酸残基通常是Gln-Glu-Thr,在此情况下，〃由Gln-Glu-Thr与成熟CspB的4-X位的氨基酸残基融合而构成的氨基酸序列〃与由成熟CspB的1-X位氨基酸残基构成的氨基酸序列同义。
[0198]此外，具体而言，本发明使用的插入序列优选是选自下组的氨基酸序列:Gln-Glu-Thr-Asn-Pro-Thr(SEQ ID NO:97), Gln-Glu-Thr-Gly-Thr-Tyr(SEQ ID NO:98), Gln-Glu-Thr-Thr-Val-Thr(SEQ ID NO:99), Gln-Glu-Thr-Pro-Val-Thr(SEQ ID NO:100)，和Gln-Glu-Thr-Ala-Val-Thr(SEQ ID NO:101)。
[0199]如上所述，作为依照本发明的方法分泌产生的对象的异源蛋白质包括，但不限于全部范围的蛋白质，例如来源于微生物、植物、动物和病毒的蛋白质，以及人工设计氨基酸序列的蛋白质。
[0200]要依照本发明的方法分泌产生的异源蛋白质的例子包括，例如，生理学活性蛋白质、受体蛋白质、要作为疫苗使用的抗原性蛋白质、以及酶。酶的例子包括，例如，转谷氨酰胺酶、蛋白酶、内肽酶、外肽酶、氨肽酶、羧肽酶、胶原酶、壳多糖酶，等等。
[0201]生理学活性蛋白质的例子包括，例如，生长因子、激素、细胞因子和抗体相关分子。
[0202]生长因子的具体实例包括，例如，表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、转化生长因子(TGF)，神经生长因子(NGF)，源自脑的神经营养因子(BDNF)，血管内皮生长因子(VEGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、源自血小板的生长因子(TOGF)、促红细胞生成素(EPO)，促血小板生成素(TPO)，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF或FGF1)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF2)，角质形成细胞生长因子(KGF-1或FGF7，以及KGF-2或FGF10)，和肝细胞生长因子(HGF)。
[0203]激素的具体实例包括，例如，胰岛素、胰高血糖素、生长激素抑制素、人生长激素(hGH)、甲状旁腺素(PTH)和降钙素。
[0204]细胞因子的实例包括,例如，白介素、干扰素、和肿瘤坏死因子(TNF)。
[0205]生长激素、激素和细胞因子可能相互没有严格区分。例如，生理活性蛋白质可能是属于选自生长因子、激素和细胞因子中的单一类型的蛋白质，或者可以是属于选自它们中多种类型的蛋白质。
[0206]此外，生理 活性蛋白质可以是完整的蛋白质，或者可以是蛋白质的一部分。蛋白质的一部分的例子包括，例如，具有生理活性的部分。具有生理活性的部分的具体实例包括，例如，特立帕肽，一种由甲状旁腺素(PTH)的N端34个氨基酸残基构成的生理学活性肽。
[0207]抗体相关分子的具体实例包括，例如，完整抗体、Fab、F(ab’)，F(ab’)2，Fe,由重链(H链)和轻链(L链)组成的二聚体，Fe-融合蛋白质，重链(H链)、和轻链(L链)。
[0208]受体蛋白质没有特别限制。受体蛋白质可以是，例如，任何生理活性蛋白质和其他生理活性物质的受体蛋白质。其他生理活性物质的例子包括，例如，神经递质诸如多巴胺。此外，受体蛋白质可以是相关配体未知的孤」L受体。
[0209]要用作疫苗的抗原蛋白质没有特别限制，只要它们是能够诱导免疫应答的蛋白质即可。抗原蛋白质可以根据意图的免疫应答对象加以适当选择。
[0210]编码这些蛋白质的基因可以根据要使用的宿主、以及为了获得期望的活性而加以修饰。例如，可修饰编码这些蛋白质的基因，使得这些蛋白质包含一个或几个氨基酸残基的添加、缺失、取代等等。上述关于CspB蛋白质和cspB基因的变异体的变异体的记载还可以调整适用于通过本发明的方法分泌产生的异源蛋白质及其编码基因。此外，在编码这些蛋白质的基因中，可以将任意的密码子替换为其等价的密码子。例如，在编码这些蛋白质的基因中，根据需要可以根据宿主中所见的密码子使用频率来优化密码子。
[0211]本发明的基因构建体在编码包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列的核酸序列与编码异源蛋白质的核酸序列之间还可以包含编码用于酶促切割的氨基酸序列的核酸序列。通过在本发明的融合蛋白质中插入用于酶促切割的氨基酸序列，可以酶促切割表达出的融合蛋白，获得目标异源蛋白质。
[0212]用于酶促切割的氨基酸序列没有特别限制，只要其是能够被水解肽键的酶识别并消化的序列即可，可以根据目标异源蛋白质的氨基酸序列合适地选择可使用的序列。编码用于酶促切割的氨基酸序列的核酸序列可以根据该氨基酸序列来设计，例如，可使用宿主中观察到的密码子频率来使用最优的密码子。[0213]用于酶促切割的氨基酸序列优选是显示高底物特异性的蛋白酶的识别序列。这样的氨基酸序列的具体实例包括，例如，因子Xa蛋白酶的识别序列和proTEV蛋白酶的识别序列。Xa蛋白酶和proTEV蛋白酶分别识别蛋白质中的氨基酸序列Ile-Glu-Gly-Arg(=IEGR, SEQ ID NO: 105)和氨基酸序列 Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln( = ENLYFQ, SEQ IDNO: 106)，在各自识别序列的C端侧特异性消化该蛋白质。
[0214]通过本发明的方法最终得到的异源蛋白质的N端区域可以与天然蛋白质的N端区域相同，或者不与天然蛋白质的N端区域相同。例如，最终得到的异源蛋白质的N端区域可具有包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列，或包含Gln-Glu-Thr和前述的用于酶促消化的氨基酸序列的氨基酸序列，或者可以不含有这些序列中的任何序列。此外，例如，最终获得的异源蛋白质的N端区域可以是在天然蛋白质的N端区域中额外添加或缺失了I个或几个氨基酸。虽然根据目标异源蛋白质的全长或结构“一个或几个”氨基酸残基的数目可能不同，但具体而言其优选为1-20，更优选1-10，更优选1-5个。
[0215]此外，要分泌产生的异源蛋白质可以是包含原-结构(pro-structre)的蛋白质(原蛋白质)。当要分泌产生的异源蛋白质是原蛋白质时，最终获得的异源蛋白质可以是原蛋白质或者可以不是原蛋白质。即，原蛋白质可以通过切断原结构部分而被加工为成熟蛋白质。切断可以通过例如蛋白酶来实现。当使用蛋白酶时，从最终获得的蛋白质的活性的观点看，一般而言，原蛋白质优选在与天然蛋白质基本相同的位置被切断，或者更优选在与天然蛋白质完全相同的位置被切断，以便获得与天然成熟蛋白质相同的成熟蛋白质。因此，一般而言，最优选这样的特异性蛋白酶，其切割原蛋白质的位置使得产生与天然出现的成熟蛋白质相同的蛋白质。然而，如上所述，最终获得的异源蛋白质的N端区域与天然蛋白质的N端区域可能不相同。例如，根据要生产的异源蛋白质的类型、使用目的等，有时相比于天然蛋白质N端长或短一个到几个氨基酸残基的蛋白质可能具有更适宜的活性。本发明中能够使用的蛋白酶包括，例如，可商购的蛋白酶诸如Dispase (Boehringer Mannheim生产)，以及能够从微生物的培养液中获得的，例如放线菌的培养液。这样的蛋白酶可以在非纯化状态下使用，或者可以根据需要可以在纯化到一定纯度后使用。当原结构被切断而获得成熟蛋白质时，插入的包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列与原结构部分一起被去除，因此无需在包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列的下游提供用于酶促消化的氨基酸序列，就可以获得目标蛋白。
[0216]将本发明使用的基因构建体导入棒状杆菌型细菌的方法没有特别限制。在本发明的细菌中，本发明使用的基因构建体作为在染色体外自主复制的载体(如质粒)存在，或者可以组入染色体内。此外，为了构建本发明的细菌，可以按照任意的顺序实施用于本发明的基因结构的导入、分泌产生蛋白质的能力的赋予或增强、以及其他修饰。
[0217]本发明使用的基因构建体可以通过例如使用包含该基因构建体的载体导入宿主中。载体没有特别限制，只要选用能够在棒状杆菌型细菌中自主复制的载体即可，可以是，例如,来源于细菌质粒的载体、来源于酵母质粒的载体、来源于细菌噬菌体的载体、粘粒、噬菌粒等等。作为载体，例如，优选来源于棒状杆菌型细菌的质粒。在棒状杆菌型细菌中能够自主复制的载体的具体实例包括pHM1519(Agric.Biol.Chem.,48,2901-2903(1984))；pAM330(Agric.Biol.Chem.,48,2901-2903(1984));在日本专利申请特开平 3-210184 中所述的通过改进这些而获得的、具有药物抗性基因的质粒；在日本专利申请特开平2-72876和美国专利号 5，185，262 中所述的质粒 pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE、和PCRY3KX ;日本专利申请特开平1-191686中描述的质粒pCRY2和pCRY3 ;日本专利申请特开昭58-192900中描述的pAJ655、pAJ611、和pAJ1844 ;日本专利申请特开昭57-134500中描述的pCGl ;日本专利申请特开昭58-35197中描述的pCG2 ;日本专利申请特开昭57-183799中描述的PCG4和pCGll，等等。
[0218]此外，还可以使用人工转座子等。当使用转座子时，通过同源重组或转座子自身的转位能力将异源蛋白质基因导入基因组。利用同源重组的导入方法的其他例子包括，例如:利用线性DNA、具有温度敏感复制起点的质粒，能够进行接合转移的质粒、没有在宿主中发挥功能的复制起点的自杀载体等等的方法。此外，当异源蛋白质基因被导入染色体时，只要本发明使用的基因构建体能被构建到染色体上，该基因构建体中所含的下列一者或多者可以是原本存在于宿主染色体上的:启动子序列、编码信号肽的序列、和编码包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列的核酸序列。具体而言，例如，通过直接使用启动子序列、以及宿主染色体上原本存在的、连接于所述启动子序列下游的编码信号肽的核酸序列，并仅将连接于该编码信号肽的核酸序列下游的基因替换为编码包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列与异源蛋白质的融合蛋白的核酸序列，也能够在染色体上构建成本发明使用的基因构建体，从而也能构建本发明的细菌。
[0219]此外，当表达两种或更多种蛋白质时，只需本发明的细菌中携带各蛋白质的分泌产生用基因构建体，使得目的异源蛋白质的分泌产生得以实现即可。具体地，例如，所有分泌产生用基因构建体可以携带在一个表达载体上，或者携带在染色体上。或者，分泌产生用基因构建体可以分别被多个表达载体分别携带，或者可以由一个或多个表达载体以及染色体分别携带。“表 达两种或更多种蛋白质时”是指，例如，分泌产生两种或更多种异源蛋白质的情况，或者分泌产生异源多聚体蛋白质的情况。
[0220]用于将本发明使用的基因构建体导入棒状杆菌型细菌的方法没有特别限制，可以使用通常使用的方法，例如，原生质体方法(Gene，39，281-286 (1985))，电穿孔法(Bio/Technology, 7，1067-1070(1989))等等。
[0221]通过培养如上所述获得的本发明的细菌以表达异源蛋白质，获得分泌到细胞外的大量的该异源蛋白质。
[0222]本发明的细菌可以使用通常使用的方法和条件来培养。例如，本发明的细菌可以使用含有碳源、氮源、和无机离子的通常培养基培养。为了获得更高的扩增，可以视需要加入有机营养物例如维生素和氨基酸。
[0223]作为碳源，可以使用碳水化合物如葡萄糖和蔗糖、有机酸如乙酸、醇类和其他碳源。作为碳源，可以使用氨气、氨水、铵盐和其他氮源。作为无机离子，可以视需要合适地使用钙离子、镁离子、磷酸根离子、钾离子和铁离子等。培养在PH5.0到8.5的适合范围内、在15到37°C、在好氧条件下进行I到7天。此外，可以使用棒状杆菌型细菌的L-氨基酸生产的培养条件、使用其他Sec型、Tat型的信号肽的蛋白质制造方法中记载的其他条件(参见W001/23591和W02005/103278)。此外，当使用诱导性启动子表达异源蛋白质时，还可以向培养基中加入启动子诱导剂来进行培养。通过在此类条件下培养本发明的细菌，生成大量的目标蛋白质并将其高效地分泌到细胞外。此外，根据本发明的方法，产生的异源蛋白质被分泌到细胞外，因此某些在一般情况下如果在微生物细胞中大量积累有致死性的蛋白质，例如转谷氨酰胺酶，也可以连续生产而不造成致死效应。
[0224]根据本发明的方法分泌到培养基中的蛋白质可以在通过本领域技术人员公知的方法培养后从培养基中分离纯化。例如，在通过离心等分离细胞之后，可以通过已知的合适方法，例如盐析、乙醇沉淀、超离心、凝胶过滤层析、离子交换柱层析、亲和层析、中压或高压液相层析、反相层析和疏水层析，或它们的组合来分离并纯化蛋白质。此外，在特定情况下，可直接使用培养物或培养上清液。根据本发明的方法分泌到细胞表层中的蛋白质，在用本领域技术人员公知的方法(例如增加盐浓度和使用表面活性剂)使其溶解之后，也可以通过和蛋白质分泌到培养基中的情况一样的方式将其分离和纯化。此外，在某些情况下，分泌到细胞表层中的蛋白质可以不经溶解而作为固定化酶使用。
[0225]目标异源蛋白质的分泌产生可以通过以培养上清液和/或含有细胞表层的级分作为样品进行SDS-PAGE，确定分离的蛋白质条带的分子量来加以确认。目标异源蛋白质的分泌产生还可以通过以培养上清液和/或含有细胞表层的级分作为样品，使用抗体进行Western 印迹(Molecular Cloning, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor(USA), 2001)来加以确认。目标异源蛋白质的分泌产生还可以通过使用蛋白质测序仪测定目标蛋白质的N端氨基酸序列来加以确认。此外，目标异源蛋白质的分泌产生还可以通过使用蛋质谱仪测定目标蛋白质的质量来加以确认。此外，当目标异源蛋白质是酶或具有特定的可测量的生理活性的蛋白质时，目标异源蛋白质的分泌产生可以通过测量作为样品的培养上清液和/或含有细胞表层的级分中的目标异源蛋白质的酶活性和/或生理活性来加以确认。
[0226]当本发明使用的基因构建体表达的蛋白质中紧邻信号肽之后的残基是谷氨酰胺残基时，通过切割信号肽而获得的蛋白质的N端氨基酸残基是由原本的谷氨酰胺残基脱水缩合而形成的焦谷氨酸残基。即，例如，通过本发明的方法分泌到培养基中的异源蛋白质的N端氣基酸残基可以是焦谷氣酸残基。目标异源蛋白质的N端氣基酸残基是焦谷氣酸残基可以通过用质谱仪测定目标异源蛋白质的质量，并确认测得的质量与理论原质量减去水分子质量(=18)所算得的质量相对应来加以确认。此外，当该蛋白质的N端氨基酸残基是焦谷氨酸残基时，Edman降解反应被封闭，因此N端氨基酸序列无法用蛋白质测序仪测定。因此，还可以基于目标异源蛋白质的N端氨基酸序列即使使用蛋白质测序仪也无法直接测定、而让焦谷氨酸氨肽酶作用于目标异源蛋白质之后，可以使用蛋白质测序仪测定原先的N端氨基酸序列中的第二个及以后的氨基酸残基这一事实，来确认目标异源蛋白质的N端氨基酸残基是焦谷氨酸残基。此外，作为简化的方法，可以基于目标异源蛋白质的N端氨基酸序列即使用蛋白质测序仪也无法直接测定这一事实来确认目标异源蛋白质的N端氨基酸残基是焦谷氨酸残基。
实施例
[0227]下面将援引下述实施例对本发明进行更具体的解释。但这些实施例不应当被解释为以任何方式限制本发明的范围。
[0228]实施例1:胰岛素原与谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的成熟细胞表层蛋白质CspB的N 端 I, 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，17，20，50，100，150，200，250，300，350，400
或440个氨基酸残基的融合物的分泌表达。[0229](I)胰岛素原基因的全合成和使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的细胞表层蛋白质CspB的信号肽序列的胰岛素原分泌表达质粒构建
[0230]胰岛素原(下面缩写为PIns)的氨基酸序列已经得到确定(Genbank AccessionN0.NP_000198.1)。考虑该序列以及谷氨酸棒状杆菌中的密码子频率，合成了 SEQ IDNO: 1-8中所示的DNA。使用这些DNA作为模板，SEQ ID N0:9和10中所示的DNA作为引物，通过PCR扩增了编码PIns的基因，获得如SEQ ID NO: 11中所示的大约0.3kbp的DNA片段。将该DNA片段插入克隆质粒pHSG398 (Takara Bio)的SmaI位点而获得pHSG-Pins。使用上述pHSG-PIns作为模板，SEQ ID N0:9和10中所示的DNA作为引物，通过PCR扩增PIns基因区，获得大约0.3kbp的PIns基因片段。
[0231]CspB(—种谷氨酸棒状杆菌的细胞表层蛋白质)的核苷酸序列已经得到确定(非专利文献8 ；Mol.Microbiol.，9，97-109 (1993))。参考该序列，使用W001/23591中所述的pPKPTGl作为模板，SEQ ID N0:12和SEQ ID NO: 13中所示的引物，通过PCR扩增了来源于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的CspB的启动子区域和信号肽序列编码区域，得到大约0.7kbp的DNA片段。pPKPTGl是一种用于转谷氨酰胺酶原(具有原-结构部分的转谷氨酰胺酶)分泌表达的载体，包含来源于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869菌株的CspB基因的启动子、可表达地连接于该启动子下游的、编码来源于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869菌株的信号肽的30个氨基酸残基的DNA、以及连接于该信号肽编码DNA下游的、来源于放线菌茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)的转谷氨酰胺酶原基因，使得该转谷氨酰胺酶原基因作为与信号肽的融合蛋白质表达。
[0232]此外，使用扩增的两种DNA片段(即PIns基因片段和启动子区和信号肽编码区的片段)作为模板，SEQ ID NO: 12和10所示的DNA作为引物，获得了大约0.9kbp的DNA片段，其由上述两个DNA片段融合而成。在引物SEQ ID N0:12和10中设计有限制酶KpnI的识别序列。为了 PCR,使用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio),反应条件依照制造商推荐的规程。用限制酶KpnI处理该DNA片段，然后将其插入日本专利申请特开平9-322774中描述的PPK4的KpnI位点，获得pPKPIns。通过对插入片段的核苷酸测序，确认了预期的融合基因的构建。核苷酸测序使用BigDye (注册商标)Terminator v3.1Cycle SequencingKit (Applied Biosystems)和 3130Genetic Analyzer (Applied Biosystems)进行。
[0233](2)用于胰岛素原与谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的成熟细胞表层蛋白质CspB的N端 I, 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，17，20，50，100，150，200，250，300，350，400 或440个氨基酸残基的融合物的分泌表达的质粒的构建
[0234]如上所述，谷氨酸棒状杆菌的细胞表层蛋白质CspB的编码基因的核苷酸序列已经被测定(非专利文献8 ;Mol.Microbiol.,9,97-109(1993))。在谷氨酸棒状杆菌中，CspB定位于细胞表层，形成一个称为S-层的层，而且还知道位于C端侧的一个高度疏水氨基酸残基的区域参与定位(非专利文献8 ;Mol.Microbiol.,9,97-109(1993))。通过参考该序列，合成了SEQ ID N0:12和14所示的引物，并使用以常规方式(Saito和Miura的方法[Biochem.Biophys.Act.，72，619(1963)])制备的谷氨酸棒状杆菌ATCC13869 的染色体DNA作为模板进行PCR，扩增了包括CspB编码基因的启动子的5’-上游区域(以下也称为CspB启动子区域)，以及编码CspB N端信号肽的30个氨基酸残基和CspB成熟蛋白质的N端440个氨基酸残基的区域。CspB成熟蛋白质的N端440个氨基酸残基是指谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的CspB成熟蛋白质的全长469个氨基酸残基(SEQ ID NO:96)中除去组成疏水区的C端29个氨基酸残基的部分。PCR使用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio)，反应条件依照制造商推荐的规程。
[0235]然后，为了构建用于胰岛素原与谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的成熟细胞表层蛋白质 CspB 的 N 端 I, 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，17，20，50，100，150，200，250，300，350，400或440个氨基酸残基的融合物的分泌表达的质粒，使用如上所述扩增的PCR产物作为模板，合成 DNA SEQ ID NO: 12 与 15，SEQ ID NO: 12 与 16，SEQ ID NO: 12 与 17，SEQ IDNO: 12 与 18，SEQ ID NO: 12 与 19，SEQ ID NO: 12 与 20，SEQ ID NO: 12 与 21，SEQ ID NO: 12 与22，SEQ ID NO:12 与 23，SEQ ID NO:12 与 24，SEQ ID NO:12 与 25，SEQ ID NO:12 与 26，SEQID NO: 12 与 27，SEQ ID NO: 12 与 28，SEQ ID NO: 12 与 29，SEQ ID NO: 12 与 20，SEQ ID NO: 12与31，SEQ ID NO: 12与32，SEQ ID NO: 12与33，SEQ ID NO: 12与34，SEQ ID NO: 12与35，SEQID NO:12 与 36，SEQ ID NO:12 与 37，SEQ ID NO:12 与 38，SEQ ID NO:12 与 39，或 SEQ IDNO: 12与40作为引物进行PCR，以分别扩增CspB启动子区、编码CspB的N端信号肽的30个氨基酸残基的区域、以及CspB成熟蛋白质N端的I, 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，17，20，50，100，150，200，250，300，350，400，或440个氨基酸残基。此外，通过使用实施例I (I)中构建的质粒pPKPIns作为模板、SEQ ID N0:9和41中所示的合成DNA作为引物，扩增了 PIns基因区域而获得 PIns基因片段。
[0236]此外，使用上述两个扩增DNA片段(即，CspB启动子区域及编码CspB信号肽和成熟 CspB 的 N 端 I, 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，17，20，50，100，150，200，250，30O, 350，400,或440个氨基酸残基的区域的片段；以及PIns基因片段)作为模板、SEQ IDNO: 12和41中所示的DNA作为引物进行PCR，获得了由这两个DNA片段融合到一起而构成的DNA片段。在引物SEQ ID NO: 12和41中，设计有限制酶KpnI的识别序列。引物SEQID NO: 15-40包含编码位于PIns的N端一侧的氨基酸序列的序列，用于构建编码CspB成熟蛋白质的N端的区域和PIns基因的融合基因。PCR使用Pyrobest DNA聚合酶(TakaraBio)，反应条件依照制造商推荐的规程。用限制酶KpnI处理这些DNA片段，然后将它们插入日本专利申请特开平9-322774中描述的pPK4中的KpnI位点，以分别获得pPKKlPIns，pPKK2PIns, pPKK3PIns, pPKK4PIns, pPKK5PIns, pPKK6PIns, pPKK7PIns, pPKK8PIns, pPKK9PIns, pPKKlOPIns, pPKKllPIns, pPKK12PIns, pPKK13PIns, pPKK14PIns, pPKK15PIns, pPKK17PIns, pPKK20PIns, pPKK50PIns, pPKKlOOPIns, pPKK150PIns, pPKK200PIns, pPKK250PIns, pPKK300PIns, pPKK350PIns, pPKK400PIns,和pPKK440PIns。通过对插入片段的核苷酸测序，确认了期望的融合基因的构建。核苷酸测序使用BigDye (注册商标)Terminator v3.1CycleSequencing Kit (Applied Biosystems)和 3130Genetic Analyzer(Applied Biosystems)进行。
[0237](3)胰岛素原与谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的成熟细胞表层蛋白质CspB的N端I，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，17，20，50，100，150，200，250，300，350，400 或 440个氨基酸残基的融合物在谷氨酸棒状杆菌YDK010株中的分泌表达
[0238]将W02004/029254中描述的谷氨酸棒状杆菌YDK010株用实施例1(1)中构建的pPKPIns转化,它是用于分泌表达未与成熟CspB的N端氨基酸残基融合的胰岛素原的质粒；以及用实施例1 (2)中构建的 pPKKlPIns, pPKK2PIns, pPKK3PIns, pPKK4PIns, pPKK5PIns, pPKK6PIns, pPKK7PIns, pPKK8PIns, pPKK9PIns, pPKKlOPIns,pPKKllPIns, pPKK12PIns,pPKK13PIns, pPKK14PIns, pPKK15PIns, pPKK17PIns, pPKK20PIns, pPKK50PIns, pPKKlOOPIns,pPKK150PIns, pPKK200PIns, pPKK250PIns, pPKK300PIns, pPKK350PIns, pPKK400PIns,和pPKK440PIns，它们是用于分泌表达胰岛素原与谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的细胞表层蛋白质 CspB 的成熟蛋 白 N 端 I, 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，17，20，50，100，150，200，250，300, 350，400,或440个氨基酸残基的融合物的质粒。谷氨酸棒状杆菌YDK010株是谷氨酸棒状杆菌AJ12036(FERM BP-734) (W02004/029254)的细胞表层蛋白质PS2 (CspB)缺陷株。将所得的每个转化体在含有25mg/ml卡那霉素的丽液体培养基(120g葡萄糖、3g七水合硫酸镁、30g硫酸铵、1.5g磷酸二氢钾、0.03g七水合硫酸铁、0.03g四水合硫酸猛、0.45mg盐酸硫胺素、0.45mg生物素、0.15g DL-甲硫胺素、和50g碳酸韩，用水制成IL体积，调整到PH7.0)中30°C培养72小时。在培养完成之后，对通过将每个培养液离心而获得的培养上清液进行还原型SDS-PAGE，然后使用CBB R-250 (Bio-Rad)进行染色。结果，对于导入了质粒pPKPIns(该质粒表达未与CspB的成熟蛋白质的N端氨基酸融合的PIns)的菌株而言，用肉眼仅能确认一条非常微弱的代表具有预期的分子量的蛋白质的条带。相比之下，对于导入了表达PIns与CspB的成熟蛋白质的N端氨基酸的融合物的各种质粒的菌株，检测到一条代表具有预期的分子量的蛋白质的强条带，因此确认了通过与CspB成熟蛋白质的N端氨基酸序列融合显著增加了分泌量。对于与CspB N端3-8、17和50个氨基酸的融合物而言分泌量改进的效果特别明显(图1)。此外，针对在SDS-PAGE中检测到的目标蛋白质条带，使用密度计进行了分泌量的定量。结果，与导入了表达未与CspB的成熟蛋白质的N端氨基酸融合的PIns的质粒pPKPIns相比，几乎所有的导入了表达PIns与CspB的成熟蛋白质的N端氨基酸的融合物的质粒的菌株的分泌量都增加了 1.5倍或更多。尤其是，对于导入了与成熟CspB的N末端的4、6、17和50个氨基酸残基的融合物的pPKK4PIns, pPKK6PIns, pPKK17PIns,和 pPKK50PIns 的菌株，分泌量增加了 10 倍以上(表I中的“分泌量(％ ) ”)。此外，对于与成熟CspB的N端的3-8个氨基酸残基融合的情况，PIns的分泌量增加了 5倍以上(表1中“分泌量(％ )”)。此外，基于目标融合蛋白质的分子量计算了被分泌的分子数的相对值。结果，再次确认了 PIns的分泌量，尤其是在与成熟CspB的N端3-8、17、或50个氨基酸残基残基融合的情况下显著增加(表1中“分泌量(% ) ”)。同时，当尝试使用蛋白质测序仪PPSQ-21A(Shimadzu)测定这些确认了分泌量提闻的各融合蛋白质的N端氣基酸序列时，这些融合蛋白质的N端氣基酸残基无法测定，考虑到后述的结果，确认了这些融合蛋白质的N端氨基酸已转化为焦谷氨酸。
[0239][表 I]
【权利要求】
1.一种产生异源蛋白质的方法，包括: 培养具有用于分泌表达异源蛋白质的基因构建体的棒状杆菌型细菌；和 收集分泌产生的异源蛋白质， 其中所述基因构建体包含:在棒状杆菌型细菌中发挥功能的启动子序列，连接在该启动子序列下游的编码在棒状杆菌型细菌中发挥功能的信号肽的核酸序列，以及连接在该编码信号肽的核酸序列下游的编码包含Gln-GlU-Thr的氨基酸序列与所述异源蛋白质的融合蛋白质的核酸序列， 条件是所述包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列不是由SEQ ID NO:96的1_14位或1_38位的氨基酸残基组成的氨基酸序列。
2.权利要求1所述的方法，其中所述包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列是选自下述氨基酸序列(A)-(H)的氨基酸序列:
(A)Gln-Glu-Thr
(B)Gln-Glu-Thr-Xaal(SEQID NO:102)
(C)Gln-Glu-Thr-Xaal-Xaa2(SEQID NO:103)
(D)Gln-Glu-Thr-Xaal-Xaa2-Xaa3(SEQID NO:104) (E)由Gln-Glu-Thr与成熟CspB的4_7位的氨基酸残基融合而构成的氨基酸序列， (F)由Gln-Glu-Thr与成熟CspB的4_8位的氨基酸残基融合而构成的氨基酸序列， (G)由Gln-Glu-Thr与成熟CspB的4_17位的氨基酸残基融合而构成的氨基酸序列， (H)由Gln-Glu-Thr与成熟CspB的4_50位的氨基酸残基融合而构成的氨基酸序列，
其中 Xaal 是 Asn、Gly、Thr、Pro 或 Ala,Xaa2 是 Pro>Thr 或 Val,且 Xaa3 是 Thr 或 Tyr。
3.权利要求2所述的方法，其中所述包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列选自下组的氨基酸序列:Gln-Glu-Thr-Asn-Pro-Thr (SEQ ID NO: 97), Gln-Glu-Thr-Gly-Thr-Tyr (SEQ IDNO:98), Gln-Glu-Thr-Thr-Val-Thr (SEQ ID NO:99), Gln-Glu-Thr-Pro-Val-Thr (SEQ IDNO: 100)、和 Gln-Glu-Thr-Ala-Val-Thr (SEQ ID NO: 101)。
4.权利要求1-3 中任一项所述的方法，其中所述基因构建体在所述编码包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列的核酸序列和所述编码异源蛋白质的核酸序列之间还包含编码用于酶消化的氨基酸序列的核酸序列。
5.权利要求4所述的方法，其中所述用于酶消化的氨基酸序列是因子Xa蛋白酶的识别序列，或者ProTEV蛋白酶的识别序列。
6.权利要求5所述的方法，其中所述蛋白酶的识别序列是SEQID NO: 105或106中所示的氨基酸序列。
7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述在棒状杆菌型细菌中发挥功能的信号肽是来源于棒状杆菌型细菌的CspB的信号肽。
8.权利要求7所述的方法，其中所述CspB的信号肽具有SEQID NO:92中所示的氨基酸序列。
9.权利要求1-8中任一项所述的方法，其中作为培养对象的棒状杆菌型细菌是属于棒状杆菌属(Corynebacterium)或短杆菌属(Brevibacterium)的细菌。
10.权利要求1-9中所述的方法，其中作为培养对象的棒状杆菌型细菌是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)或 Corynebacterium stationis。
【文档编号】C12N15/09GK103917656SQ201280052867
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2012年10月25日 优先权日:2011年10月25日
【发明者】鹤井典子, 板屋宽, 菊池庆实 申请人:味之素株式会社