新的纤维二糖水解酶的制作方法

新的纤维二糖水解酶的制作方法
【专利摘要】提供了分离的纤维二糖水解酶，其包含修饰的糖苷水解酶（GH）家族7催化结构域、GH家族7催化结构域和修饰的家族1碳水化合物结合模块（CBM）、或修饰的家族7催化结构域和修饰的家族1CBM。这类分离的纤维二糖水解酶展示出与SEQ?ID?NO:1的1-436位氨基酸或SEQ?ID?NO:2的1-438位氨基酸45%-约99.9%的氨基酸序列同一性，并且对处理底物活性提高。还提供了用于表达所述分离的纤维二糖水解酶的遗传构建体和遗传修饰的微生物，产生所述分离的纤维二糖水解酶的方法，包含所述分离的纤维二糖水解酶的纤维素酶混合物以及用这类纤维素酶的酶混合物水解纤维质底物的方法。
【专利说明】新的纤维二糖水解酶
【技术领域】
[0001]本发明涉及分离的纤维二糖水解酶。更具体地，本发明涉及分离的糖基水解酶家族7的纤维二糖水解酶。本发明还涉及包含编码分离的纤维二糖水解酶的核苷酸序列的遗传构建体，用于从宿主菌株产生所述分离的纤维二糖水解酶的方法，以及所述分离的纤维二糖水解酶在纤维素水解中的用途。
【背景技术】
[0002]木质纤维素原料有希望替代玉米淀粉用于生产燃料乙醇。这些原材料可广泛获得、廉价，并且一些研究已经得出结论:纤维素乙醇产生接近于零的温室气体排放。
[0003]然而，这些原料不能被轻易降解成其复合糖分子。可以通过物理和/化学预处理来部分克服木质纤维素的难降解的问题。化学预处理的实例是在稀硫酸的存在下进行蒸汽爆破(美国专利N0.4，461，648)。该方法去除了大部分半纤维素，但是几乎没有纤维素转化成葡萄糖。然后，预处理的材料可以被纤维素酶水解。
[0004]术语纤维素酶广义上是指催化纤维素聚合物中连接个体葡萄糖单元的β_1，4糖苷键的水解的酶。纤维素酶属于更大的糖基水解酶(GH)组，所述糖基水解酶组由基于结构同源性的家族(family)或部族(clan)组织而成(Davies and Henrissat, 1995, Structure15:853;Carbohydrate Active Enzymes database, Cantarel et al.，2009，Nucleic AcidsRes.，37:D233)。超过100个GH酶家族的成员的更新数据库可见于URL:www.cazy.0rg/Glycoside-Hydrolases/html。GH包括催化其他寡糖和多糖的水解的酶(例如葡聚糖酶、木聚糖酶、甘露糖苷酶、半乳糖苷酶等)。
[0005]纤维素转化成葡萄糖涉及内切葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)、纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)和 β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)的协同作用(Henrissatet al, 1994;Knowles et al., 1987;Lynd et al.，2002;Teeri, 1997;Wood andGarcia-Campayo, 1990;Zhang and Lynd, 2004)。内切葡聚糖酶水解纤维素链中部的易接近的糖苷键，而纤维二糖水解酶从这些链的末端持续地释放纤维二糖。β -葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖，从而使纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶的产物抑制降到最低。
[0006] 虽然纤维素酶驱使纤维素水解成葡萄糖，但是已经发现了能够提高纤维素酶系统的效率的另外的酶。这些酶可包括降解木聚糖和生物质中的其他半纤维素材料的半纤维素酶(Maheshwari et al.，2000，Microbiol Mol Biol Rev.64:461);使纤维素结构重排的膨胀因子(swoIIenin)和扩展因子(expansin) (Saloheimo et al, 2002，Eur.J.Biochem.269:4202; Sampedro and Cosgrove, 2005, Genome Biol.6:242);以及部分表征或未表征的活性例如GH家族61酶(Harris et al.，2010，Biochemistry49:3305)和纤维素诱导的蛋白(CIP—Foreman et al.，2003，J.Biol.Chem.278:31988)。用于转化木质纤维素底物的高效纤维素酶系统将根据生物质的组成和处理条件纳入这些酶的全部或任何一种(Henrissat et al.，1985，Bio/technology3:722 ；Baker et al.，1998，App1.Biochem.Biotechno1.70-72:395;Boisset et al., 2001，Biotechno1.Bioeng.72:339;Berlinet al.,2007,Biotechnol.Bioeng.97:287 ；Gusakov et al.,2007,Biotechnol.Bioeng.97: 1028;W02008/025165 ；W02009/026722 ；Meyer et al.，2009,J.CerealSc1.50:337)。
[0007]纤维素酶——以及其他GH酶——具有共同的总体结构和催化机制(Teeri etal.，1992，Biotechnology21:417)。所有GH酶具有催化结构域(CD)，并且该结构域的具体结构决定其GH家族命名，有超过100个GH家族命名。已经鉴定了 GH的两种常见的催化机制，并且来自给定的家族的所有酶将具有共同的机制(McCarter and Withers, 1994, Curr.0pin.Struct.Biol.4:885 ；Zechel and Withers, 2000，Acc.Chem.Res.33:11)。能够保留还原端的异头构型的保留型酶(retaining enzyme)通过双重置换反应进行水解，其中靶键的还原侧首先被置换 ，并被共价结合到活性位点中的酸性残基，接着进行第二次置换，通常通过水(但可能通过其他含有羟基的化合物(包括糖))来完成所述置换(White andRose, 1997, Curr.0p.Struct.Biol.7:645)。可转换异头碳的构型的转换型酶(invertingenzyme)具有活化水，靶键的还原端被直接置换到所述活化水上。
[0008]纤维素酶以及许多半纤维素酶和辅助纤维素水解的酶，常常具有碳水化合物结合模块(CBM)，在纤维素酶的情形中碳水化合物结合模块也被称为纤维素结合结构域(CBD )。CBM的一个功能是帮助⑶与底物接触。一些研究表明，某些CBM还可破坏纤维素结构，从而有利于 CD 的催化活性(Din et al.，1994, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.91:11383 ；Teeriet al.，1992，Biotechnology21:417)。在超过40个不同的家族中有三种常见的CBM类型。其中，I型CBM与结晶纤维素酶的表面结合；家族I的CBM属于I型，是来自丝状真菌的糖基水解酶中发现的唯一类型。在结构上，CBM/CBD可以几乎与⑶相连，但通常这些结构域通过长度一般为10-50个残基的非结构化的(unstructured)(常常为糖基化的)连接肽连接，所述连接肽参与纤维素相互作用(Srisodsuk et al.，1993，J.Biol.Chem.268:20756)。
[0009]纤维二糖水解酶是纤维素水解的主要驱动者。这些酶与纤维素链的游离端结合，并常常持续地催化从所述链末端切割纤维二糖单元。因此，纤维二糖水解酶催化大多数从固体纤维素底物释放可溶性寡糖的反应，并且使得它们可用于进一步水解为葡萄糖。有两种主要类型的 CBH (Barr et al.，1996，Biochemistry35:586)。纤维二糖水解酶 2 (CBH2或CBH II )是从纤维素链的非还原端进行水解的转换型酶；多数CBH2酶见于GH家族6。纤维二糖水解酶I (CBH1或CBH I)酶是从纤维素链的还原端进行水解的保留型酶；大多数CBHl见于GH家族7。CBH样酶活性存在于其他GH家族(例如家族9和48)中。CBHl和CBH2的活性及两者的协同作用占了大多数真菌系统的总纤维素酶活性的大部分。
[0010]包含家族7⑶的糖苷水解酶见于真核生物(主要是真菌)，包含外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶。虽然也已经报道了脱乙酰几丁质酶和木聚糖酶活性，但是GH家族7酶大多是纤维素酶。所述家族通过β -果冻卷(beta-jelly roll)核心结构来区分,许多随机螺旋形式的蛋白质通过二硫键连接在一起。与内切葡聚糖酶相比，该家族的外切葡聚糖酶具有覆盖活性位点裂缝(cleft)的肽环(peptide loop),将活性位点裂缝转变成闭合的通道，所述通道引导纤维素链通过所述活性位点残基并使得能够具有高连续性(Kleywegt etal., 1997, J Mol Biol.272:383)。所述活性位点通道或裂缝由一系列单体(在纤维素的情形中为葡萄糖)结合位点组成，所述结合位点通过糖残基和裂缝中芳香族侧链之间的环堆积相互作用来与多糖链相连。在纤维素酶的情形中，被结合的纤维素从而与活性位点处的两个酸性残基恰当地排列，所述活性位点催化所述双重置换水解。从所述催化点开始对单体结合位点进行编号，正数向纤维素链的还原端的方向进行，负数向非还末端的方向进行。因此，所述催化位点位于+1和-1位点之间，对于Cel7纤维二糖水解酶，产物结合位点为+1和+2位点，所述+1和+2位点在初始置换后被纤维二糖占据(Divne et al.，1998，J.Mol.Biol.275:309)。
[0011]纤维素酶和其他GH由许多生物产生，用于多种天然的目的。纤维素酶主要是由微生物——细菌和真菌——分泌的酶，用于从环境中获得营养素。细菌常常分泌在扩展的非共价连接的结构(称为纤维素酶小体(cellulosome))中连接在一起的酶(Fontes andGilbert, 2010, Annu Rev Biochem.79:655)。真菌通常表达单独的酶，但是一些真菌例如生活在反刍动物(例如绵羊和牛)瘤胃中的那些，也可形成扩展的纤维素酶小体样的结构(Ljungdahl, 2008, Ann.N.Y.Acad.Sc1.1125: 308)。生物体表达的确切的酶和酶比值可由其已经利用的底物和目前其正在利用的底物来确定。多数纤维素酶和半纤维素酶的表达是由与革G底物相关的小分子诱导的(Schmoll and Kubicek, 2003, Acta Microbiol TmmunolHung.50:125;Mach and Zeilinger, 2003, Appl Microbiol Biotechnol.60:515)。
[0012]嗜温真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)(红褐肉座菌(无性型的Hypocreajecorina))和嗜热真菌嗜热毁丝菌(Myceliophthora thermophila)(无性型的 Thielaviaheterothallica)是工业使用的糖苷水解酶的主要来源。两者均分泌大量的主要包含水解酶的蛋白质，因此对工业酶而言，两者是有用的生产宿主。
[0013]里氏木霉(T.ressi)分泌两种GH 家族 7 酶，CBHl (Cel7A)和 EGl (Cel7B)，其中C e 17 A是主要的分泌蛋白产物。正如已经解开某些其他家族7酶的结构一样，已经解开了 Cel7A和Cel7B 二者的催化结构域的三维结构(Divne, et al.，1998，J.Mol.Biol.275:309-325;Kleywegt et al, 1997，J.Biol.Chem.272:383-397)。 嗜热毁丝菌(M.thermophila)分泌至少三种GH家族7酶。其他工业相关的纤维素酶来自真菌，包括但不限于曲霉属(Aspergillus)、毛壳霉属(Chaetomium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、棒囊壳属(Corynascus)、拟层孔菌(Fomitopsis)、键抱菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、稻温病菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、毁丝霉属(Myceliophthora)、链抱霉属(Neurospora)、平革菌属(Phanerochaete)、柄孢壳菌属(Podospora)、根毛霉属(Rhizomucor)、侧孢霉属(Sporotrichum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、嗜热真菌属(Thermomyces)和梭孢壳属(Thielavia)的种。
[0014]GH，特别是纤维素酶和半纤维素酶，在工业中具有许多有用的应用。纤维素酶在纺织工业中使用，用于生物抛光(biopolishing)、丹宁布(denim)磨损、洗漆剂应用(例如 Anish et al,2007,Biotechnol Bioeng.96:48 ；Montazer et al,2010,Appl BiochemBiotechnol.160:2114；Shimonaka et al,2006, Biosci Biotechnol Biochem.70:1013)。葡聚糖酶和木聚糖酶在酿造和烘焙工业中用于降低粘度和改善产品质地(例如Bai etal, 2010, Appl Microbiol Biotechnol.87:251 )。半纤维素酶，特别是木聚糖酶，在纸浆造纸工业中用以改善漂率、改善处理效率以及改变纸张质量和属性(例如Suurnakkiet al, 1997, Adv Biochem Eng Biotechnol.57:261 )。最后，纤维素酶一直用于将纤维素水解为糖，用于发酵为有附加值的产品，特别是生物燃料和燃料级乙醇(Dashtban etal, 2009, Int J Biol Sc1.5:578)。因为GH家族7纤维二糖水解酶被公认为是纤维素酶系统中纤维素水解的主要驱动者，因此作出了极大的努力以使用现代分子生物学的方法来改进这些酶。
[0015]酶改进的目标取决于处理条件和酶应用的最终目的。通常的改进目标是热稳定性和亲热性，以使得酶能够在高处理温度下工作。更高的处理温度有利于提高反应速率以及降低微生物污染的可能性。另一常见的目标是可能需要在酶与处理之间保持一致的最适PH和pH范围。使由处理中特有的因素所引起的酶抑制和失活(包括产物抑制)下降，可能对于某些处理配置是重要的。最后，始终需要提高在处理条件下酶的比活性。酶修饰的目标范围广，并且对处理和最终目标高度特异。一个总体目标可以是增宽、缩小或改变底物特异性。另一总体目标可以是限制反应的立体化学。
[0016]已经开发了许多改进和/或修饰酶的属性的方法。这些方法范围很广，从合理设计到定向进化都有。对于合理设计，仔细考虑蛋白质的结构/功能关系，然后基于对蛋白质生物化学的理解进行有意的设计改变(例如Wohlfahrt etal., 2003, Biochemistry42:10095)。对于定向进化，生成在氨基酸序列上包含随机改变的酶变体文库，并且通过测定对文库进行筛选以鉴定改进/改变的变体(Arnold andMoore, 1997, Adv Biochem Eng Biotechnol.58:1 ；Kim et al., 2000, Appl EnvironMicrobiol.66:788)。还存在许多杂合方法，有时被称为“半-合理”设计。例如，长期以来已知蛋白家族的共有序列常常比单个成员的序列更稳定(Lehmann et al., 2000, BiochimBiophys Acta.1543:408 ;Lehmann and ffyss,2001, Curr Opin Biotechnol.12:371)。因此，一种产生更稳定的酶的方法是将非共有残基突变为共有序列。另一实例是SCHEMA方法，其包括随机互换来自 共同蛋白家族的若干成员的用结构定义的结构域，然后通过测定来筛选改进 / 改变的变体(Silberg et al., 2004, Methods Enzymol.388:35 ；Heinzelmanet al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA.106:5610)。第三个实例是 ProSar 算法，其使用来自最初随机筛选的信息，来设计第二和第三重组体用于筛选(Fox et al., 2003, ProteinEng.16:589) ο
[0017]GH家族7酶已经是对商业应用的研究和开发都很深入的领域。例如，已经通过合理设计使木霉属(Trichoderma) Cel7A发生突变，以改变所述酶的最佳pH和热稳定性(Becker et al., 2001, Biochem J.356:19 ；Boer and Koivula, 2003, Eur JBiochem.270:841)。Cel7A共有序列已经被构建并表达，并且显示出比木霉属Cel7A酶的热稳定性更高(美国公开N0.2005/0054039)。SCHEMA方法已经被应用于生成热稳定性增加的杂合 Cel7A 酶(Heinzelman et al., 2010, Protein Eng Des Sel.23:871)。随机诱变也已经被应用于鉴定改进的木霉属Cel7A变体。合理设计和定向进化已经被应用于改进来自 Melanocarpus 的 Cel7B 的热稳定性(Voutilainen et al., 2007, Enz MicrobTechnol.41:234 ；Voutilainen et al.,2009, Appl Microbiol Biotechnol.83:261)。类似的合理设计方法用于使来自踝节菌属的Cel7A稳定，并在一个实例中偶然地提高比活性(Voutilainen et al., 2010, Protein Eng Des Sel.23:69)。木霉属 Cel7A 的 CBM 已经被设计成使得与纤维素的结合具有PH敏感性，从而在处理条件下使所述结合可逆，使得酶能够重复利用(Reinikainen et al., 1992, Proteinsl4:475 ；Reinikainen etal., 1995, Proteins22:392;Under et al.，1999，FEES Lett.447:13)。通过可产生另外的糖单体结合位点的合理设计突变使腐质霉属Cel7内切葡聚糖酶的Km降低(Davies etal.,1997, J Biotechnol.57:91)。
[0018]精心设计的测定法是成功鉴定改进的酶的关键，尤其是在随机方法(例如定向进化)的情形中。虽然已经开发了可溶的显色底物和荧光底物用于检测GH酶的活性并将它们用于某些筛选测定，但是GH酶在这些人造底物上的性能常常与在天然的或技术性的底物例如纤维素或木聚糖上的活性不相关。已经有文献记录了在一种底物上的改进与在另一种底物上的改进不相关的实例(Teeri et al.，1998，Biochem Soc Trans.26:173 ；Voutilainen et al.，2010，Protein Eng Des Sel.23:69;Kurasin and Valjamaej 2011, JBiol Chem.286:169)。因此，当筛选改进的酶时，关键是使用与处理相关的底物和条件。
[0019]包含很多氨基酸置换的里氏木霉(红褐肉座菌(H.jecorina))Cel7A的变体在美国专利 N0.7，951，570、美国公开 N0.2011/0229956 和美国公开 N0.2009/0075336 中公开。包含很多氨基酸置换的嗜热毁丝菌(M.thermophila) CBHla的变体在美国公开N0.2012/0003703中公开。然而，通过使用可溶性底物而非纤维素底物筛选改进的热稳定性和亲热性来分离这些变体。在一些情形中，随后对热稳定的变体进行纤维素水解活性的表征。
[0020]本文中发明人提供了里氏木霉Cel7A的变体，所述变体是通过在处理过程相关的条件下使用处理过程相关的底物来筛选提高的活性而分离的。将赋予提高的具体突变在来自其他生物体的Cel7A纤维二糖水解酶上作图，以证实所述提高可以推广到GH家族7酶。
【发明内容】

[0021]本发明涉及分离的纤维二糖水解酶。更具体地，本发明涉及分离的糖基水解酶家族7的纤维二糖水解酶，所述酶的活性增加、产物抑制减弱或稳定性改善。本发明的纤维二糖水解酶在需要将纤维二糖有效地转化成葡萄糖(特别是在高底物浓度的条件下，或者用于水解木质纤维素生物质)的工业过程中应用。
[0022]在第一方面，本发明涉及一种包含修饰的家族7催化结构域的分离的纤维二糖水解酶，所述催化结构域在以下位置具有一个或多个氨基酸置换:
[0023]26，39，45，46，51，52，53，54，75，87，93，95，102，111，114，129，130，131，138，139，143，144，150，155，156，181，183，184，197，209，211，219，237，241，253，260，264，271，282，314，316，324，326，339，343，351，353，358，364，368，370，373，374，375，378，379，382，383，385,390,398,400,406,419,420,423,435,436,
[0024]或其任意组合。所述位置根据亲本家族7纤维素酶与SEQ ID NO:1的比对来确定。所述修饰的家族7催化结构域包含的氨基酸序列展示出与SEQ ID NO:1的1-436位氨基酸或SEQ ID NO:2的1-438位氨基酸约45% -约99.9%的序列同一性。
[0025]如上所述的包含修饰的家族7催化结构域的这类分离的纤维二糖水解酶，相对于包含亲本家族7催化结构域(所述修饰的家族7催化结构域衍生自该结构域)的纤维二糖水解酶，展示出比活性增加、由葡萄糖引起的抑制下降、由木质素引起的失活下降、存在木质素时的活性增加、存在木质纤维素水解产物时的活性增加、或其任意组合。
[0026]在一个实施方案中，所述修饰的家族7催化结构域包含在以下位置上具有一个或多个氨基酸置换:[0027]26,39,45,46,52,53,54,87,95,102，129，130，139，143，144，183，184，197,237，241，253，264，271，282，314，316，324，326，339，343，364，368，379，382，385，390，398，406，423,
[0028]或其任意组合。
[0029]在另一实施方案中，所述修饰的家族7催化结构域包含选自以下的一个或多个氨
基酸置换:
[0030]X26A, X45D, X46A, X46L, X46T, X51I, X52R, X52W, X53A, X53M, X53R, X53W, X54S,X54I，X54D,X75S,X87T,X93V,X95L,X95Y,X102R,XlIIT,X129S,X130N,X130E,X138S,X139E,X139M, X139Q, X139S, X139R, X143L, X143G, X144A, X144V, X150N, X181L, X183N, X184S,X197L, X197V, X197Q, X197W, X219S, X237T, X241L, X241R, X241V, X253R, X260D, X264C,X264Y, X271I, X326F, X343L, X351R, X353M, X364V, X368A, X373Y, X374V, X375A, X378E,X379C, X379E, X382L, X382Q, X382I, X383S, X385I, X385L, X390A, X390G, X390K, X390W,X390C, X390L, X390V, X400G, X406P, X419F，和 X436D,
[0031]并且展示出与 SEQ ID NO:1的1-436位氨基酸或SEQ ID NO:2的1-438位氨基酸约65 % -约99.9 %的同一性。
[0032]例如，所述修饰的家族7催化结构域可包含一个或多个选自以下的氨基酸置换:
[0033]X45D, X46A, X46L, X46T, X52R, X53A, X53M, X53R, X53W, X54S, X54I, X54D, X87T,X95L, X95Y, X102R, X129S, X130N, X139M, X139S, X139R, X143L, X143G, X144V, X183N, X184S,X197L, X197V, X197Q, X197W, X237T, X241L, X241R, X241V, X253R, X264C, X271I, X282I,X314A, X326F, X343L, X364V, X368A, X368G, X379C, X379E, X382L, X382Q, X382I, X383S,X385G, X385I, X385L, X390A, X390G, X390K, X390W, X390C, X390L, X390V, X398P, X406P，和X423Y,
[0034]并且展示出与SEQ ID NO:1的1-436位氨基酸或SEQ ID NO:2的1-438位氨基酸约80 % -约99.9 %的同一性。
[0035]在又一实施方案中，所述分离的纤维二糖水解酶还包含碳水化合物结合模块和位于所述修饰的家族7催化结构域与所述碳水化合物结合模块之间的连接肽。例如，所述碳水化合物结合模块可为家族I碳水化合物结合模块，其展示出与SEQ ID NO:1的461-497位氨基酸或与氨基酸约50% -约99%的同一性，并且在位置466包含丝氨酸，在位置467包含天冬氨酸，在位置471包含丝氨酸，在位置483包含缬氨酸或丝氨酸，在位置486包含精氨酸，在位置489包含苏氨酸或谷氨酰胺，或其任意组合。所述位置根据亲本家族I碳水化合物结合模块与SEQ ID NO:1的461-497位氨基酸的比对来确定。
[0036]在另一方面，本发明涉及一种分离的纤维二糖水解酶，其包含家族7催化结构域、修饰的家族I碳水化合物结合模块和在所述家族7催化结构域和所述修饰的家族I碳水化合物结合模块之间的连接肽。所述修饰的家族I碳水化合物结合模块包含选自以下的一个或多个氨基酸置换:X466S、X467D、X471S、X483V、X483S、X486R、X489T 和 X489Q，并且展示出与SEQ ID NO:1的461-497位氨基酸或SEQ ID NO:2的474-509位氨基酸约50% -约99%的同一性。所述一个或多个氨基酸置换的位置根据亲本家族I碳水化合物结合模块与SEQ ID NO:1的461-497位氨基酸的比对来确定。这类分离的纤维二糖水解酶，相对于包含亲本家族I碳水化合物结合结构域(所述修饰的家族I碳水化合物结合结构域衍生自该结构域)的纤维二糖水解酶，展示出比活性增加、由葡萄糖引起的抑制下降、由木质素引起的失活下降、存在木质素时的活性增加、存在木质纤维素水解产物时的活性增加、或其任意组合。
[0037]在另一方面，本发明涉及一种分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶，其包含选自以下的一个或多个氨基酸置换:
[0038]T26X, R39L, N45D, S46X, Y51I, D52X, G53X, N54X, G75X, S87X, I93X, F95X, A100X,K102X, L108X, M111X, D114X, F129X, D130X, V131X, P137X, C138X, G139X, A143X, L144X,D150X, V155X, S156X, K181X, I183X, N184X, P194X, N197X, N200X, C209X, S211X, N219X,I237X, D241X, G253X, G260X, N264X, P265X, T271X, L282X, P314X, A316X, N324X, L326X,G339X, F343X, Q351X, K353X, G358X, M364X, D368X, Y370X, A372X, N373X, M374X, L375X,D378X, S379X, S379X, P382X, T383X, E385X, P390X, V393X, S398X, S400X, Q406X, S419X,N420X, F423X, N431X, G435X, N436X, P437X, N441X, G444X, T446X, T447X, R450X, T453X,T454X, T455X, P459X, Q463X, Y466X, G467X, G471X, S475X, G476X, S482X, G483X, C486X,V488X，和 L489X。
[0039]这类分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶包含的氨基酸序列具有与SEQ IDNO:1的1-497位氨基酸约75% -约99.9%的同一性。
[0040]在一个实施方案中，所述分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶可包含一个或多个选自以下的氨基酸置换:
[0041]T26A, T26S, R39L, N45D, S46G, S46A, S46I, S46L, S46T, Y51I, D52R, D52T, D52W,G53A, G53M, G53R, G53W, N54S, N54I, N54D, G75S, S87T, I93V, F95L, F95Y, A100T, A100V,A100W, A100L, A100G, K102S, K102R, L108I, M111T, D114E, F129S, D130N, D130E, V131A,P137S, C138S, G139E, G139M, G139Q, G139S, G139R, A143L, A143G, L144A, L144V, D150N,V155M, S156G, K181L, I183N, N184S, P194Q, N197L, N197V, N197Q, N197W, N197A, N200F,N200C, C209S, S211T, N219S, I237T, D241L, D241R, D241V, G253D, G253R, G260D, N264Y,T271I, L282I, P314A, A316V, N324D, L326F, G339D, F343L, Q351R, K353M, G358S, M364V,D368A, D368G, D378E, Y370H, A372T, N373Y, M374V, L375A, D378E, S379C, S379E, P382L,P382Q, P382I, T383S, T383A, E385G, E385I, E385L, P390A, P390G, P390K, P390W, P390C,P390L, P390V, S398P, S400G, Q406P, S419F, N420D, F423Y, N431R, G435S, N436D, P437T,N441D, G444D, T446A, T447S, R450S, T453I, T453S, T454I, T455A, P459L, Q463L, Q463S,Q463K, Y466S, G467D, G471S, S475N, G476D, S482N, G483V, G483S, C486R, V488D, L489P，和L489Q.[0042]这类分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶包含的氨基酸序列具有与SEQ IDNO:1的1-497位氨基酸约80% -约99.9%的同一性。
[0043]例如，所述分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶可包含一个或多个选自以下
的氨基酸置换:
[0044] T26S, R39L, N45D, S46G, S46A, S46L, S46T, D52R, G53A, G53M, G53R, G53W, N54S,N54I, N54D, S87T, A100T, A100V, A100W, A100L, A100G, K102R, F129S, D130N, G139M, G139S,G139R, A143L, A143G, L144V, I183N, N184S, N197L, N197V, N197Q, N197W, N197A, N200F,N200C,1237T, D241L, D241R, D241V, G253D, G253R, N264C, N264Y, T271I, L282I, P314A,A316V, N324D, L326F, G339D, F343L, G358S, M364V, D368A, D368G, A372T, S379C, P382L,P382Q, P382I, T383S, T383A, E385G, E385I, E385L, P390A, P390G, P390K, P390W, P390C,P390L, P390V, S398P, Q406P, F423Y, N431R, P437T, T446A, T447S, T454I, G467D, S475N，和G483V,
[0045]并且展示出与SEQ ID NO:1的1-497位氨基酸约90% -约99.9%的同一性。
[0046]如上所述的分离的里氏木霉Trcel7A纤维二糖水解酶，相对于亲本里氏木霉Trcel7A纤维二糖水解酶(所述分离的里氏木霉Trcel7A纤维二糖水解酶衍生自该酶)，展示出比活性增加、由葡萄糖引起的抑制下降、由木质素引起的失活下降、存在木质素时的活性增加、存在木质纤维素水解产物时的活性增加、或其任意组合。
[0047]在另一方面，本发明涉及编码如上所述的分离的纤维二糖水解酶的遗传构建体。
[0048]在另一方面，本发明还涉及一种遗传修饰的微生物，其包含编码如上所述的分离的纤维二糖水解酶的遗传构建体。所述遗传修饰的微生物可为酵母或丝状真菌。例如，所述遗传修饰的微生物可为酵母茵属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊氏酵母属(Hansenula)、木霉 属、肉座茵属(Hypocrea)、曲霉属、镰刀茵属、腐质霉属、金孢子菌属、毁丝霉属、梭孢壳属、侧孢霉属或链孢霉属或者其分类学上等价的属的种。
[0049]在另一方面，本发明还涉及一种用于产生如上所述的分离的纤维二糖水解酶的方法，所述方法包括用编码所述分离的纤维二糖水解酶的遗传构建体转化宿主微生物，选择表达所述分离的纤维二糖水解酶的遗传修饰的微生物，以及在能够从所述遗传构建体表达所述分离的纤维二糖水解酶的条件下培养所述遗传修饰的微生物。
[0050]在另一方面，本发明涉及包含如上所述的分离的纤维二糖水解酶的纤维素酶混合物。
[0051]在另一方面，本发明涉及一种用包含如上所述的分离的纤维二糖水解酶的纤维素酶混合物水解纤维素底物的方法。在一个实施方案中，所述纤维素底物是预处理的木质纤维素原料例如玉米秸杆、小麦秸杆、大麦秸杆、水稻秸杆、燕麦秸杆、油菜秸杆、大豆秸杆、玉米纤维、甜菜浆、纸浆厂细屑(fine)和次品、甘蔗渣、硬木材、软木材、锯屑、柳枝稷、芒草、米草(cord grass)和草芦(reed canary grass)。
【专利附图】

【附图说明】
[0052]图1示出了用于指导分离的纤维二糖水解酶在木霉属宿主菌中表达和分泌的质粒载体 pTr7Ap-Nhe1-Kpn1-7aT_DRmUra3 的图谱。
[0053]图2示出了用于指导分离的纤维二糖水解酶在木霉属宿主菌中表达和分泌的质粒载体 pTr7Ap’ -Nhe 1-Kpn 1-7aT_DRmUra3 的图谱。
[0054]图3提供了(a)真菌家族7催化结构域的氨基酸序列的比对和(b)共有序列家族7催化结构域中每个氨基酸的相对发生频率的示意图。
[0055]图4 提供了 TrCel7A (SEQ ID NO:1)和 MtCel7A (SEQ ID N0:2)纤维二糖水解酶的比对。
[0056]图5提供了真菌家族I碳水化合物结合模块的氨基酸序列的比对。
【具体实施方式】[0057]本发明涉及分离的纤维二糖水解酶。更具体地，本发明涉及分离的纤维二糖水解酶，其包含属于糖苷水解酶家族7的改良催化结构域，并且展示出比活性增加、由葡萄糖引起的抑制下降、由木质素引起的失活下降、存在木质素时的活性增加、存在木质纤维素水解产物的时的活性增加，或其组合。本发明还涉及编码所述分离的纤维二糖水解酶的遗传构建体，从宿主菌株产生所述分离的纤维二糖水解酶的方法，和用所述分离的纤维二糖水解酶水解纤维质底物(例如预处理的木质纤维素原料)的方法。
[0058]以下描述是仅作为示例、而不是对实现本发明所必需的特征的组合构成限制的优选实施方案。提供的标题不意欲限制本发明的各个实施方案。术语例如“包括”和“包含”不意欲是限制性的。此外，除非另有说明，否则单数形式的使用包括复数形式，并且“或”是指“和/或”。除非本文另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。
[0059]家族7纤维二糖水解酶 [0060]本文使用的家族7纤维二糖水解酶(Cel7纤维二糖水解酶、Cel7CBH酶或Cel7CBH)是包含属于糖苷水解酶(GH)家族7的催化结构域的纤维素酶，其能够从纤维素链的还原端释放纤维二糖。例如，Cel7CBH可以从纤维素链的还原端持续地释放纤维二糖。来自不同生物来源的包含家族7催化结构域的纤维素酶通过两个字母的命名来标识，所述两个字母的命名由所述Cel7CBH衍生自的属和种的第一个字母组成，后面跟着指示具体的Cel7从该生物中的鉴定出来的顺序的大写字母。例如，来自里氏木霉的Cel7CBH酶(CBHl)和来自嗜热毁丝菌的Cel7CBH酶(CBHla)可被分别称为TrCel7A和MtCel7A。
[0061]如果催化结构域展示出与其他的家族7纤维素酶相似的一级、二级和三级蛋白质结构，那么该催化结构域被分类至GH家族7中。例如，所有的家族7纤维素酶包含两个可作为催化残基的谷氨酸(E)残基。这些天冬氨酸残基存在于里氏木霉CBHl的212和217位(Divne, et al.，1998，J.Mol.Biol.275:309-325)。嗜热毁丝菌 CBHla 中的同源谷氨酸存在于213和218位(图5)。
[0062]家族7催化结构域通过β -果冻卷核心结构来区分，许多随机螺旋形式的蛋白质通过二硫键连接在一起。已知一些家族7纤维素酶的三维结构:里氏木霉Cel7A (Divneet al.，1994，Science265 (6171):524-528);里氏木霉 Cel7B (Kleywegt et al., 1997, J.Biol.Chem.272:383-397),尖抱键刀菌(Fusarium oxysporum) Cel7B (Sulzenbacher, etal., 1996, Biochemistry35(48):15280-15287),特异腐质霉(Humicola insolens)Cel7B (Davies, et al.,1997, J.Biotechnol.57:91-100),热白丝菌(Melanocarpusalbomyces) Cel7B (Parkkinen et al., 2008, Protein Sciencel7:1383-94),黄抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium) Cel7D (Munoz et al., 2001, J.Mol.Biol.314:1097-1111),和埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii) Cel7A (Grassick etal.,2004,Eur.J.Biochem.271:495-4506)。
[0063]家族7催化结构域主要见于真菌纤维素酶中。表1中提供了包含家族7催化结构域的纤维素酶的非限制性实例。
[0064]表1:真菌家族7催化结构域
[0065]
【权利要求】
1.一种包含修饰的家族7催化结构域的分离的纤维二糖水解酶，所述修饰的家族7催化结构域在以下位置具有一个或多个氨基酸置换:
26，39，45，46，51，52，53，54，75，87，93，95，102，111，114，129，130，131，138，139，143，144，150，155，156，181，183，184，197，209，211，219，237，241，253，260，264，271，282，314，316，324，326，339，343，351，353，358，364，368，370，373，374，375，378，379，382，383，385，390,398,400,406,419,420,423,435,436, 或其任意组合；所述位置根据相应的亲本家族7催化结构域与SEQ ID NO:1的1-436位氨基酸或SEQ ID NO:2的1-438位氨基酸的比对确定，其中所述修饰的家族7催化结构域展示出与SEQ ID NO:1的1-436位氨基酸或SEQ ID NO:2的1-438位氨基酸约45%-约99.9%的氨基酸序列同一性，并且其中相对于包含从中衍生出所述修饰的家族7催化结构域的亲本家族7催化结构域的纤维二糖水解酶，所述分离的纤维二糖水解酶展示出 a.比活性增加， b.由葡萄糖引起的抑制下降， c.由木质素引起的失活下降， d.存在木质素时的 活性增加， e.存在木质纤维素水解产物时的活性增加，或 f.a-e的任意组合。
2.权利要求1的分离的纤维二糖水解酶，包含修饰的家族7催化结构域，所述催化结构域在以下位置或其任意组合上具有一个或多个氨基酸置换:
26，39，45，46，52，53，54，87，95，102，129，130，139，143，144，183，197，237，241，253，264，271，282，314，316，324，326，339，343，364，368，379，382，385，390，398，406，423， 或其任意组合。
3.权利要求1的分离的纤维二糖水解酶，其中所述修饰的家族7催化结构域包含一个或多个选自以下的氨基酸置换:
X26A, X45D, X46A, X46L, X46T, X51I, X52R, X52W, X53A, X53M, X53R, X53W, X54S, X54I,X54D, X75S, X87T, X93V, X95L, X95Y, X102R, X111T, X129S, X130N, X130E, X138S, X139E,X139M, X139Q, X139S, X139R, X143L, X143G, X144A, X144V, X150N, X181L, X183N, X184S,X197L, X197V, X197Q, X197W, X219S, X237T, X241L, X241R, X241V, X253R, X260D, X264C,X264Y, X271I, X326F, X343L, X351R, X353M, X364V, X368A, X373Y, X374V, X375A, X378E,X379C, X379E, X382L, X382Q, X382I, X383S, X385I, X385L, X390A, X390G, X390K, X390W,X390C, X390L, X390V, X400G, X406P, X419F，和 X436D, 其中所述修饰的家族7催化结构域包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的1-436位氨基酸或SEQ ID NO:2的1-438位氨基酸具有约65%-约99.9%的同一性。
4.权利要求3的分离的纤维二糖水解酶，其中所述修饰的家族7催化结构域包含一个或多个选自以下的氨基酸置换:
X45D, X46A, X46L, X46T, X52R, X53A, X53M, X53R, X53W, X54S, X54I, X54D, X87T, X95L,X95Y, X102R, X129S, X130N, X139M,X139S,X139R,X143L,X143G,X144V,X183N,X184S,X197L,X197V, X197Q, X197W, X237T, X241L, X241R, X241V, X253R, X264C, X271I, X282I, X314A,X326F, X343L, X364V, X368A, X368G, X379C, X379E, X382L, X382Q, X382I, X383S, X385G,X385I, X385L, X390A, X390G, X390K, X390W, X390C, X390L, X390V, X398P, X406P 和 X423Y, 并且展示出与SEQ ID NO:1的1-436位氨基酸或SEQ ID NO: 2的1-438位氨基酸约80%-约99.9%的同一性。
5.权利要求1-4任一项的分离的纤维二糖水解酶，还包含碳水化合物结合模块和位于所述修饰的家族7催化结构域与所述碳水化合物结合模块之间的连接肽。
6.权利要求5的分离的纤维二糖水解酶，其中所述碳水化合物结合模块是家族I碳水化合物结合模块，所述家族I碳水化合物结合模块展示出与SEQ ID NO:1的461-497位氨基酸或SEQ ID NO: 2的474-509位氨基酸约50%-约99%的同一性，并且包含一个或多个选自以下的氨基酸置换:X466S、X467D、X471S、X483V、X483S、X486R、X489T 和 X489Q，所述位置根据亲本家族I碳水化合物结合模块与SEQID NO:1的461-497位氨基酸的比对确定。
7.分离的纤维二糖水解酶，其包含家族7催化结构域、修饰的家族I碳水化合物结合模块和在所述家族7催化结构域与所述修饰的家族I碳水化合物结合模块之间的连接肽，其中所述修饰的家族I碳水化合物结合模块展示出与SEQ ID NO:1的461-497位氨基酸或SEQ ID NO:2的474- 509位氨基酸约50% -约99%的同一性，并且包含一个或多个选自以下的氨基酸置换:X466S、X467D、X471S、X483V、X483S、X486R、X489T 和 X489Q，所述位置根据亲本家族I碳水化合物结合模块与SEQ ID NO:1的461-497位氨基酸的比对确定，并且其中相对于包含从中衍生出所述修饰的家族I碳水化合物结合模块的亲本家族I碳水化合物结合模块的纤维二糖水解酶，所述分离的纤维二糖水解酶展示出 a.比活性增加， b.由葡萄糖引起的抑制下降， c.由木质素引起的失活下降， d.存在木质素时的活性增加， e.存在木质纤维素水解产物时的活性增加，或 f.a-e的任意组合。
8.一种分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶，其包含一个或多个选自以下的氨基酸置换:
T26X, R39L, N45D, S46X, Y51I, D52X, G53X, N54X, G75X, S87X, I93X, F95X, A100X, K102X,L108X, M111X, D114X, F129X, D130X, V131X, P137X, C138X, G139X, A143X, L144X, D150X,V155X, S156X, K181X, I183X, N184X, P194X, N197X, N200X, C209X, S211X, N219X, I237X,D241X, G253X, G260X, N264X, T271X, L282X, P314X, A316X, N324X, L326X, G339X, F343X,Q351X, K353X, G358X, M364X, D368X, Y370X, A372X, N373X, M374X, L375X, D378X, S379X,S379X, P382X, T383X, E385X, P390X, V393X, S398X, S400X, Q406X, S419X, N420X, F423X,N431X, G435X, N436X, P437X, N441X, G444X, T446X, T447X, R450X, T453X, T454X, T455X,P459X, Q463X, Y466X, G467X, G471X, S475X, G476X, S482X, G483X, G483X, C486X, V488X，和L489X, 其中所述分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶包含的氨基酸序列与SEQ ID ΝΟ:1的1-497位氨基酸具有约75% -约99.9%的同一性，并且相对于从中衍生出所述分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶的亲本里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶，其展示出 a.比活性增加，b.由葡萄糖引起的抑制下降， c.由木质素引起的失活下降， d.存在木质素时的活性增加， e.存在木质纤维素水解产物时的活性增加，或 f.a-e的任意组合。
9.权利要求8的分离的 里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶，包含一个或多个选自以下的氨基酸置换:
T26A, T26S, R39L, N45D, S46G, S46A, S46I, S46L, S46T, Y51I, D52R, D52T, D52W, G53A,G53M, G53R, G53W, N54S, N54I, N54D, G75S, S87T, G88V, I93V, F95L, F95Y, A100T, A100V,A100W, A100L, A100G, K102S, K102R, L108I, M111T, D114E, F129S, D130N, D130E, V131A,P137S, C138S, G139E, G139M, G139Q, G139S, G139R, A143L, A143G, L144A, L144V, D150N,V155M, S156G, K181L, I183N, N184S, P194Q, N197L, N197V, N197Q, N197W, N197A, N200F,N200C, C209S, S211T, N219S, I237T, D241L, D241R, D241V, G253D, G253R, G260D, N264Y,T271I, L282I” P314A, A316V, N324D, L326F, G339D, F343L, Q351R, K353M, T356I, G358S,M364V, D368A, D368G, D378E, Y370H, A372T, N373Y, M374V, L375A, D378E, S379C, S379E,P382L, P382Q, P382I, T383S, T383A, E385G, E385I, E385L, P390A, P390G, P390K, P390W,P390C, P390L, P390V, V393A, S398P, S400G, Q406P, S419F, N420D, F423Y, N431R, G435S,N436D, P437T, N441D, G444D, T446A, T447S, R450S, T453I, T453S, T454I, T455A, P459L,Q463L, Q463S, Q463K, Y466S, G467D, G471S, S475N, G476D, S482N, G483V, G483S, C486R,V488D, L489P，和 L489Q， 其中所述分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶包含的氨基酸序列与SEQ ID N0:1的1-497位氨基酸具有约80% -约99.9%的同一性。
10.权利要求9的分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶，包含一个或多个选自以下的氨基酸置换:T26S, R39L, N45D, S46G, S46A, S46L, S46T, D52R, G53A, G53M, G53R, G53W,N54S, N54I, N54D, S87T, A100T, A100V, A100W, A100L, A100G, K102R, F129S, D130N, G139M,G139S, G139R, A143L, A143G, L144V, I183N, N184S, N197L, N197V, N197Q, N197W, N197A,N200F, N200C, I237T, D241L, D241R, D241V, G253D, G253R, N264C, N264Y, T271I, L282I,P314A, A316V, N324D, L326F, G339D, F343L, G358S, M364V, D368A, D368G, A372T, S379C,P382L, P382Q, P382I, T383S, T383A, E385G, E385I, E385L, P390A, P390G, P390K, P390W,P390C, P390L, P390V, V393A, S398P, Q406P, F423Y, N431R, P437T, T446A, T447S, T454I,G467D, S475N，和 G483V, 其中所述分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶包含的氨基酸序列与SEQ ID ΝΟ:1的1-497位氨基酸具有约90% -约99.9%的同一性。
11.一种遗传构建体，其包含编码以下酶的核酸序列: a.权利要求1-7任一项的分离的纤维二糖水解酶，或 b.权利要求8-10任一项的分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶。
12.包含权利要求11的遗传构建体的遗传修饰的微生物。
13.权利要求12的遗传修饰的微生物，其中所述微生物是酵母或丝状真菌的种。
14.权利要求13的遗传修饰的微生物,其中所述微生物是链霉茵属(Streptomyces)、酵母茵属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、肉座茵属(Hypocrea)、木霉属(Trichoderma)、曲霉茵属(Aspergilus)、镰刀茵属(Fusarium)、金孢子属(Chrysosporium)、侧抱霉属(Sporotrichum)、毁丝霉属(Myceliophthora)或其分类学上等价的属的种。
15.一种用于产生分离的纤维二糖水解酶的方法，包括 a.用遗传构建体转化宿主微生物，所述遗传构建体包含编码(i)权利要求1-7任一项的分离的纤维二糖水解酶或Qi)权利要求8-10任一项的分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶的核酸序列； b.选择表达所述分离的纤维二糖水解酶的遗传修饰的微生物；和 c.在使得能够从所述遗传构建体表达所述分离的纤维二糖水解酶的条件下，培养所述遗传修饰的微生物。
16.一种纤维素酶的酶混合物，所述纤维素酶混合物包含包含如下酶的所述纤维素酶混合物: a.权利要求1-7任一项的分离的纤维二糖水解酶，或 b.权利要求8-10任一项的分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶。
17.一种用于水解纤维素底物的方法，包括将所述底物与权利要求16的纤维素酶混合物接触。
18.权利要求17的方法，其中所述纤维素底物是预处理的木质纤维素原料。
19.权利要求18的方法，其中所述预处理的木质纤维素原料选自玉米秸杆、小麦秸杆、大麦秸杆、水稻秸杆、燕麦秸杆、油菜秸杆、大豆秸杆、玉米纤维、甜菜浆、纸浆厂细屑和次品、甘蔗渣、硬木材、软木材、锯屑、柳枝稷、芒草、米草和草芦。
【文档编号】C12N15/80GK103958677SQ201280052603
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2012年8月29日 优先权日:2011年8月31日
【发明者】J·蒙塔利特, L·古达内特-塞维奇, C·希尔, C·D·欣德利, J·A·拉维尼, N·玛斯里, F·塔罕, J·J·托马舍克 申请人:埃欧金能源公司