Hmgb1在治疗组织损伤和/或促进组织修复中的用途的制作方法

专利名称：Hmgb1在治疗组织损伤和/或促进组织修复中的用途的制作方法
技术领域：
HMGB1(高迁移1组蛋白)既是一种核因子也是一种分泌蛋白质。在细胞核中，它作为一种结构染色质结合因子，可以结合DNA并促进特定DNA靶标上的蛋白质装配(Bustin，Mol.Cell.Biol.，19，5237-5246，1999)。在细胞外，它与RAGE(高级糖基化终产物的受体)高亲和力结合(Hori等人，J.Biol.Chem.270，25752-25761，1995)，是炎症的一种有效介质(Wang等人，Science 285，248-251，1999；Abraham等人，J.Immunol.，165，2950-2954，2000；Andersson等人，J.Exp.Med.，192，565-570，2000)。HMGB1由激活的单核细胞和巨噬细胞主动分泌(Wang等人，Science 285，248-251，1999)，由坏死或损伤的细胞被动分泌(Degryse等人，J.Cell Biol.1521197-2006，2001；Müller等人EMBO J.，16，4337-4340，2001；Falciola等人，J.Cell Biol.137，19-26，1997)。
Wang等人(Science，285，248-251，1999)确定HMGB1是小鼠内毒素致死的一种晚期介质。他们证实LPS、TNF或IL-1刺激的单核细胞/巨噬细胞分泌HMGB1，作为一种迟发型应答。在小鼠中，施用抗HMGB1抗体可缓解LPS诱导的内毒素血症；相反，注射HMGB1导致中毒性休克。而且，脓毒症患者显示血清HMGB1水平升高，它与感染的严重程度相关(US 6,303,321；WO 00/47104)。
随后，当气管内施用HMGB1时，表明它也能够引起急性肺炎症(Abraham等人，J.Immunol.，165，2950-2954，2000)。抗HMGB1抗体减少肺水肿和嗜中性粒细胞迁移，而它们不能降低其它促炎细胞因子TNFα、IL-1β或巨噬细胞-炎症-蛋白-2(MIP2)的水平。在免疫与神经内分泌s-系统之间建立重要联系的垂体细胞，响应特定刺激(如TNFα和IL-1β)释放HMGB1，提示HMGB1也参与神经内分泌的调节和对炎症过程的免疫应答(Wang等人，Surgery，126，389-392，1999)。然而，大多数细胞(包括淋巴细胞、肾上腺细胞或肾细胞)不能分泌HMGB1。
Wang和Andersson的研究小组研究的现象来自于特定细胞主动(如果未常规)分泌HMGB1，该细胞对促炎细胞因子的特异性刺激起反应。HMGB1分泌需要在细胞刺激后至少16个小时，因此是炎症中的一个晚期事件。因此分泌的HMGB1的作用在于加强及延长由其它一些事件启动的炎症。
相反，作者现在证明坏死细胞释放的HMGB1可以是炎症应答的初始触发剂，释放的HMGB1本身能够激活炎症细胞。HMGB1释放和扩散能够在大约数秒或数分钟内发生，因此是炎症中的一个极早期事件。因此某些细胞型未死亡时即可分泌HMGB1的能力肯定是一种类型的分子模拟这些细胞已形成了分泌相同分子的能力，该分子的细胞外存在发出组织损伤的信号。
本发明的作者报告，Hmgb1-/-坏死细胞促进炎症的能力大大降低，证明HMGB1的释放能够将一个细胞死亡的信号传送给它的邻居，并且将组织损伤的信号传送给该生物的其它部分。而且，凋亡细胞不释放HMGB1，甚至在经历二次坏死和部分自溶后仍然如此，因此，即使不被吞噬细胞快速清除，也不能促进炎症。在凋亡细胞中，由于普遍的染色质修饰，HMGB1与染色质紧密结合，如果染色质脱乙酰作用被阻止，则释放到细胞外基质中(促进炎症)。因此，经历凋亡的细胞被编程(programmed)，阻止由于损伤而被破坏或杀死的细胞的信号传播。因此，尽管HMGB1是染色质中的一种富含成分，但是它也具有作为一种可溶性细胞外蛋白质的作用。
可以设想以下的事件顺序坏死→初步HMGB1释放→炎症细胞激活→细胞因子分泌→炎症细胞的进一步激活和募集(recruitment)→炎症细胞分泌HMGB1→继续分泌细胞因子和炎症细胞进一步激活和募集的循环。
这种循环产生正反馈，以及强烈的炎症应答。这种循环必须在某一点被打破，以中断炎症应答。
除了触发炎症以外，HMGB1还激活组织保护或修复的另外一些系统。在本发明中证实，HMGB1能够促进功能在于修复组织损伤的细胞的迁移和增殖。这些细胞中最重要的是干细胞。作为干细胞募集和增殖的一个例子，作者已经证明了对血管结合干细胞中胚层成血管细胞(mesoangioblast)的体外和体内作用。
HMGB1作为组织损伤信号的直接实际应用的一个例子是，作者们研究了心脏梗死后心肌组织的再生和功能恢复。
HMGB1有利地促进梗死心脏的再生和功能恢复。心肌梗死导致组织损失和心功效减弱。现代心脏病学的主要治疗目标之一是设计旨在最小化心肌坏死和在心肌梗死后优化心脏修复的策略。尽管骨髓细胞向梗死区移植和转移已经获得有希望的结果(Orlic等人，Circ Res.27，1092-1102，2002)，但是调节干细胞向组织损伤区归巢(homing)的信号至今尚未很好地表征。
WO02/074337公开了HMGB1可能在结缔组织再生中起作用。结缔组织细胞与本发明的靶细胞在胚胎学上无关。
WO00/47104要求专利保护一种药物组合物，其用于治疗特征在于炎症细胞因子级联激活的疾病，如脓毒症和肥胖症，该组合物包含有效量的HMG-1的拮抗剂或抑制剂。
发明描述因此，本发明的一个目标是一种组合物，其含有有效量的HMGB1蛋白或其功能部分，或表达HMGB1的载体，用于治疗组织损伤和/或促进组织修复和再生。优选地，组织再生取决于与损伤细胞相同类型的细胞的生长，因此不包括结缔组织生长替换损失的组织。更优选地，该组织是心肌或骨骼肌。
在本发明的一个具体方面，组织修复和/或再生包括坏死区，优选地创伤部位、缺血部位，包括梗死的心脏、烧伤部位的修复和/或再生。
在本发明的一个优选方面，该组合物还包含有效量的抗炎剂。本领域专家将选择最合适的抗炎剂。
在本发明的一个优选方面，该组合物还包含稀释剂和/或佐剂，用于在组织修复部位灌注。此外，该组合物还包含稀释剂和/或佐剂和/或载体，用于肌肉内注射。
在本发明的一个进一步优选的方面，该组合物与干细胞，优选地与中胚层成血管细胞结合。
本发明的另外一个实施方案是一种组合物，其包含有效量的HMGB1蛋白的拮抗剂，用于治疗坏死组织诱导的不良反应，如骨髓细胞的募集和激活，内皮屏障功能的丧失，水肿。
在本发明的一个优选方面，坏死组织是指肠梗阻、急性胰腺炎和大面积创伤。
在本发明的一个优选方面，坏死组织诱导的不良反应包括坏死的长期效应，如脓毒症和多器官衰竭。
本领域专家认为，术语“HMGB1拮抗剂”包括但不限于HMGB1抗体及其功能重组或合成部分、干扰RNA、反义RNA、合成或天然调节剂。
在一个具体方面，该组合物最好在坏死事件发生后16小时内施用。
本发明的另外一个方面是促进干细胞在细胞培养中或在体内迁移和/或增殖的一种方法，该方法包括使这些细胞暴露于有效量的HMGB1蛋白或其功能部分的步骤。优选地，干细胞是定居(resident)的心脏或循环干细胞。
本发明的另外一个方面是促进心肌细胞在细胞培养中或在体内增殖的一种方法，该方法包括使这些细胞暴露于有效量的HMGB1蛋白或其功能部分的步骤。
发明详述作者证实HMGB1由坏死细胞释放，但是凋亡细胞不释放。这样，HMGB1能够发出组织损伤的信号，因为组织损伤产生非编程细胞死亡(坏死)。
坏死细胞(在大约数秒或数分钟内)释放的HMGB1的第一个效应是附近细胞的激活，内皮屏障功能的丧失，骨髓细胞的募集和激活，和炎症的触发。作为一种更迟发的应答，(坏死细胞直接释放的，或者激活的炎症细胞主动分泌的)HMGB1将促进某些细胞型，包括干细胞，向组织损伤部位迁移，以及它们的增殖。
具体而言，当用HMGB1刺激时，成年和胚胎血管相关干细胞(中胚层成血管细胞)增殖。HMGB1也能够诱导中胚层成血管细胞迁移，以及通过内皮屏障移行(transmigration)。在体内，含有注射到胫骨肌内的HMGB1的肝素珠能够吸引携带注射到股动脉内的核lacZ的中胚层成血管细胞。
体内数据表明，HMGB1促进梗死心脏的再生。实际上，HMGB1诱导新形成的肌细胞进入梗死的心脏。新形成的组织通过苏木精和伊红染色可见，表达心脏分子标记物，如α-肌节肌动蛋白、间隙连接蛋白4、MEF2等。新形成的组织高度增生，如Ki67的表达所见。因此HMGB1诱导梗死心脏中心肌细胞的增殖和分化。而且，如根据超声心动图和血液动力学参数检验的，HMGB1处理的心脏的心肌功能增强。
HMGB1对缺血心脏恢复的影响可能是由于心脏中存在的定居心脏干细胞的募集/增殖，和/或循环干细胞的募集/增殖，和/或心肌细胞增殖的诱导。
HMGB1诱导的心脏组织再生及其对心肌功能恢复的影响与直接注射到心脏内的造血干细胞(HSC)移植后观察到的相当(Orlic等人，Nature，410，701-705，2001)。本发明显示了在治疗心肌梗死中使用的一种可能的新方法。
HMGB1可以单独(或者与细胞治疗联合)用于所有类型的组织再生。与基于干细胞的再生方法相比，这是一个优点，基于干细胞的再生方法需要GMP提取和扩增，经历移植排斥/免疫应答，需要生物伦理学批准，不易包装到工业产品内。
HMGB1可具有诱导心肌细胞增殖的独特能力，因而对于几种心脏疾病具有治疗用途。
HMGB1可以作为一种重组蛋白施用，该重组蛋白注射到邻近梗死的收缩壁中或胫骨肌的肝素珠中。然而，由于蛋白质的平均寿命较短，施用方案可能需要高剂量或重复剂量才能达到治疗效果。因此，方便地能够使用一种基因治疗方法。编码HMGB1的核酸可以被适当的载体(质粒、病毒)携带到细胞内。
剂量也是要严格控制的一个因素，因为HMGB1是一种炎症分子。在当前关于局部缺血的研究中，将200ng蛋白质注射到邻近梗死的活心肌的前面和后面。该剂量比全身炎症所需的剂量低大约2000倍。
图例现在将参照下列附图描述本发明

图1活和死亡HeLa细胞中HMGB1的染色质结合。培养细胞的培养基(S)与细胞(P)一起通过SDS-PAGE分析。组蛋白通过考马斯蓝染色显示，HMGB1通过免疫印迹显示或者用抗HMGB1抗体免疫染色，DNA用DAPI染色。定标线条，7.5μm。a，表达HMGB1-GFP的活细胞，通过鉴别干涉相差并且在绿色荧光中成像。b，分裂间期细胞，透化之后。c，坏死细胞，未透化。培养基中HMGB1的含量与坏死细胞的数量成比例(约50％)。d，凋亡细胞，透化。e，经历凋亡和二次坏死的细胞释放HMGB1和乳酸脱氢酶(LDH)的动力学。
图2活和凋亡细胞中的HMGB1动力学。定标线条，2.3μm(a，b)和3.7μm(e，f)。分裂间期细胞中HMGB1-GFP的FLIP成像(a)和定量(c)。圆形所示的区域反复漂白，细胞在漂白脉冲之间成像。邻近的细胞核未受影响。有丝分裂细胞的FLIP成像(b)和定量(d)。在细胞质(圆形)中进行漂白，对细胞质中的不同斑点或者对凝聚染色体上的斑点进行定量。凋亡细胞中(e)以及在200ng/ml TSA存在下经历凋亡的细胞中(f)的FLIP成像，以及它们的定量(g)。h，活和凋亡细胞中GFP-HMGN2的FLIP定量。
图3凋亡中发生的染色质改变产生HMGB1的结合底物。定标线条，9.5μm。a，b细菌产生的HMGB1(用Cy5标记的，a，或者未标记的，b)结合凋亡Hmgb1-/-成纤维细胞的染色质，而不结合非凋亡成纤维细胞的染色质，如通过显微镜检查(a)或Western印迹(b)所显示的。组蛋白通过考马斯蓝染色显示。c，DNA断裂不会引起HMGB1与凋亡核结合。诱导HeLa细胞(表达ICAD的一种标记形式，或者对照)凋亡(凋亡的，第2、4道)或者模拟处理(活的，第1、3道)。凋亡中的ICAD被胱天肽酶(caspase)酶切，并且丢失FLAG标签(Western，抗FLAG抗体；第4道)。琼脂糖凝胶电泳证实凋亡的野生型细胞中染色体DNA的核小体间切割(第2道)，及其在表达ICAD的凋亡细胞中的抑制(第4道)。透化表达ICAD的凋亡细胞，固定，对DNA、HMGB1和TUNEL染色。当所有细胞都是TUNEL阴性时，HMGB1稳定地保留在显示染色质凝聚的细胞核内(右上角)。d，来自约500万个活和凋亡HeLa细胞的总提取物进行二维电泳，并用抗HMGB1抗体进行免疫印迹。可见HMGB1的多种乙酰化形式，但是在两种样品之间检测不到差异。e，凋亡细胞中的组蛋白H4被低乙酰化(hypoacetylated)。用R10抗体(H4的乙酰化形式特异的)进行免疫印迹。
图4 HMGB1释放促进免疫应答。a，缺乏HMGB1的坏死细胞不引发单核细胞产生促炎细胞因子TNF-α。线条代表标准差(n＝3)。b，经历二次坏死和部分自溶的凋亡细胞不促进炎症应答，除非通过TSA处理固定HMGB1。该实验一式两份重复3次，用2种不同含量的凋亡细胞确保TNF-α产生的线性。对于用0.2×105凋亡细胞攻击后添加的TNF-α的量，将数值标准化为数值1。c，抗HMGB1抗体减少扑热息痛(AAP)超剂量损伤的肝脏的炎症。9个小时后估计肝损伤(血清中的丙氨酸转氨酶活性)和炎症细胞募集(总肝脏提取物中的髓过氧化物酶活性)。MPO/ALT比表示对肝损伤标准化的炎症。每个点代表一只小鼠，线条代表平均值，灰色阴影代表平均值±标准差内所含的面积。小鼠组之间的成对比较(Mann-Whitney检验)用箭头表示。
图5对雄蕊(staminal)细胞的HMGB1趋化性测定。趋化性测定使用改良Boyden室进行。数值1对应于在没有任选刺激剂的情况下迁移(随机细胞迁移)的细胞数量。数据表示平均值±SE。在ANOVA模型中，结果的统计学显著性为P＜0.0001。用HMGB1+抗HMGB1处理获得与未刺激的对照在统计学上没有不同的结果。单独用抗HMG1抗体或者用一种非特异性抗体处理D18细胞与未刺激的对照也难以区别。
图6在HMGB1存在下雄蕊细胞的生长曲线。将5×104D18细胞平板接种于3cm孔中，在补充20％胎牛血清(FBS)的RPMI中培养，37℃5％CO224小时。然后将培养基替换为RPMI(无血清)，16小时。随后将培养基替换为只含RPMI、含有RPMI+20％FBS和RPMI+指定浓度HMGB1(无血清)的新鲜培养基。在指定时间(第1、2、3天)收集细胞，用血细胞计数器计数。单独RPMI中的细胞不分裂，而RPMI+HMGB1中的细胞活跃分裂至少24小时，然后由于养分耗尽较缓慢地分裂。但是在第3天，通过显微镜检查估计，含有HMGB1(所有浓度)刺激的D18细胞的所有平板均含有一些分裂的细胞。
图7 HMGB1对胚胎中胚层成血管细胞增殖的影响。(A)D16细胞在未添加、含有指定浓度的HMGB1或20％FCS的RPMI培养基中生长。HMGB1在检测的所有浓度下均诱导细胞增殖，但是细胞数量在48小时后达到平台。每个点都代表平均值±SD(n＝3)。该实验重复3次。(B)D16细胞分裂通过FACS分析在30ng/ml HMGB1存在下6个小时后，DNA含量增加，但是在24小时后回复到正常的二倍体含量。星号表示统计学显著性(p＜0.001)。(C)在HMGB1存在下，3T3成纤维细胞(如图A中的D16细胞一样处理)不分裂。
图8 HMGB1再刺激延长中胚层成血管细胞增殖。在时间0时将D16细胞置于含有30ng/ml HMGB1的RPMI培养基中；也在三角形表示的时间加入类似含量的HMGB1。多次刺激的D16细胞保持生长。每个点都代表一式两份进行的两个实验的平均值±SD。插图实验开始48小时后，培养D16细胞的培养基中HMGB1的Western印迹。HMGB1在再刺激细胞的培养基中仍然存在，但是在时间0时刺激一次的培养基中不存在。该实验重复2次，获得相似的结果。
图9 HMGB1对胚胎中胚层成血管细胞具有趋化活性。(A)D16细胞在含有10、50或100ng/ml HMGB1的Boyden装置中进行趋化性测定。数据代表一式两份进行的4次实验的平均值±SD；升高的HMGB1浓度的影响非常显著(在ANOVA分析中p＜0.001)。加入识别肽166-181的抗HMGB1抗体显著降低了趋化应答(与不含抗体的样品相比，p＜0.05)，而加入抗A盒单克隆抗体没有影响。(B)多种HMGB1片段(均为10ng/ml)对D16细胞的趋化活性。全长HMGB1，A盒和B盒，二结构域AB，无尾HMGB1(ABbt)，在(C)中显示。ABbt具有与全长HMGB1相当的趋化作用(蛋白质对单独的培养基，p＜0.05)。相反，A盒和B盒以及AB二结构域没有显著的趋化活性。线条代表一式两份进行的三次实验的平均值±SD。(D)使用抗RAGE抗体对总D16细胞提取物进行的Western印迹。
图10 HMGB1诱导中胚层成血管细胞通过内皮单层转运。(A)在盖玻片上生长到汇合的牛初级内皮细胞(BAEC)暴露于HMGB1或VEGF，用FITC-标记的鬼笔环肽染色，显示肌动蛋白纤维。这两种处理都决定应力纤维的形成，和细胞的彼此分离。(B)将胚胎中胚层成血管细胞置于Boyden装置的上层区室中；下层区室含有单独的RPMI(培养基)、RPMI+100ng/ml HMGB1或RPMI+10ng/ml VEGF；这些区室被聚碳酸酯滤膜上生长的汇合的内皮细胞单层分开。HMGB1显著刺激D16移行(p＜0.01)。线条代表一式两份进行的三次实验的平均值±SD。条图之上的图显示在向单独的培养基或RPMI+HMGB1迁移后，姬姆萨染色的D16细胞。
图11 HMGB1在体内吸引中胚层成血管细胞。D16细胞首先用编码核LacZ的一种慢病毒载体转导，然后通过小鼠的股动脉注射，该小鼠已经在胫骨前肌中注射了肝素珠(荷载HMGB1或者未荷载)。然后在24小时后杀死小鼠。(A)注射荷载HMGB1的和对照珠的胫骨前肌。(B，C，D)用对照肝素珠(B)或HMGB1包被的肝素珠(C，D)处理的肌肉的冷冻切片(Criosection)。箭头所指为珠。切片用X-gal染色，中胚层成血管细胞(箭头)显蓝色。在注射HMGB1包被珠的肌肉中只发现为大的聚簇(C)或分离细胞(D)的中胚层成血管细胞。
图12 HMGB1对成年中胚层成血管细胞的影响。(A)从小鼠骨髓中获得的G1克隆的中胚层成血管细胞在含有1、10或30ng/ml HMGB1的RPMI培养基中生长。为了比较，G1细胞也在单独的RPMI培养基中或者在RPMI+20％FCS中生长。(B)G1细胞向含有RPMI(培养基)或RPMI+10ng/ml HMGB1(HMGB1)的Boyden装置的下层室中迁移。在“迁移”实验中，这些室用一张滤膜隔开，在“移行”实验中，这些室用一张覆盖内皮细胞单层的滤膜隔开。每个线条代表三次实验的平均值±SD，结果在统计学上显著(p＜0.05)。(C)G1细胞用DiI标记，然后通过小鼠的股动脉注射，该小鼠已经在胫骨前肌中注射了肝素珠(荷载HMGB1或者不荷载)。上图，相差；下图，荧光。G1细胞(红色荧光)在荷载HMGB1的细胞附近迁移；在对照珠附近未检测到G1细胞。
图13 HMGB1在体内诱导新心肌细胞的形成(A)GST和HMGB-1处理的心脏中梗死区的苏木精和伊红染色。在注射HMGB1的心脏中观察到组织结构显著变化。(B)KI67免疫染色(绿色荧光)显示在注射HMGB1的心脏中有大量阳性细胞。(C)α-肌节肌动蛋白免疫染色(红色荧光)。蓝色荧光，核的烟酸己可碱(hoechst)标记。在HMGB1处理的心脏中检测到表达α-肌节肌动蛋白的细胞。(D)MEF-2的免疫染色(绿色亮荧光)。
图14 HMGB1处理提高心肌功能超声心动图研究。对照(未梗死的)和梗死小鼠(左图)的典型超声心动图。射血分数(EF)根据超声心动图计算(右图)。结果是平均值±标准差(SD)。HMGB1对GST，*P＜0.05。
图15 HMGB1处理提高心肌功能血液动力学研究。心肌梗死(MI)对左心室舒张压(LVDP)、左心室舒张末期压(LVEDP)、LV+dP/dt(压力升高率)和LV-dP/dt(压力下降率)的影响。结果来自假手术(假)的小鼠和未处理以及用GST或HMGB-1处理的梗死小鼠。结果是平均值±标准差(SD)。星号表示在Student′s t检验中具有统计学显著性(p＜0.05)。
实施例1材料与方法命名高迁移组蛋白最近已经更名。HMGB1以前的/备选的名称是高迁移1组、HMG1、HMG-1、amphoterin和p30。
HMGB1蛋白和片段的克隆、表达和纯化质粒HMGB1及其片段已经描述(Müller等人，Biochemistry，40，10254-10261，2001)。蛋白质浓度利用Gill和yon Hippel(Analyt.Biochem.，182，319-326，1989)的方法光谱测定。天然蛋白质使用下列消光系数A盒A280＝9.98103M-2cm-1，B盒A280＝1.15104M-1cm-1，AB、ABbt和全长HMGB1A280＝2.14104M-1cm-1。
构建体和细胞质粒pEGFP-HMGB1如下产生利用EcoRI和SacII限制酶切位点，将大鼠HMGB1的cDNA的编码序列插入pEGFP-N1(Clontech)内。pEGFP-H1c、pEGFP-NF1、pEGFP-HMGN2和pEF-flag-mICAD由A.Gunjan，N.Bhattacharyya，R.Hock，M.Bustin和S.Nagata(Phair和Misteli，Nature，404，604-609，2000；Misteli等人，Nature408，877-881，2000；Enari等人，Nature391，43-50，1998)惠赠。HeLa细胞和成纤维细胞(VA1系，Hmgb1+/+，和C1系，Hmgb1-/-)如上所述生长(Calogero等人，Nature Genet.22，276-280，1999)。HeLa细胞用pEGFP-HMGB1电穿孔，18小时后观察。细胞群体中HMGB1-GFP的平均量为HMGB1的1-3％(用抗HMGB1抗体免疫印迹)。在单细胞水平上，不同细胞之间的HMGB1-GFP量最多有10倍不同；务必一直用中等荧光水平分析细胞。
通过用2ng/ml人TNF-α和35μM环己酰亚胺处理细胞16小时诱导凋亡。通过用5μM离子霉素和20μM CCCP，或6mM脱氧葡萄糖和10mM叠氮钠处理16小时，或者通过三个冻融循环，诱导坏死。
用pEF-flag-mICAD稳定转染的三种不同的HeLa细胞克隆用TUNEL(凋亡检测系统，Promega)染色，提取它们的染色体DNA，在1.5％琼脂糖凝胶上电泳。
间接免疫荧光如述进行(Degryse等人，J.Cell Biol.152，1197-2006，2001)，其中使用1∶1600稀释的抗HMGB1多克隆抗体(Pharmingen)，和1∶300稀释的FITC-或TRIC-偶联的抗兔抗体(Boehringer)。
体内显微镜检查和FLIP将细胞平板接种于LabTek II室(Nalgene)中，用Axiovert 135M显微镜(Zeiss)观察。用Leica TCS-SP共聚焦显微镜进行FLIP实验，其中如述(Phair和Misteli，Nature，404，604-609，2000)使用Ar激光的488nm的激发光线，在500-575nm下检测。漂白细胞(半径1μm的斑点，20mW额定输出功率，200-500ms)，以6秒的间隔成像(0.2mW额定输出功率)。
重组HMGB1与染色质的结合Hmgb1-/-成纤维细胞用2ng/ml hTNF-α和35μM环己酰亚胺处理。16小时后轻轻冲洗平皿，回收凋亡细胞。将1千万个凋亡Hmgb1-/-成纤维细胞和对照非凋亡细胞群体重悬浮于50μl PBS中，其中含有0.32M蔗糖、0.5％NP-40和1μM细菌产生的HMGB1，后者用Cy5(Pharmacia)荧光标记或者不标记。平均标记是每个HMGB1分子2.3个Cy5分子。在室温下30分钟后，混合样品细胞，使用含有1.5μg/ml DAPI的Vectashield(Vector Laboratories)将其固定于载玻片上，用配有TRITC滤光片的Axiophot显微镜(Carl Zeiss)观察。与未标记的HMGB1温育的两组细胞在不连续梯度(溶于PBS的5ml 1.16M蔗糖以及溶于PBS的6ml 2M蔗糖垫形成)上分层，使用SW27 Beckman转头以30,000g离心90分钟。从试管底部回收不含膜碎片的凋亡和非凋亡染色质，加到12％SDS-PA凝胶上。使用1∶3000稀释的一种抗HMGB1抗体(Pharmingen)，通过免疫印迹法测定与凋亡和非凋亡染色质结合的重组HMGB1的量。凋亡和非凋亡染色质等份也用抗乙酰组蛋白H4(R10，B.Turner惠赠)、抗乙酰组蛋白H3(Lys9，Biolabs)和抗乙酰赖氨酸抗体(Biolabs)探查。
炎症测定。为了测定TNF-α的体外产生，从雌性C56B16小鼠的后腿收集骨髓，在Optimem中稀释为5×106细胞/ml，分配到96孔微量滴定板中(每孔120μl)。向孔中加入坏死细胞(通过3个冻融循环裂解)或凋亡细胞至指定终浓度，37℃温育18小时。上清液中的TNF-α通过ELISA测定(Quantikine M，R&D Systems)。在指明时，与TNF-α一起加入200ng/ml TSA，在凋亡细胞与骨髓细胞混合之前洗去。
为了测定体内炎症，一天大的小鼠(体重1.1±0.1克)腹膜内注射20μl PBS，其中含有320μg扑热息痛(Sigma)，指明时含有320μg抗体(Pharmingen BD)。9小时后用GP-转氨酶试剂盒(Sigma)分析小鼠的血清ALT活性，并且如述分析肝脏提取物中的MPO活性(Kato等人，Am.J.Pathol.157297-302，2000)。用非参数Mann-Whitney检验对MPO/ALT比进行统计学分析。对配对的小鼠的MPO水平进行t检验，获得类似的结果，以最小化ALT水平的差异。
结果HMGB1与分裂间期和有丝分裂细胞的染色质松散结合，当透化或坏死细胞中的膜完整性遭到破坏后快速释放到培养基中(Degryse等人，J.Cell Biol.1521197-2006，2001；Müller等人，EMBO J.，16，4337-4340，2001；Falciola等人，J.Cell Biol.137，19-26，1997)。这些结果提示，在活细胞中，HMGB1与染色质快速结合及解离。为了证明这一点，HMGB1在其C端用GFP标记，形成一种嵌合蛋白，它在转染测定中提高HOXD9-反应性报道基因的表达方面与未干扰的HMGB1相当(Zappavigna等人，EMBO J.，15，4981-4991，1996)。根据核的均匀绿色荧光可以容易地检测表达该融合蛋白的HeLa细胞。经历有丝分裂的细胞显示弥散的细胞质荧光，以及HMGB1-GFP与凝聚染色体的不同结合，这持续整个M期(图1a)。当HMGB1-GFP转染的HeLa细胞用NP-40透化时，大多数在数秒钟后失去荧光，证实HMGB1与染色质松散结合。然而，少数细胞保持亮荧光。根据它们的核特有的断裂表现，这些细胞表现凋亡。然后用TNF-α和环己酰亚胺处理使HeLa细胞经历凋亡，透化，对未修饰的内源HMGB1免疫染色。而对照非凋亡细胞将所有HMGB1释放到培养基中(图1b，d)，该蛋白质保持在凋亡细胞的核内(图1d)。当可溶性细胞质蛋白，如乳酸脱氢酶(LDH)，释放到细胞外培养基内时，HMGB1大部分与核残留物结合，甚至在延长温育和凋亡细胞部分自溶后仍然如此(图1e)。在通过表鬼臼毒吡喃葡糖苷或H2O2处理诱导凋亡，或者在未干扰的培养物中自发凋亡的HeLa和3T3细胞中，HMGB1和HMGB1-GFP也与染色质紧密结合(数据未显示)。相反，HMGB1与坏死细胞的染色质解离，释放到细胞外培养基中(图1c)。
为了定量单细胞内HMGB1-GFP的动力学特性，使用一种被称为光漂白中的荧光损失(FLIP)的技术(Phair和Misteli，Nature，404，604-609，2000)。同一区域的重复漂白导致核的其余部分荧光损失，其动力学取决于荧光蛋白的总迁移率。如果蛋白质组的一种级分在指定的任何时间与染色质结合，荧光的损失将减缓。快速获得总核HMGB1-GFP的漂白(图2a)；相反，在表达GFP与染色质蛋白HMGN1和HMGN2或转录因子NF1的融合蛋白的HeLa细胞中，荧光损失显著降低，在表达GFP-组蛋白H1c融合蛋白的细胞中，荧光损失非常有限(图2c)。
作者也评价了在有丝分裂期间与活HeLa细胞的凝聚染色体结合的HMGB1-GFP的扩散率。细胞质HMGB1-GFP的重复漂白导致凝聚染色体和细胞质快速、平行地损失荧光(图2b，d)，这清楚地证明HMGB1在染色质结合的状态与可溶性状态之间快速转换。
到另一个极端，HMGB1-GFP几乎固定在凋亡细胞中(图2e，g)。HMGB1的阻断是特异的，因为与活细胞不同，在凋亡细胞中GFP-HMGN1、GFP-HMGN2、GFP-NF1和单独的GFP的迁移率不降低(图2h，结果未显示)。因此，凋亡过程中的染色质凝聚通常不影响蛋白质的迁移率。
Hmgb1-/-细胞为我们提供了机会，用来检验HMGB1与凋亡染色质的结合是否是由于HMGB1或经历凋亡的核的改变。从Hmgb1-/-和Hmgb1+/+小鼠获得的胚胎成纤维细胞(Calogero等人，Nature Genet.，22，276-280，1999)对凋亡同样敏感(未显示)，表明染色质上HMGB1的冷冻是凋亡的结果，而不是必要条件。Hmgb1-/-成纤维细胞用TNF-α和环己酰亚胺处理，通过轻轻冲洗从摇瓶中回收凋亡细胞。该细胞群体，和对照非凋亡Hmgb1-/-成纤维细胞群体，用去污剂透化，并暴露于细菌产生的Cy5标记的HMGB1。HMGB1与凋亡的核结合，而不与未凋亡的核结合(图3a)。该结果在生物化学上得到证实(图3b)透化的凋亡和非凋亡Hmgb1-/-成纤维细胞与细菌产生的HMGB1一起温育，通过不连续蔗糖梯度分级分离。另外，HMGB1也与来自凋亡细胞的核结合，而不与来自非凋亡细胞的核结合。上述实验表明，一旦凋亡，染色质经历某些化学或结构转变，使之对HMGB1结合敏感。HMGB1本身的性质，是内源的还是细菌产生的，用荧光团标记还是与GFP融合，均无关。
作者随后研究了可使HMGB1稳定结合的染色质修饰的性质。由于HMGB1与体外重建的单核小体紧密结合(Falciola等人，J.Cell Biol.，137，19-26，1997)，作者检验了在凋亡后期发生的染色质断裂为寡核小体和单核小体是否提供稳定的HMGB1结合位点。HeLa细胞用一种表达ICAD的构建体稳定转染，ICAD是凋亡期间断裂DNA的CAD核酸酶的抑制剂。过量表达ICAD的HeLa细胞经历凋亡，但是它们的DNA即使有断裂也显著极少凋亡(Enari等人，Nature，391，43-50，1998)(图3c)。HMGB1与表达ICAD的未断裂染色质以及与断裂的染色质同样稳定地结合(图3c)。因此DNA断裂不能说明凋亡中稳定的HMGB1结合。
然后检测了染色质乙酰化状态的改变。在诱导凋亡之前立即向HeLa细胞的培养基中加入TSA，一种常用脱乙酰酶抑制剂在此情况下，HMGB1向染色质上的冷冻遭到抑制(图2f，g)。该结果提示，在凋亡期间发生一种或多种染色质成分的低乙酰化，有利于HMGB1的结合。凋亡和非凋亡细胞中存在的HMGB1的pI或分子量模式未见差异(图3d)，表明凋亡不改变HMGB1本身的乙酰化状态。相反，与非凋亡的染色质相比，来自凋亡染色质的组蛋白H4明显低乙酰化，而凋亡中的H4低乙酰化被TSA抑制(图3e)。
作者因此证明，HMGB1与染色质的结合取决于细胞的生存力，并且明确地区分开坏死细胞与凋亡细胞。可以利用HMGB1的不同释放作为邻近细胞激活对非编程和编程细胞死亡的适当应答的信号。非编程死亡通常是创伤、中毒或感染的结果，所有事件都需要快速反应和涉及损伤和/或修复。炎症是哺乳动物中的主要组织损伤应答，已经报告HMGB1是炎症的一种介质(Wang等人，Science，285，248-251，1999；Abraham等人J.Immunol.，165，2950-2954，2000；Andersson等人，J.Exp.Med.192，565-570，2000)。为了直接检验坏死细胞释放HMGB1是否能够直接触发炎症应答，作者用Hmgb1-/-或野生型(+/+)死亡成纤维细胞攻击野生型骨髓细胞。如预期的，野生型坏死细胞触发促炎细胞因子TNF-α的产生，而野生型凋亡细胞有效性更低(图4a)。值得注意的是，Hmgb1-/-坏死细胞在激活单核细胞方面也无效。在该测定中，纯化的HMGB1也引发TNF-α的产生(Andersson等人，J.Exp.Med.192，565-570，2000)。因此，该实验表明，HMGB1是坏死的主要扩散信号之一。另一方面，不能检测凋亡细胞是否因为保留了HMGB1而逃脱炎症监视凋亡细胞只在数小时后开始释放细胞成分，在体内，它们通常在可能发生该过程(被称为二次坏死)之前被吞噬细胞很好地清除。但是作者能够检测经历凋亡后二次坏死的细胞是否能够促进单核细胞的炎症应答。野生型凋亡成纤维细胞温育72小时，直到大多数LDH释放到细胞外培养基中；凋亡后的细胞残留物不会促进单核细胞的强免疫应答(图4b)。然而，用TSA处理而经历凋亡的成纤维细胞产生二次坏死的细胞残留物，它们与冻融杀死的初级坏死细胞一样强烈地促进炎症。
作者无法检测Hmgb1-/-小鼠在组织坏死后炎症应答是否降低，因为这些小鼠在出生后只存活数小时(Calogero等人，Nature Genet.，22，276-280，1999)。为了在动物模型上提供HMGB1释放的显著性的证据，在野生型小鼠中诱导大量肝细胞坏死，并且测定炎症应答。在人和啮齿类动物中，超剂量的镇痛药扑热息痛(AAP，也被称为对乙酰氨基酚)产生大面积肝坏死，伴局部炎症、枯否细胞激活和嗜中性粒细胞和巨噬细胞向损伤组织中的募集和汇集(Lawson等人，Toxicol Sci.，54，509-516，2000；Thomas，Pharmacol.Ther.，60，91-120，1993)。肝损伤和嗜中性粒细胞汇集水平严格成比例，直到在AAP中毒后12-24小时，大多数肝细胞坏死(Lawson等人，Toxicol Sci.，54，509-516，2000)。作者通过一次腹膜内流向对年轻小鼠施用了300mg/kg AAP，9小时后通过测定血清中的丙氨酸转氨酶(ALT)活性，估计肝损伤，并且通过测定总肝提取物中的髓过氧化物酶(MPO)活性，估计炎症细胞汇集。一组小鼠(n＝8)不接受AAP，一组(n＝10)只接受AAP，另一组(n＝6)接受AAP和亲和纯化的抗-HMGB1抗体(300mg/kg)，以最后一组(n＝8)接受AAP和无关兔抗体(300mg/kg)。与假处理的对照相比，注射AAP的所有3组ALT水平均升高，但是3个处理组之间的差异在统计学上不显著。因此，抗体不能针对肝损伤进行保护，至少在炎症应答开始时如此。作者然后使用MPO/ALT比比较炎症细胞募集，对肝损伤水平标准化(图4c)。抗HMGB1抗体在减少AAP诱导肝坏死后的炎症方面有效与只注射AAP的小鼠相比(2.7+0.3；p＜0.05)，以及与注射AAP和免疫前兔IgG的小鼠相比(2.4±0.3；p＜0.05)，这些小鼠都显示MPO/ALT比显著降低(1.5±0.3)。在我们的实验中，激活的单核细胞和巨噬细胞都不能产生HMGB1，因为炎症细胞分泌HMGB1至少需要16小时(Wang等人，Science，285，248-251，1999；Abraham等人，J.Immunol.，165，2950-2954，2000；Andersson等人，J.Exp.Med.192，565-570，2000)。因此，HMGB1作为炎症的一种直接触发剂，以及炎症的一种晚期介质，如前所述(Wang等人，Science，285，248-251，1999)。
总之，作者证明，被动释放一种富含的染色质成分能够作为非编程死亡的一种扩散信号，它能够作为给邻近细胞的信号。核心组蛋白尽管更富含，但是可能不是坏死的良好信号，因为它们保持与坏死细胞的不可溶染色质锚定。凋亡细胞不是存在的直接危险的结果，在生理条件下不触发炎症。它们保留核成分，直到被巨噬细胞或作为半专业吞噬细胞的邻近细胞清除，它们通过显示“吞噬我”信号吸引并激活(Ren和Savill，Cell Death Different.，5，563-568，1998)。然而，逃脱快速清除的凋亡细胞经历二次坏死，致使核自身抗体水平升高(Scott等人，Nature，211，201-211，2001)，已经提出它们在自身免疫病(如狼疮)中起重要的致病作用(Herrmann等人，ArthritisReum.，41，1241-1250，1998)。因此，经历二次坏死的凋亡细胞保留HMGB1另外确保不会混淆坏死细胞与凋亡细胞。
实施例2作者也证明HMGB1对来源于胎主动脉细胞的D18小鼠中胚层成血管细胞具有趋化活性(Minasi等人，Development，129，2773-83，2002)。中胚层成血管细胞干细胞可能来源于小鼠胎主动脉细胞，也可能来源于出生后小鼠的脐带细胞、外周血管和骨髓ckit+细胞。一旦利用一种专利方法(Minasi等人，Development，129，2773-83，2002描述)由这些原始细胞群体产生，中胚层成血管细胞细胞即“自然”无限增殖化(它们无限生长)，D18是它的一个例子。D18细胞作为下列中胚层组织类型的前体骨、软骨、骨骼平滑肌和心肌、内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞和成骨细胞。它们也能够产生肝细胞和神经元。克隆D18根据布达佩斯条约保藏于CBA，Centro BiotecnologieAvanzate，Genova，意大利，N.P D02005)。使用改良Boyden室进行趋化性测定。数值1对应于在不含任何刺激剂的情况下迁移(随机细胞迁移)的细胞数量。
数据代表平均值±SE。在ANOVA模型中，结果的统计学显著性是P＜0.0001。用HMGB1+抗HMGB1处理产生与未刺激的对照在统计学上没有不同的结果。用单独的抗HMGB1抗体或一种非特异性抗体处理D18细胞也无法与未刺激的对照相区别。
预期干细胞在肯定发生组织修复的部位增殖。作者然后检测了HMGB1是否也能够刺激干细胞增殖。不含血清的RPMI中的干细胞不分裂，而不含血清但是存在HMGB1的RPMI中的细胞活跃分裂至少24小时，然后由于养分耗尽较缓慢地分裂。但是在第3天，通过显微镜检查估计，含有用HMGB1(所有浓度)刺激的D18细胞的所有平板都含有一些分裂的细胞。
单独RPMI中的细胞不分裂，而RPMI+HMGB1中的细胞活跃分裂至少24小时，然后由于养分耗尽较缓慢地分裂。但是在第3天，通过显微镜检查估计，含有用HMGB1(所有浓度)刺激的D18细胞的所有平板都含有一些分裂的细胞(图6)。
该实验已经用来源于成年小鼠毛细血管的中胚层成血管细胞(来自成年小鼠的干细胞)重复，显示相同的增殖诱导作用。
以上所述的所有实验也用另外一种干细胞克隆(被称为D16)重复，获得类似的结果，如以下实施例3所述。
实施例3细胞外HMGB1，一种组织损伤信号，诱导中胚层成血管细胞迁移和增殖材料与方法细胞牛主动脉内皮细胞(BAEC)如(Palumbo等人，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.，22，405-11，2002)所述从新屠宰的牛的胸主动脉切片中分离。中胚层成血管细胞如前所述(De Angelis等人，J.Cell Biol.147，869-78，1999)从小鼠胚胎的背主动脉和幼稚动脉中分离。克隆后，细胞在丝裂霉素C处理的STO成纤维细胞的饲养层上扩增。体外和体内实验使用显示中胚层成血管细胞基因表达模式的克隆(存在CD34、Kit、Flk1和MEF2D)。胚胎中胚层成血管细胞(克隆D16)用一种编码核LacZ的慢病毒载体转导，而成熟中胚层成血管细胞(克隆G1)用DiI标记，然后注射到小鼠的股动脉内。
HMGB1和抗体全长HMGB1蛋白及其片段的表达与纯化如前所述进行(Müller等人，Biochemistry，40，10254-10261，2001)。通过Detoxy-Gel柱(Pierce)除去内毒素。
针对肽166-181的兔多克隆抗HMGB1抗体来自于Pharmingen BD，抗A盒的多克隆抗体来自于MBL。抗RAGE山羊抗体来自于Chemikon。如(Degryse等人，J.Cell Biol.152，1197-2006，2001)所述进行Western印迹。
增殖测定将细胞接种于6孔板中(1×105细胞/孔)，在补充20％FCS的RPMI中生长。24小时后，将培养基替换为不含血清的RPMI，16小时。随后用单独的培养基或添加20％FCS或浓度为1、3、10、30ng/ml的HMGB1的培养基培养这些细胞。1、2、3天后计数细胞，利用台盼蓝染料排除法作为细胞生存力的指示。所有实验均一式两份进行三次。
趋化性测定细胞迁移用Boyden室测定(Degryse等人，J.Cell Biol.152，1197-2006，2001)。简言之，孔径为8μm的不含PVP的聚碳酸酯滤膜(Costar)用5μg/ml猪皮明胶(Sigma)包被。将无血清RPMI(阴性对照)、含有10、50或100ng/ml HMGB1的RPMI和含有20％血清的RPMI(阳性对照)置于下层室中。D16细胞在RPMI+10％FCS中生长，饥饿过夜，用PBS洗涤两次除去所有漂浮的细胞，用胰蛋白酶收获。将重悬浮于200μl RPMI中的5万个细胞置于上层室中，在37℃、5％CO2下温育16小时。机械除去保留在滤膜上表面的细胞，用乙醇固定已经迁移到下表面的细胞，用改良的姆萨染液(Sigma)染色，在400倍放大倍数下计数每个滤膜10个随机视野。一式三份进行测定，并且在独立的实验中重复三次。
移行测定BAEC细胞在聚碳酸酯transwell插件(3μm孔；Costar)上在DMEM+10％FCS中生长5天，直到它们形成单层。然后将该插件置于Boyden装置的室之间，通过测定室间BSA的扩散检查单层的紧密性。将中胚层成血管细胞(105个细胞，在100μl RPMI中)置于上层区室，将含有HMGB1或VEGF(在大肠杆菌中表达的人VEGF的成熟的121氨基酸变体，来自R&D Systems)的RPMI置于下层室中(500μl)。37℃8小时后，取出滤膜，如趋化性测定所述评价结果。这些实验以一式两份进行三次。
流式细胞分析饥饿过夜的中胚层成血管细胞在单独的RPMI培养基、RPMI+20％FCS或RPMI+100ng/ml HMGB1中生长6、12、24或48小时。洗涤细胞，在70％乙醇中固定，用溶于PBS+50μg/ml RNase A的50μg/ml碘化丙锭(PI)染色，在室温下温育30分钟。使用标准CellQuest软件，通过流式细胞分析(FACScan；Becton-Dickinson)测定DNA含量。
细胞分裂数量的估计将1千万个胚胎或成年中胚层成血管细胞接种于100mm平皿中的补充20％FCS的RPMI中。24小时后细胞在单独的RPMI中饥饿过夜。然后用PBS洗涤细胞，加入CFDASE(Molecular Probes)至终浓度为2.5μM，在室温下8分钟。加入10％FCS猝灭染色，并用RPMI洗涤细胞。荧光标记的细胞然后在单独的RPMI、RPMI+100ng/ml HMGB1或RPMI+20％FCS中生长，在48小时后收集。然后用FACScan分析细胞。
细胞骨架显示BAEC细胞在盖玻片上生长，直到完全汇合。如本文所述处理后，用PBS洗涤细胞，用4％低聚甲醛在室温下固定10分钟。然后如述(Degryse等人，J.Cell Biol.，152，1197-2006，2001)用FITC偶联的鬼笔环肽(Sigma)染色细胞，显示肌动蛋白细胞骨架。
荷载HMGB1的珠的制备从HiTrap Heparin HP柱(Pharmacia)上回收肝素珠(直径34μm)，并用PBS充分洗涤。珠(20μl堆积体积)然后与60μg HMGB1在4℃下温育1小时，离心收集，用PBS洗涤两次，重悬浮于PBS中。进行SDS-PAGE，检查珠上HMGB1的量。
小鼠中胚层成血管细胞的动脉内输送荷载或未荷载HMGB1的肝素珠(在20μl PBS中含有3μg珠的浆液)用胰岛素注射器注射到6周龄雌性CD-1小鼠(每组3只)的胫骨前肌中。1小时后，如前所述(Torrente等人，J.Cell Biol.，152，335-48，2001)，通过股动脉注射中胚层成血管细胞(4×105细胞/动物)；24小时后杀死动物。为进行组织化学分析，将胫骨前肌标本冷冻于液氮冷却的异戊烷中，并且恒冷切片。对于使用LacZ标记的细胞的实验，10μm厚的系列肌肉切片用X-gal染色(Totsugawa等人，CellTransplant.，11，481-8，2002)，或者对于使用DiI的实验，直接显示。DiI来自Molecular Probes。
结果HMGB1刺激血管结合的胚胎干细胞的增殖从小鼠E9.5胚胎背主动脉中分离的干细胞(中胚层成血管细胞)在体外培养，检测CD34、Kit、Flk1和MEF2D细胞标记物的存在(Minasi等人，Development，129，2773-2783，2002)。作者使用这些克隆之一(被称为D16)估计HMGB1是否能够作为一种促分裂原。
将D16细胞接种于含有20％FCS的RPMI培养基中，然后在不含血清的情况下饥饿16小时，使细胞群体同步。然后向不含血清的培养基中加入浓度逐渐升高的HMGB1，在1、2、3天后计数细胞。图7A显示用HMGB1刺激达2天后，D16中胚层成血管细胞的数量显著增加，而在第2天与第3天之间只发生轻微的增殖。检测的所有浓度具有类似的作用。HMGB1刺激的D16细胞具有正常的形态学，排除台盼蓝直到实验结束时，而不含HMGB1的对照培养物中的细胞死亡(未显示)。HMGB1对3T3成纤维细胞没有促有丝分裂作用(图7C)。
作者更详细地研究了D16细胞对HMGB1的增殖应答细胞暴露于单独的RPMI培养基(阴性对照)或含有30ng/ml HMGB1或20％FCS的培养基6、12、24小时，在碘化丙锭染色后通过FACS分析DNA含量。用HMGB1刺激6小时后，大多数中胚层成血管细胞进入细胞周期；24小时后，大多数细胞显示含有二倍体DNA内容物，因此处于G1或G0期(图7B)。作者通过在时间0时用荧光染料CFDASE染色细胞膜(Colombetti等人，J.Immunol.，169，6178-86，2002)6，评价了HMGB1诱导的细胞周期数量；48小时后大多数细胞含有染料初始量的一半(因此经历一次分裂)，少数细胞含有四分之一(经历两次分裂)。通过比较，在20％FCS中培养的所有细胞都至少分裂两次(数据未显示)。
这些数据表明，HMGB1诱导数量有限的细胞分裂。这可能是由于中胚层成血管细胞的一种具体程序，或者是由于培养基中HMGB1的消耗。因此作者在时间0时加入30ng/ml HMGB1，在12、36、60小时时另外加入HMGB1。持续暴露于HMGB1的中胚层成血管细胞不断分裂(图8)。48小时后，通过Western印迹在刺激一次的细胞的培养基中检测不到HMGB1，而在多次暴露的细胞的培养基中保留相当于约40ng/ml的HMGB1(参见插8)。总之，这些结果表明HMGB1作为D16细胞的一种生长因子，但是被快速消耗。
HMGB1诱导中胚层成血管细胞迁移作者以前证实，HMGB1是大鼠平滑肌细胞(RSMC)的一种化学引诱物(Degryse等人，J.Cell Biol.，152，1197-2006，2001)。他们随后研究了HMGB1是否也是D16细胞的一种化学引诱物。在使用改良Boyden室的趋化性测定中，HMGB1以浓度依赖的方式刺激D16细胞的迁移(图9A)。针对HMGB1的氨基酸166-181的多克隆抗体(抗166-181，图7A)显著降低迁移应答。然而，迁移应答不受识别A盒的抗HMGB1单克隆抗体影响。
作者也检测了HMGB1各个结构域诱导D16细胞迁移的能力(图9B)。单独的A盒和B盒都不能诱导明显的迁移。二结构域片段(含有A盒和B盒)具有不明显的作用，而只缺乏酸性尾的ABbt片段(图9C)与全长蛋白质一样有效。
Huttunen等人(Cancer Res.，62，4805-4811，2002)已经确定残基150-183是可与RAGE相互作用的HMGB1片段。值得注意的是，阻断D16迁移的抗HMGB1抗体(图9A)与残基166-181之间的氨基酸片段特异性相互作用(图9C)，因此占据与RAGE相互作用的表面。识别A盒的单克隆抗体不能阻止与RAGE的相互作用。因此我们的数据表明HMGB1是D16细胞的一种有力的化学引诱物，并且提示RAGE是其受体。D16细胞的RNA谱(未显示)表明，它们表达RAGE，通过Western印迹在D16细胞中可以检测到RAGE蛋白(图9D)。
HMGB1诱导中胚层成血管细胞通过内皮单层迁移中胚层成血管细胞是血管结合的干细胞，能够通过全身循环迁移到损伤组织中(sampaolesi等人，未发表的数据)，具有通过内皮屏障转运的能力。作者然后检测了HMGB1是否也能够促进干细胞通过在Boyden装置的室间隔膜上生长的内皮单层移行。当作者向下层室的培养基中加入100ng/ml HMGB1时，与没有任何添加的培养基相比，通过单层的D16细胞的数量提高8倍(图10B)。HMGB1比血管内皮生长因子(VEGF)有更高的效能，VEGF是已知促进细胞通过内皮屏障迁移的一种信号分子。VEGF诱导内皮细胞的重大细胞骨架重构，其特征在于跨细胞质应力纤维的形成和粘附连接的分解，这对于保持内皮屏障功能至关重要(Rousseau等人，J.Biol.Chem.，275，10661-72，2000；Esser等人，J.Cell Sci.，111，1853-65，1998)。因此，作者比较了HMGB1与VEGF对内皮细胞的作用。
用HMGB1刺激5-30分钟后，固定内皮细胞，用荧光素偶联的鬼笔环肽标记，通过免疫荧光检测。HMGB1和VEGF都导致应力纤维形成和内皮细胞的解聚，提示HMGB1能够显著提高血管内皮里层的通透性(图10A)。
HMGB1引导中胚层成血管细胞的体内归巢作者最后评价了HMGB1控制中胚层成血管细胞体内迁移的能力。肝素珠荷载浓度为3μg/ml的HMGB1，然后用一个细针头注射到小鼠的胫骨前肌内。30分钟后通过近端股动脉注射用一种导致核LacZ表达的慢病毒载体转导的D16细胞(参见材料与方法)。24小时后杀死小鼠，取出胫骨前肌，切片，通过免疫组化分析。与假注射的肌肉(数据未显示)和注射未荷载的肝素珠(图11A)相比，注射荷载HMGB1的珠的肌肉显示相当的膨胀，提示HMGB1引起相当严重的肌肉炎症。这与HMGB1作为促炎细胞因子的作用一致。
肌肉切片用X-gal染色，用计算机辅助成像技术对蓝色细胞评分(图11)。在荷载HMGB1的珠附近发现大组蓝色细胞(图C)；少数切片显示散布于整个肌肉中的蓝色细胞(图D)。注射未荷载的珠的肌肉切片根本没有蓝色细胞(图B)。
这些发现清楚地提示，HMGB1能够在体内募集中胚层成血管细胞。
HMGB1对成年中胚层成血管细胞的生物学作用这些发现确定了细胞外HMGB1——一种促炎细胞因子对胚胎中胚层成血管细胞迁移和增殖的作用。然而，甚至在组织损伤情况下，胚胎中也没有炎症。作者然后检测了HMGB1对成年中胚层成血管细胞是否也有作用。
作者对从骨髓中分离的成年中胚层成血管细胞(G1克隆，参见材料与方法)重复了上述实验。图12总结了我们的发现。HMGB1导致干细胞增殖(图A)、趋化性和移行(图B)。最后，象胚胎中胚层成血管细胞一样，HMGB1能够将成年中胚层成血管细胞募集到胫骨前肌内(图12C)。
在使用来自8周龄小鼠主动脉的不同成年中胚层成血管细胞的其它实验中也观察到类似的作用(数据未显示)。
实施例4材料与方法免疫组化分析距梗死1周时使心脏停止在心舒张期，向后灌注10％(vol/vol)甲醛，包埋于石蜡中，以4μm切片。切片用苏木精和伊红染色(H&E)进行组织学检查，或者处理进行免疫组化分析，以鉴定新形成的心细胞。利用下列抗体评价心脏分化兔多克隆间隙连接蛋白43抗体(Sigma St.Louis，MO，USA)，小鼠单克隆抗α-肌节肌动蛋白(克隆5C5；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA)，兔多克隆抗MEF-2(C-21；Santa Cruz)。使用小鼠单克隆抗体Ki67(克隆MIB5，Novocastra Laboratories，UK)检测Ki67。FITC偶联的山羊抗兔抗体和TRITC偶联的山羊抗小鼠抗体(Sigma)作为第二抗体。
心肌功能的评价使用装备13-MHz线性传感器的Sequoia 256c仪器在清醒的小鼠中进行超声心动图显象。由胸骨旁短轴切面在乳头肌水平上记录二维图像和M模式示踪。根据M模式示踪，获得心舒期和心缩期的解剖学参数(Orlic等人，Nature，98，10344-10349，2001)。对于血液动力学研究，小鼠用水合氯醛麻醉(400mg/kg体重)，右侧颈动脉插入一个microtip压力传感器(Millar 1.4F)，测量左心室压(LV，LV+和-dP/dt)。
结果HMGB1促进梗死心脏中新肌细胞的形成通过在麻醉下结扎左冠状动脉(Li等人，J.Clin.Invest.，100，1991-1999，1997)，在C57BL/6小鼠中诱发心肌梗死。4小时后对动物再次手术，在左心室的梗死周围区施用200ng纯化的HMGB1。对照动物包括注射200ng无关蛋白质(GST)的梗死小鼠。
向梗死周围左心室注射HMGB1导致形成一种致密组织，其特征在于排列的细胞占据了大多数损伤区，如苏木精-伊红染色所示(图13A)。新形成的组织从更加紧密且组织的边缘区延伸到损伤区的内部。当类似实验使用一种对照蛋白质(GST)时，观察不到由排列细胞组成的新组织。
为了表征新形成的组织，作者探查了α-肌节肌动蛋白的表达，该蛋白质是心脏分化的一个特异性标记。免疫组化分析显示，注射HMGB1的心脏(n＝8)中的组织由α-肌节肌动蛋白阳性细胞组成(图13C)。而且，某些细胞表达间隙连接蛋白43，后者是心肌细胞之间间隙连接的一种成分(未显示)。令人感兴趣的是，表达α-肌节肌动蛋白的细胞也是MEF2阳性的，MEF2是参与几种心脏结构基因的启动子激活的一种转录因子(图13D)。相反，在GST处理的心脏(n＝6)中只观察到浸润的细胞。作者也通过分析Ki67的表达，评价了HMGB1处理的心脏中细胞的生长阶段，Ki67是在G1、S、G2和有丝分裂早期存在的一种蛋白质。Ki67在某些新形成的细胞中表达，定位于梗死组织内(图13B)。这些数据证实，HMGB1促进梗死心脏中新肌细胞的形成。
HMGB1提高梗死后的心肌功能梗死一周后，作者研究了存活小鼠的超声心动图和血液动力学参数。与假手术的小鼠相比，用HMGB1处理或未处理的梗死动物显示心力衰竭的指标。然而，与梗死但未处理的小鼠相比，用HMGB1处理的小鼠显示心功效明显恢复。在HMGB1处理的小鼠中，射血分数(EF)比GST处理的小鼠高51％(图14)。在GST处理的小鼠中，LV舒张末期压(LVEDP)低39％，达到与假手术小鼠类似的水平(图15)。在HMGB1处理的小鼠中LV舒张压(LVDP)的改变和+和-dP/dT也提高，表明分别比对照提高34％、39％和45％。
因此，通过诱导心肌细胞形成，HMGB1提高梗死心脏的左心室功效。
权利要求
1.一种组合物，其含有有效量的HMGB1蛋白或其功能部分，或表达HMGB1的载体，用于治疗组织损伤和/或促进组织修复和再生。
2.根据权利要求1的组合物，其中组织再生取决于与损伤细胞相同类型的细胞的生长，不包括结缔组织。
3.根据权利要求2的组合物，其中所述组织是心肌或骨骼肌。
4.根据权利要求3的组合物，其中组织修复和/或再生包括坏死区的修复和/或再生。
5.根据权利要求4的组合物，其中坏死区包括创伤部位、包括梗死的心脏的缺血部位、烧伤部位。
6.根据上述任何权利要求的组合物，它还包含有效量的抗炎剂。
7.根据上述任何权利要求的组合物，它还包含稀释剂和/或佐剂，用于在组织修复部位灌注。
8.根据上述任何权利要求的组合物，它还包含稀释剂和/或佐剂和/或载体，用于肌肉内注射。
9.根据上述任何权利要求的组合物，它还与干细胞结合。
10.根据权利要求9的组合物，其中所述干细胞是中胚层成血管细胞。
11.一种组合物，其含有有效量的HMGB1蛋白的拮抗剂，用于治疗坏死组织诱导的不良反应，如附近存活细胞的激活，骨髓细胞的募集和激活，内皮屏障功能的丧失，水肿。
12.根据权利要求11的组合物，其中坏死组织是指肠梗阻、急性胰腺炎和大面积创伤。
13.根据权利要求12的组合物，其中坏死组织诱导的不良反应包括坏死的长期影响，如脓毒症和多器官衰竭。
14.根据权利要求11-13的组合物，其中HMGB1拮抗剂包括HMGB1抗体及其功能重组或合成部分、干扰RNA、反义RNA、合成或天然调节剂。
15.根据权利要求11-14的组合物，其中所述组合物在坏死事件16小时内施用。
16.促进干细胞在细胞培养中或在体内迁移和/或增殖的方法，包括使这些细胞暴露于有效量的HMGB1蛋白或其功能部分的步骤。
17.根据权利要求16的方法，其中所述干细胞是定居的心脏或循环干细胞。
18.促进心肌细胞在细胞培养中或在体内增殖的方法，包括使这些细胞暴露于有效量的HMGB1蛋白或其功能部分的步骤。
全文摘要
描述了一种组合物，其含有有效量的HMGB1蛋白或其功能部分，或表达HMGB1的载体，用于治疗组织损伤和/或促进组织修复和再生。进一步描述了一种组合物，其含有有效量的HMGB1蛋白的一种拮抗剂，用于治疗坏死组织诱导的不良反应，如骨髓细胞的募集和激活，内皮屏障功能的丧失，水肿。
文档编号A61K38/00GK1671742SQ03817879
公开日2005年9月21日 申请日期2003年4月29日 优先权日2002年7月3日
发明者M·E·比安基, R·帕伦博, M·科洛涅西卡波格罗西, F·利马纳, A·杰尔马尼 申请人:塔博尔山圣拉弗尔基金中心, 意大利教省圣母纯洁成胎之子－圣母玛, 利亚皮肤病学会－Irccs, 心脏病学中心蒙齐诺股份公司－Irccs