纤维素分解酶组合物及其用途

纤维素分解酶组合物及其用途【专利摘要】本发明涉及产生纤维素分解酶组合物的重组丝状真菌宿主细胞，以及产生和使用所述组合物的方法。【专利说明】纤维素分解酶组合物及其用途[0001]对于在联邦资助的研究和开发下完成的发明的权利的声明[0002]该发明是在由能源部授予的合作协议(CooperativeAgreement)DE-FC36-08G018080下以政府支持完成的。政府在该发明中具有一定权利。[0003]涉及序列表[0004]本申请包含计算机可读形式的序列表，其通过提述并入本文。[0005]发明背景【
技术领域：
】[0006]本发明涉及产生纤维素分解酶组合物，产生所述纤维素分解酶组合物的的丝状真菌宿主细胞，以及产生和使用所述组合物的方法。[0007]相关技术的描述[0008]纤维素是葡萄糖通过β-1,4-键连接的聚合物。许多微生物产生水解β-连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合物，使其暴露于纤维二糖水解酶攻击(attack)。纤维二糖水解酶从纤维素聚合物的末端顺序地释放纤维二糖的分子。纤维二糖是水溶性的β_1，4-连接的葡萄糖二聚体。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。[0009]将含木素纤维素原料(lignocellulosicfeedstock)转化为乙醇具有以下优势:大量原料现成可用，可以理想地避免燃烧或填埋材料，以及乙醇燃料的清洁性。木材、农业残余物、草本作物和城市固体废物被认为是用于乙醇生产的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦将纤维素转化成葡萄糖，葡萄糖容易地由酵母发酵成乙醇。[0010]W02011/057140公开了一种烟曲霉纤维二糖水解酶I及其基因。W02011/057140公开了一种烟曲霉纤维二糖水解酶II及其基因。W02005/047499公开了一种烟曲霉β-葡糖苷酶及其基因。W02006/078256公开了烟曲霉GHlO木聚糖酶。W02011/057140公开了一种烟曲霉β_木糖苷酶及其基因。W02011/041397公开了具有纤维素分解增强活性的青霉属种(Penicillliumsp.)GH61多肽及其基因。[0011]在本领域中，需要新的纤维素分解酶组合，其可更有效地分解纤维素材料。[0012]本发明提供了纤维素分解酶组合物，和产生和使用所述组合物的方法。【
发明内容】[0013]本发明涉及酶组合物,其包含(i)烟曲霉(Aspergillusfumigatus)纤维二糖水解酶I;(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II;(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；和(iv)具有纤维素分解增强活性的青霉属种GH61多肽；或其同源物。[0014]本发明亦涉及重组丝状真菌宿主细胞，其包含多核苷酸，所述多核苷酸编码(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I;(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II;(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；和(iV)具有纤维素分解增强活性的青霉属种GH61多肽；或其同源物。[0015]本发明亦涉及产生酶组合物的方法，其包括:(a)在有助于产生所述酶组合物的条件下培养本发明的丝状真菌宿主细胞；和任选地(b)回收所述酶组合物。[0016]本发明亦涉及用于降解纤维素材料的工艺，其包括用本发明的酶组合物处理所述纤维素材料。[0017]本发明亦涉及用于产生发酵产物的方法，其包括:(a)用本发明的酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收发酵产物。[0018]本发明进一步涉及发酵纤维素材料的工艺，其包括用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵纤维素材料，其中所述纤维素材料经本发明的酶组合物糖化。【专利附图】【附图说明】[0019]图1显示质粒pJfyS139的限制性酶切图。[0020]图2显示质粒pJfyS142的限制性酶切图。[0021]图3显示质粒pJfyS144的限制性酶切图。[0022]图4显示质粒pDM286的限制性酶切图。[0023]图5显示质粒pDFngll3_3的限制性酶切图。[0024]图6显示质粒pSMail39的限制性酶切图。[0025]图7显示质粒pSMail43的限制性酶切图。[0026]图8显示质粒pSMai229的限制性酶切图。[0027]图9显示质粒pAG57的限制性酶切图。[0028]图10显示质粒pDFngl24_l的限制性酶切图。[0029]图11显示质粒pSaMe-AFGHIO的限制性酶切图。[0030]图12显示包含烟曲霉纤维二糖水解酶I;烟曲霉纤维二糖水解酶II;烟曲霉β-葡糖苷酶变体；具有纤维素分解增强活性的青霉属种GH61多肽，烟曲霉木聚糖酶，和烟曲霉β-木糖苷酶的酶组合物(“酶组合物#1”)与包含棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)GHlO木聚糖酶和里氏木霉(Trichodermareesei)纤维素酶制备物(含有烟曲霉β-葡糖苷酶和桔橙(Thermoascusaurantiacus)嗜热子囊菌GH61A多肽))的共混物的酶组合物(“酶组合物#2”)对经预处理的玉米秸杆(PCS)的百分比转化率的比较。[0031]定义[0032]乙酰木聚糖酯酶:术语“乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶(EC3.1.1.72)，其催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸Ct-萘酯(alpha-napthylacetate)和乙酸对硝基苯酯(p-nitrophenylacetate)的水解。就本发明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用含有0.01%TWEENTM20(聚氧乙烯山梨坦单月桂酸酯)的50mM乙酸钠pH5.0中的0.5mM乙酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的乙酰木聚糖酯酶定义为能够在pH5,25°C每分钟释放I微摩尔对硝基苯酹阴离子(p-nitrophenolateanion)的酶量。[0033]等位变体(allelicvariant):术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种(例如几种)可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。[0034]a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶:术语“a_L_阿拉伯呋喃糖苷酶”意指a_L_阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC3.2.1.55)，其催化对a-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性a-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对a-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，3)-和/或(1，5)_键的a-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、C1-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、a-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或a-L-阿拉伯聚糖酶。就本发明而言，a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用总体积200μI中的每ml的IOOmM乙酸钠pH5中5mg的中等粘度小麦阿拉伯木聚糖(MegazymeInternationalIreland,Ltd.,Bray,C0.Wicklow,Ireland)在4CTC进行30分钟，接着通过AMINEX?HPX-87H柱层析(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)的阿拉伯糖分析来确定的。[0035]α-葡糖醛酸糖苷酶:术语“α-葡糖醛酸糖苷酶”意指a_D_葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(alpha-D-glucosiduronateglucuronohydrolase)(EC3.2.1.139)，其催化a-D-葡糖醛酸糖苷水解为D-葡糖醛酸和醇。就本发明而言，α-葡糖醛酸糖苷酶活性是根据deVries,1998,J.Bacteriol.180:243-249确定的。一个单位的α_葡糖醒酸糖苷酶等于能够在pH5，40°C每分钟释放I微摩尔葡糖醛酸或4-0-甲基葡糖醛酸的酶量。[0036]天冬氨酸蛋白酶:术语“天冬氨酸蛋白酶”意指使用天冬氨酸残基催化肽和蛋白中肽键的水解的蛋白酶。天冬氨酸蛋白酶是一个蛋白酶家族，其使用天冬氨酸残基来催化水解其肽底物。一般而言，其在活性位点具有两个高度保守的天冬氨酸，并在酸性PH具有最适活性(Szecsi,1992,Scand.J.Clin.Lab.1nvest.Supp1.210:5-22)。就本发明而言，天冬氨酸蛋白酶活性根据由Aikawa等，2001,J.Biochem.129:791-794描述的方法确定。[0037]β-葡糖苷酶:术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucosideglucohydrolase)(E.C.N0.3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。就本发明而言，葡糖苷酶根据Venturi等，2002，Extracellularbeta-D-glucosidasefromChaetomiumthermophilumvar.coprophilum:production,purificationandsomebiochemicalproperties,J.BasicMicrobiol.42:55-66的方法使用对硝基苯基-β_D_葡糖吡喃糖苷作为底物确定。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25°C，pH4.8，在含有0.01%TWEEN?20(聚氧乙烯山梨坦单月桂酸酯)的50mM柠檬酸钠中从作为底物的ImM对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚阴离子。[0038]β-木糖苷酶:术语“β-木糖苷酶”意指β-D木糖苷木糖水解酶(β-D-xylosidexylohydrolase)(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(I—4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以从非还原端去除连续的D-木糖残基。就本发明而言，一个单位的β_木糖苷酶定义为在40。。，ρΗ5在含有0.01%TWEEN?20的IOOmM柠檬酸钠中从作为底物的ImM对硝基苯基-β-D-木糖苷每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚阴离子。[0039]cDNA:术语“cDNA”意指能够通过反转录从得自真核或原核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少可存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体,其通过一系列的步骤包括剪接进行加工，然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。[0040]纤维二糖水解酶:术语“纤维二糖水解酶”意指1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(I,4-beta-D-glucancellobiohydrolase)(E.C.3.2.1.91和E.C.3.2.1.176)，其催化纤维素、纤维寡糖，或任何包含β-1，4-连接的葡萄糖的聚合物中的1，4-β-D-糖苷键的水解，从链的还原或非还原末端释放纤维二糖(Teeri,1997,Crystallinecellulosedegradation:Newinsightintothefunctionofcellobiohydrolases,TrendsinBiotechno1gyI5:160-167；Teeri等,1998,Trichodermareeseicellobiohydrolases:whysoefficientoncrystallinecellulose?,Biochem.Soc.Trans.26:173-178)。根据Lever等，1972，Anal.Biochem.47:273-279;vanTilbeurgh等，1982，FEBSLettersl49:152-156；vanTilbeurgh和Claeyssens,1985，FEBSLettersl87:283-288；以及Tomme等，1988，Eur.J.Biochem.170:575-581描述的方法确定纤维二糖水解酶活性。在本发明中，Tomme等的方法可用于确定纤维二糖水解酶活性。[0041]纤维素分解酶或纤维素酶:术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”意指一种或多种(例如几种)水解纤维素材料的酶。此类酶包括内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶，β_葡糖苷酶，或其组合。测量纤维素分解活性的两种基本方法包括:(I)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如Zhang等，Outlookforcellulaseimprovement:Screeningandselectionstrategies,2006,BiotechnologyAdvances24:452-481所综述的。总纤维素分解活性通常是使用不溶性底物来测定的，所述底物包括Whatmanl号滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、经预处理的木素纤维素等。最常见的总纤维素分解活性测定法是使用Whatmanl号滤纸作为底物的滤纸测定法。该测定法是由InternationalUnionofPureandAppliedChemistry(IUPAC)(Ghose,1987，Measurementofcellulaseactivities,PureApp1.Chem.59:257-68)确立的。[0042]就本发明而言，纤维素分解酶活性通过测量在下述条件下由纤维素分解酶进行的纤维素材料水解相比于未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解的增加来确定:l_50mg的纤维素分解酶蛋白/g的PCS中纤维素(或其它经预处理的纤维素材料)在合适的温度，例如50°C、55°C或60°C进行3-7日。通常条件为:1ml反应液，经洗涤或未洗涤的PCS，5%不溶性固形物，50mM乙酸钠pH5，lmMMnSO4,50°C、55°C或60°C，72小时，通过AMINEX?HPX-87H柱(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)进行糖分析。[0043]纤维素材料:术语“纤维素材料”意指包含纤维素的任何材料。生物质的初生细胞壁(primarycellwall)中的主要多糖是纤维素,其次最丰富的是半纤维素,而第三是果胶。次生细胞壁(secondarycellwall)在细胞停止生长后产生,其同样含有多糖并通过共价交联至半纤维素的聚合木质素而加强。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，因此是直链β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，形成具有多种多样的取代基的复杂分支结构。尽管纤维素通常是多形的，但存在于植物组织中的纤维素主要是平行葡聚糖链的不溶晶体基质。半纤维素通常与纤维素以及其它半纤维素以氢键相连，其帮助稳定细胞壁基质。[0044]纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴，或树的叶、枝和木材。纤维素材料可以是，但不限于，农业残余物、草本材料(包括能源作物)、城市固体废物、纸浆与造纸厂残余物、废纸和木材(包括林业残余物)(参见，例如，Wiselogel等，1995，于HandbookonBioethanol(CharlesE.Wyman编)，pp.105-118，Taylor&Francis,WashingtonD.C.；Wyman,1994，BioresourceTechnology50:3-16；Lynd,1990，AppliedBiochemistryandBiotechno1gy24/25:695-719；Mosier等，1999，RecentProgressinBioconversionofLignocellulosicsj于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,T.Scheper主编，Volume65，pp.23-40，Springer-VerlagjNewYork)。在本文中应理解的是，纤维素可以是任何形式的木素纤维素，木素纤维素是一种在混合基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。在一个优选的方面，纤维素材料是任何生物质材料。在另一个优选的方面，所述纤维素材料是木素纤维素，其包含纤维素、半纤维素和木质素。[0045]在一个方面，纤维素材料是农业残余物。在另一个方面，纤维素材料是草本材料(包括能源作物)。在另一个方面，纤维素材料是城市固体废物。在另一个方面，纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。在另一个方面，纤维素材料是废纸。在另一个方面，纤维素材料是木材(包括林业残余物)。[0046]在另一个方面，纤维素材料是芦竹(arundo)。在另一个方面，纤维素材料是蔗渣。在另一个方面，纤维素材料是竹子。在另一个方面，纤维素材料是玉米穗轴。在另一个方面，纤维素材料是玉米纤维。在另一个方面，纤维素材料是玉米秸杆。在另一个方面，纤维素材料是芒草属。在另一个方面，纤维素材料是橙皮。在另一个方面，纤维素材料是稻杆。在另一个方面，纤维素材料是柳枝稷(switchgrass)。在另一个方面，纤维素材料是麦杆。[0047]在另一个方面，纤维素材料是白杨。在另一个方面，纤维素材料是桉树。在另一个方面，纤维素材料是揪树。在另一个方面，纤维素材料是松树。在另一个方面，纤维素材料是杨树。在另一个方面，纤维素材料是云杉。在另一个方面，纤维素材料是柳树。[0048]在另一个方面，纤维素材料是藻类纤维素。在另一个方面，纤维素材料是细菌纤维素。在另一个方面，纤维素材料是棉线头(cottonlinter)。在另一个方面，纤维素材料是滤纸。在另一个方面，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面，纤维素材料是磷酸处理的纤维素。[0049]在另一个方面，纤维素材料是水生生物质。如用于本文中，“水生生物质”意指在水生环境中由光合作用过程产生的生物质。水生生物质可为藻类、挺水植物(emergentplant)、浮叶植物(floating-leafplant)或沉水植物(submergedplant)。[0050]纤维素材料可以按原样(asis)使用或进行预处理，预处理使用本领域已知的常规方法，如本文所述。在一个优选的方面，预处理纤维素材料。[0051]编码序列:术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框以起始密码子如ATG、GTG或TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG或TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。[0052]调控序列(controlsequence):术语“调控序列”意指对编码多肽的多核苷酸表达是必需的核酸序列。各个调控序列对于编码所述多肽的多核苷酸可以是天然的(即，来自同一基因)或外来的(即，来自不同基因)，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外来的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以配备用于引入特异性限制位点的接头，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的多核苷酸编码区的连接。[0053]内切葡聚糖酶:术语“内切葡聚糖酶”意指内切_1，4-(1，3;l，4)-13-D_葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-1,4-β-D-glucan4-glucanohydrolase)(E.C.3.2.1.4),其催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉(Iichenin)中的1，4-β-D-糖苷键、混合的β-1，3葡聚糖例如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纤维素组分的其它植物材料中的β-1,4键的内水解(endohydrolysis)。内切葡聚糖酶活性可通过测量底物粘度的减少或由还原糖测定法(Zhang等，2006,BiotechnologyAdvances24:452-481)确定的还原端增加来确定。就本发明而言，根据Ghose,1987,PureandApp1.Chem.59:257-268的方法，在pH5，40°C使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来确定内切葡聚糖酶活性。[0054]表达:术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。[0055]表达载体:术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的调控序列可操作地连接。[0056]家族61糖苷水解酶:术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”在本文中定义为根据HenrissatB.,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316,及HenrissatB.和BairochA.,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。该家族中的酶原先基于在一个家族成员测量到的非常弱的内切-1，4-β-D葡聚糖酶活性而归类为糖苷水解酶家族。这些酶的结构和作用模式是非经典的，且它们无法视为真正的(bonafide)糖苷酶。然而，基于当与纤维素酶或纤维素酶的混合物一同使用时，其增强木素纤维素分解的能力，它们被保留在CAZy分类中。[0057]阿魏酸酯酶:术语“阿魏酸酯酶(feruloylesterase)”意指4_羟基_3_甲氧基肉桂酰-糖水解酶(EC3.1.1.73)，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基团从酯化的糖(其在天然生物质底物中通常为阿拉伯糖)的水解，以产生阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也称作阿魏酸酯酶(ferulicacidesterase)、羟基肉桂酰基酯酶、FAE-1I1、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-1或FAE-1I。就本发明而言，阿魏酸酯酶活性是使用50mM乙酸钠pH5.0中的0.5mM阿魏酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的阿魏酸酯酶等于能够在pH5，25°C每分钟释放I微摩尔对硝基苯酚阴离子的酶量。[0058]侧翼:术语“侧翼”意指在特定DNA序列、基因座或基因任一侧延伸的DNA序列。侧翼DNA紧密邻接着另一个DNA序列、基因座或基因，其即将整合入丝状真菌细胞的基因组。[0059]片段:术语“片段”意指从成熟多肽主体的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有酶活性。在一个方面，片段含有酶的成熟多肽的至少85%，例如至少90%或至少95%的氨基酸残基。[0060]半纤维素分解酶或半纤维素酶:术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指一种或多种(例如几种)水解半纤维素材料的酶。参见，例如Shallom,D.和Shoham,Y.Microbialhemicellulases.CurrentOpinionInMicrobiology,2003，6(3):219-228)。半纤维素酶是植物生物质降解中的关键成分。半纤维素酶的实例包括但不限于乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。这些酶的底物，半纤维素，是支化和直链多糖的混杂集团，这些多糖通过氢键键合于植物细胞壁中的纤维素微纤维，将其交联为鲁棒(robust)的网络。半纤维素亦共价地附于木质素，与纤维素一同形成高度复杂的结构。半纤维素的多变的结构和组织形式需要许多酶的协同作用使其完全降解。半纤维素酶的催化模块为水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或水解乙酸或阿魏酸侧基的酯连接的糖酯酶(CE)。这些催化模块，基于其一级结构的同源性，可指派为GH和CE家族。一些家族，具有总体上类似的折叠，可进一步归类为宗族(clan)，以字母标记(例如，GH-A)。最具信息性和最新的这些和其他糖活性酶的分类可在Carbohydrate-ActiveEnzymes(CAZy)数据库获得。半纤维素分解酶活性可根据Ghose和Bisaria,1987,Pure&Appl.Chem.59:1739-1752在合适的温度，例如50°C、55°C或60°C，或合适的pH，例如5.0或5.5进行测量。[0061]高严格条件:术语“高严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS,200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和50%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2XSSC、0.2%SDS在65°C将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。[0062]同源3’或5’区:术语“同源3’区”意指DNA片段，其与基因组中的区具有相同序列或具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的序列同一性，且当与同源5’区组合时，可通过同源重组靶向整合一片DNA至基因组中的特定位点。术语“同源5’区”指DNA片段，其与基因组中的区具有相同序列，且当与同源3’区组合时，可通过同源重组靶向整合一片DNA至基因组中的特定位点。同源5’和3’区必须在基因组中相连，这意味着它们在同一染色体上，并彼此相距在200kb以内(withinatleast200kbofoneanother)。[0063]同源侧翼区:术语“同源侧翼区`”意指DNA片段，其与基因组中的区相同或具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的序列同一性，且位于紧接着胞外DNA靶向整合入的基因组中特定位点的上游或下游。[0064]同源重复:术语“同源重复”意指在引入宿主细胞的重组DNA中重复至少两次的DNA片段，且其可通过同源重组协助DNA的丧失，即，将选择标志物插入两个同源重复之间。同源重复亦称为直接重复。[0065]宿主细胞:术语“宿主细胞”意指任何适合于使用包含编码多肽的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的由于在复制中发生的突变而不同于亲本细胞的任何后代。[0066]分离的:术语“分离的”意指以不在自然界出现的形式或环境存在的物质。分离的物质的非限定性实例包括(I)任何非天然存在的物质，(2)任何至少部分地与一种或多种或全部与其天然伴随的天然存在的成分脱离的物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)任何相对于自然界中所见的该物质而言经过了人工修饰的物质；或(4)任何通过相对于与其天然伴随的其他组分增加该物质的量(例如，在宿主细胞中重组产生；编码该物质的基因的多拷贝；使用比与编码该物质的基因天然伴随的启动子更强的启动子)而修饰的物质。[0067]低严格条件:术语“低严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS,200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和25%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2XSSC、0.2%SDS在50°C将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。[0068]成熟多肽:术语“成熟多肽”意指以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽，所述修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一个方面，根据预测SEQIDNO:2的氨基酸I至26是信号肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineeringlO:1-6)，烟曲霉纤维二糖水解酶I的成熟多肽是SEQIDN0:2的氨基酸27至532。在另一个方面，根据预测SEQIDNO:4的氨基酸I至19是信号肽的SignalP程序，烟曲霉纤维二糖水解酶II的成熟多肽是SEQIDNO:4的氨基酸20至454。在另一个方面，根据预测SEQIDNO:6的氨基酸I至19是信号肽的SignalP程序，烟曲霉β-葡糖苷酶的成熟多肽是SEQIDNO:6的氨基酸20至863。在另一个方面，根据预测SEQIDNO:8的氨基酸I至25是信号肽的SignalP程序，青霉属种GH61多肽的成熟多肽是SEQIDNO:8的氨基酸26至253。在另一个方面，根据预测SEQIDNO:10的氨基酸I至17是信号肽的SignalP程序，烟曲霉木聚糖酶I的成熟多肽是SEQIDNO:10的氨基酸17至364。在另一个方面，根据预测SEQIDNO:12的氨基酸I至19是信号肽的SignalP程序，烟曲霉木聚糖酶II的成熟多肽是SEQIDNO:12的氨基酸20至323。在另一个方面，根据预测SEQIDNO:14的氨基酸I至19是信号肽的SignalP程序，烟曲霉木聚糖酶III的成熟多肽是SEQIDNO:14的氨基酸20至397。在另一个方面，根据预测SEQIDNO:16的氨基酸I至20是信号肽的SignalP程序，烟曲霉β-木糖苷酶的成熟多肽是SEQIDNO:20的氨基酸21至792。[0069]在另一个方面，根据预测SEQIDNO:18的氨基酸I至17是信号肽的SignalP程序，里氏木霉纤维二糖水解酶I的成熟多肽是SEQIDNO:18的氨基酸18至514。在另一个方面，根据预测SEQIDNO:20的氨基酸I至18是信号肽的SignalP程序，里氏木霉纤维二糖水解酶Π的成熟多肽是SEQIDNO:20的氨基酸19至471。在另一个方面，根据预测SEQIDNO:22的氨基酸I至19是信号肽的SignalP程序，里氏木霉β-葡糖苷酶的成熟多肽是SEQIDNO:22的氨基酸20至744。在另一个方面，根据预测SEQIDΝ0:24的氨基酸I至19是信号肽的SignalP程序，里氏木霉木聚糖酶I的成熟多肽是SEQIDNO:24的氨基酸20至229。在另一个方面，根据预测SEQIDNO:26的氨基酸I至19是信号肽的SignalP程序，里氏木霉木聚糖酶II的成熟多肽是SEQIDNO:26的氨基酸20至223。在另一个方面，根据预测SEQIDNO:28的氨基酸I至16是信号肽的SignalP程序，里氏木霉木聚糖酶III的成熟多肽是SEQIDNO:28的氨基酸17至347。在另一个方面，根据预测SEQIDNO:30的氨基酸I至20是信号肽的SignalP程序，里氏木霉β-木糖苷酶的成熟多肽是SEQIDNO:30的氨基酸21至797。[0070]在本领域中已知宿主细胞可产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种成熟多肽(即具有不同的C端和/或N端氨基酸)的混合物。[0071]成熟多肽编码序列:术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，根据预测SEQIDNO:1的核苷酸I至78编码信号肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，见上)，烟曲霉纤维二糖水解酶I的成熟多肽编码序列是SEQIDNO:1的核苷酸79至1956或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQIDN0:3的核苷酸I至57编码信号肽的SignalP程序，烟曲霉纤维二糖水解酶II的成熟多肽编码序列是SEQIDNO:3的核苷酸58至1700或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQIDNO:5的核苷酸I至57编码信号肽的SignalP程序，烟曲霉β-葡糖苷酶的成熟多肽编码序列是SEQIDNO:5的核苷酸58至2580或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQIDNO:7的核苷酸I至75编码信号肽的SignalP程序，青霉属种GH61多肽的成熟多肽编码序列是SEQIDNO:7的核苷酸76至832或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQIDNO:9的核苷酸I至51编码信号肽的SignalP程序，烟曲霉木聚糖酶I的成熟多肽编码序列是SEQIDNO:9的核苷酸52至1145或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQIDNO:11的核苷酸I至57编码信号肽的SignalP程序，烟曲霉木聚糖酶II的成熟多肽编码序列是SEQIDNO:11的核苷酸58至1400或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQIDNO:13的核苷酸I至106编码信号肽的SignalP程序，烟曲霉木聚糖酶III的成熟多肽编码序列是SEQIDNO:13的核苷酸107至1415或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQIDNO:15的核苷酸I至60编码信号肽的SignalP程序，烟曲霉β-木糖苷酶的成熟多肽编码序列是SEQIDNO:19的核苷酸61至2373或其cDNA序列。[0072]在另一个方面，根据预测SEQIDNO:17的核苷酸I至51编码信号肽的SignalP程序，里氏木霉纤维二糖水解酶I的成熟多肽编码序列是SEQIDNO:17的核苷酸52至1545或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQIDNO:19的核苷酸I至54编码信号肽的SignalP程序，里氏木霉纤维二糖水解酶II的成熟多肽编码序列是SEQIDNO:19的核苷酸55至1608或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQIDNO:21的核苷酸I至57编码信号肽的SignalP程序，里氏木霉β-葡糖苷酶的成熟多肽编码序列是SEQIDΝ0:21的核苷酸58至2612或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQIDNO:23的核苷酸I至57编码信号肽的SignalP程序，里氏木霉木聚糖酶I的成熟多肽编码序列是SEQIDN0:23的核苷酸58至749或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQIDNO:25的核苷酸I至57编码信号肽的SignalP程序，里氏木霉木聚糖酶II的成熟多肽编码序列是SEQIDN0:25的核苷酸58至778或其cDNA序列。在另一个`方面，根据预测SEQIDNO:27的核苷酸I至48编码信号肽的SignalP程序，里氏木霉木聚糖酶III的成熟多肽编码序列是SEQIDNO:27的核苷酸49至1349或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQIDNO:29的核苷酸I至60编码信号肽的SignalP程序，里氏木霉β-木糖苷酶的成熟多肽编码序列是SEQIDNO:39的核苷酸61至2391或其cDNA序列。[0073]中等严格条件:术语“中等严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和35%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2XSSC、0.2%SDS在55°C将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。[0074]中等-高严格条件:术语“中等-高严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和35%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2XSSC、0.2%SDS在60°C将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。[0075]核酸构建体:术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或其经修饰以本来不会存在于自然界中的方式含有核酸的区段，或其为合成的，其包含一个或多个(例如几个)调控序列。[0076]可操作地连接:术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达。[0077]具有纤维素分解增强活性的多肽:术语“具有纤维素分解增强的多肽”意指催化具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解的增强的GH61多肽。就本发明而言，通过测量来自由纤维素分解酶在下述条件下与对照水解相比较水解纤维素材料的还原糖增加或纤维二糖与葡萄糖的总量增加来确定纤维素分解增强活性:l-50mg总蛋白/gPCS中纤维素，其中总蛋白包含50-99.5%w/w的纤维素分解酶蛋白，及0.5-50%w/w的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的蛋白质，在合适的温度，例如50°C、55°C或60°C，和pH，例如5.0或5.5历时1-7天，所述对照水解用等量的总蛋白加载量而无纤维素分解增强活性(l-50mg纤维素分解蛋白/gPCS中纤维素)进行。在一个优选的方面，使用在总蛋白重量的2-3%的米曲霉葡糖苷酶(根据WO02/095014在米曲霉中重组产生)或者总蛋白质量的2_3%的烟曲霉葡糖苷酶(如WO2002/095014所述在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白加载量存在下的CiiLLLK1LASTK1.5L(NovozymesA/S,BagSVierd,Denmark)的混合物作为纤维素分解活性的来源。[0078]具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过降低达到相同水解水平所需的纤维素分解酶的量而增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解，优选降低至少1.01倍，例如至少1.05倍，至少1.10倍，至少1.25倍，至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少10倍，或至少20倍。[0079]预处理的玉米秸杆:术语“PCS”或“预处理的玉米秸杆”意指通过用热和稀硫酸处理、碱预处理或中性预处理的源自玉米秸杆的纤维素材料。[0080]序列同一性:参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。[0081]就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000，TrendsGenet.16:276-277),优选5.0.0版或更新版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来测定。使用的参数为缺口罚分(gappenalty)10,缺口延伸罚分(gapextensionpenalty)0.5和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longestidentity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一'丨生百分比，并计算如下:[0082](同样的残基X100)/(比对长度一比对中缺口的总数)[0083]就本发明而言，两个核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000，见上文)，优选5.0.0版或更新版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来测定。使用的参数为缺口罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下:[0084](同样的脱氧核糖核苷酸X100)/(比对长度一比对中缺口的总数)[0085]亚序列:术语“亚序列(subsequence)”意指从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(例如几个)核苷酸的多核苷酸；其中所述亚序列编码具有酶活性的片段。在一个方面，亚序列含有酶的成熟多肽编码序列的至少85%，例如至少90%，或至少95%的核苷酸。[0086]枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶:术语“枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶”意指与枯草杆菌蛋白酶具有类似的底物特异性的蛋白酶，其使用丝氨酸残基催化肽和蛋白中的肽键水解。枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(枯草蛋白酶)是丝氨酸蛋白酶，其表征为三个氨基酸天冬氨酸、组氨酸和丝氨酸的催化三联体(triad)。这些催化性残基的排列与来自地衣芽孢杆菌的原型枯草杆菌蛋白酶相同(Siezen和Leunissen,1997,ProteinScience6:501-523)。枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶活性可使用IOOmMNaCl-1OOmMMOPSpH7.0中的合成底物N-玻拍酸-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-对硝基苯胺(N-succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilide,AAPF)(BachemAG,Bubendorf,Switzerland)在5CTC进行3小时然后测量405nm处的吸光度来确定。[0087]靶向整合:术语“靶向整合”意指胞外DNA在限定的基因组基因座的稳定整合。[0088]转化体:术语“转化体”意指摄取胞外DNA(外源、人工或修饰的)并表达其中含有的基因的细胞。[0089]转化:术语“转化”意指将胞外DNA引入细胞，即，由通过细胞膜摄取并从其周围直接摄取，组入和表达外源遗传材料(外源DNA)导致的细胞的遗传改变。[0090]胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶:术语“胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶”意指具有与胰蛋白酶类似的底物特异性的蛋白酶，其使用丝氨酸残基催化肽和蛋白中的肽键水解。就本发明而言，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶活性根据Dienes等，2007，EnzymeandMicrobialTechnology40:1087-1094所述的步骤来确定。[0091]变体:术语“变体”意指在一个或多个(例如几个)位置包含改变，即取代、插入和/或缺失的具有酶活性的多肽。取代意指将占据某位置的氨基酸用不同的氨基酸替代；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而插入意指在邻接并紧接着占据某位置的氨基酸之后添加氨基酸。[0092]非常高严格条件:术语“非常高严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和50%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2XSSC.0.2%SDS在70°C将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。[0093]非常低严格条件:术语“非常低严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和25%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2XSSC、0.2%SDS在45°C将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。[0094]含木聚糖材料:术语“含木聚糖材料”意指任何包含含有β-(1-4)连接的木糖残基骨架的植物细胞壁多糖的材料。陆生植物的木聚糖是具有β-(1-4)-吡喃木糖骨架的杂聚物，其由短的糖链分支。它们包括D-葡糖醛酸或其4-0-甲基醚，L-阿拉伯糖和/或多种包含D-木糖、L-阿拉伯糖、D-或L-半乳糖和D-葡萄糖的寡糖。木聚糖类型的多糖可分为均木聚糖(homoxylan)和杂木聚糖(heteroxylan),后者包括葡糖醒酸木聚糖，(阿拉伯)葡糖醛酸木聚糖，(葡糖醛酸)阿拉伯木聚糖，阿拉伯木聚糖和复合杂木聚糖。参见，例如Ebringerova等,2005,Adv.Polym.Sc1.186:1-67。[0095]在本发明的工艺中，可使用任何含有木聚糖的材料。在一个优选的方面，所述含木聚糖材料是木素纤维素。[0096]木聚糖降解活性或木聚糖分解活性:术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含木聚糖材料的生物学活性。两种测定木聚糖分解活性的基础方法包括:(I)测定总木聚糖分解活性，和(2)测定单独的木聚糖分解活性(例如内切木聚糖酶、β_木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡糖醒酸酯酶(a-glucuronylesterase))。最近在木聚糖分解酶测定法的进展总结于几个公开文献中，包括Biely和Puchard,Recentprogressintheassaysofxylanolyticenzymes,2006,JournaloftheScienceofFood和Agriculture86(11):1636-1647;Spanikova和Biely,2006,Glucuronoylesterase-NovelcarbohydrateesteraseproducedbySchizophylIumcommune,FEBSLetters580(19):4597-4601；Herrmann,Vrsanska,Jurickova,Hirsch,Biely和Kubicek,1997，Thebeta-D-xylosidaseofTrichodermareeseiisamultifunctionalbeta—D—xylanxylohydrolase,BiochemicalJournal321:375-381。[0097]总木聚糖降解活性可通过确定从多种类型的木聚糖形成的还原糖来测量，所述木聚糖包括例如燕麦小麦(oatspelt)、山毛榉木(beechwood)和落叶松木(Iarchwood)木聚糖，或者可通过光度法确定从多种共价染色的木聚糖释放出的染色的木聚糖片段来测量。最常见的总木聚糖分解活性测定法基于从多聚的4-0-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖，如Bailey,Biely,Poutanen,1992，Interlaboratorytestingofmethodsforassayofxylanaseactivity,JournalofBiotechnology23(3):257-270中所述。木聚糖酶活性亦可用0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物在37°C在0.01%TRITON?X-100(4-(I,1,3,3-四甲基丁基)`苯基-聚乙二醇)和200mM磷酸钠缓冲液pH6中来确定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37°C，pH6在200mM磷酸钠pH6缓冲液中从作为底物的0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青精。[0098]就本发明而言，木聚糖降解活性是通过测量由木聚糖降解酶在下述通常条件下造成的桦木木聚糖(SigmaChemicalC0.,Inc.,St.Louis,MO,USA)水解的增加来确定的:Iml反应,5mg/ml底物(总固形物),5mg木聚糖分解蛋白质/g底物，50mM乙酸钠，pH5,50°C,24小时，如Lever,1972，Anewreactionforcolorimetricdeterminationofcarbohydrates,Anal.Biochem47:273-279所述使用对羟基苯甲酸酸餅(PHBAH)测定法进行糖分析。[0099]木聚糖酶:术语“木聚糖酶”意指1，4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(I,4-β-D-xylan-xylohydrolase)(E.C.3.2.1.8),其催化木聚糖中I,4_β-D-木糖苷键的内水解。就本发明而言，木聚糖酶活性是使用0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物在混合基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料确定的。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37°C，pH6在200mM磷酸钠pH6缓冲液中从作为底物的0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青精。[0100]发明详述[0101]本发明涉及酶组合物，其包含(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I;(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II;(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；和(iV)具有纤维素分解增强活性的青霉属种(emersonii)GH61多肽；或其同源物。[0102]在一个方面，所述重组木霉属宿主细胞进一步包含烟曲霉木聚糖酶，烟曲霉β-木糖苷酶，或其组合；或其同源物。[0103]本发明的酶组合物在分解纤维素材料方面比由里氏木霉产生的纤维素分解酶组合物更加有效。[0104]酶组合物[0105]在本发明中可使用任何烟曲霉纤维二糖水解酶I，烟曲霉纤维二糖水解酶II，烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；具有纤维素分解增强活性的青霉属种(emerSonii)GH61多肽，烟曲霉木聚糖酶，或烟曲霉木糖苷酶，或其同源物。[0106]在一个方面，所述烟曲霉纤维二糖水解酶I或其同源物选自下组:(i)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为SEQIDNO:2的成熟多肽；(ii)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。[0107]在另一个方面，所述烟曲霉纤维二糖水解酶II或其同源物选自下组:(i)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为SEQIDNO:4的成熟多肽；(ii)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDN0:4的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂父。[0108]在另一个方面，所述烟曲霉葡糖苷酶或其同源物选自下组:(i)葡糖苷酶，其包含或组成为SEQIDNO:6的成熟多肽；(ii)β-葡糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDΝ0:6的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。[0109]在另一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的青霉属种(emerSonii)GH61多肽或其同源物选自下组:(i)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含或组成为SEQIDN0:8的成熟多肽；(ii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:8的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:7的成熟多肽编码序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQIDNO:7的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。[0110]在另一个方面，所述烟曲`霉木聚糖酶或其同源物选自下组:(i)木聚糖酶，其包含或组成为SEQIDNO:10,SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽；(ii)木聚糖酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDN0:9、SEQIDNO:11或SEQIDNO:13的成熟多肽编码序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQIDNO:9,SEQIDNO:11或SEQIDNO:13的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。[0111]在另一个方面，所述烟曲霉木糖苷酶或其同源物选自下组:(i)木糖苷酶，其包含或组成为SEQIDNO:16的成熟多肽；(ii)β-木糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:16的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:15的成熟多肽编码序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQIDNO:15的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。[0112]可利用SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13或15的多核苷酸或其亚序列，以及SEQIDΝ0:2、4、6、8、10、12、14或16的多肽或其片段设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码酶的DNA。具体而言，根据标准的Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以鉴定和从其中分离相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少15，例如至少25，至少35，或至少70个核苷酸。优选地，所述核酸探针是至少100个核苷酸的长度，例如，至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少400个核苷酸，至少500个核苷酸，至少600个核苷酸，至少700个核苷酸，至少800个核苷酸，或至少900个核苷酸的长度。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。这些探针涵盖于本发明中。[0113]可从基因组DNA或cDNA文库中筛选与上述探针杂交并且编码酶的DNA。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13或15或其亚序列杂交的克隆或DNA,将所述载体材料用在Sounthern印迹中。[0114]就本发明而言，杂交表示多核苷酸在非常低至非常高的严格条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于:(i)SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13*15;(ii)SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13或15的成熟多肽编码序列其cDNA序列；(iv)它们的全长互补链；或(iv)它们的亚序列。可使用例如X射线胶片(X-rayfilm)或其他任何本领域中已知的检测手段检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。[0115]在一个方面，所述核酸探针是SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13或15，或其成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核酸探针是编码SEQIDN0:2、4、6、8、10、12、14或16的多肽，其成熟多肽，或其片段的多核苷酸。[0116]用于分离或克隆多核苷酸的技术在本领域中是已知的，并包括从基因组分离DNA或cDNA,或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆多核苷酸。参见，例如，Innis等，1990，PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork。可以使用其它核酸扩增方法，如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligatedactivatedtranscription；LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。所述多核苷酸可为所述多核苷酸的多肽编码区的等位变体或种变体(speciesvariant)。[0117]可使用上述酶(或蛋白)的蛋白质工程改造的变体。[0118]在一个方面，所述变体为烟曲霉葡糖苷酶变体。在另一个方面，所述烟曲霉β-葡糖苷酶变体在对应于SEQIDΝ0:6的位置100、283、456、和512的一个或多个(几个)位置包含取代，其中所述变体具有β_葡糖苷酶活性。[0119]在一个实施方案中，所述变体与亲本葡糖苷酶的氨基酸序列具有至少80%，例如至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，但少于100%的序列同一丨丨生。[0120]在另一个实施方案中，所述变体与的成熟多肽SEQIDΝ0:6具有至少80%，例如至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%,至少98%,至少99%,但少于100%序列同一1丨生。[0121]就本发明而言，使用公开于SEQIDΝ0:6中的成熟多肽以确定在其它β-葡糖苷酶中对应的氨基酸残基。将其它葡糖苷酶的氨基酸序列与公开于SEQIDΝ0:6中的成熟多肽进行比对，并基于该比对，可以使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，J.Mol.Biol.48=443-453)(如用EMBOSS软件包(EMBOSS:欧洲分子生物开放软件套件(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite),Rice等，2000,TrendsGenetl6:276-277)的Needle程序执行，优选为5.0.0版或之后的版本)确定SEQIDNO:6所公开的成熟多肽中任何氨基酸残基对应的氨基酸位置编号。使用的参数为缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。在另一个β-葡糖苷酶中对应氨基酸残基的鉴定可通`过使用数种计算机程序使用其各自的缺省参数进行的多个多肽序列的比对来确定，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(根据log预期白勺多重序列比较，multiplesequencecomparisonbylog_expectation;3.5片反或之后白勺版本；Edgar,2004，NucleicAcidsResearch32:1792-1797),MAFFT(6.857版或之后的版本；Katoh等,2005,NucleicAcidsResearch33:511-518；Katoh和Toh,2007,Bioinformatics23:372-374;Katoh等，2009，MethodsinMolecularBiology537:39-64;KatohandToh,2010，Bioinformatics26:1899-1900)和使用Clustalff的EMBOSSEMMA(1.83或之后；Thompson等，1994，NucleicAcidsResearch22:4673-4680)。[0122]对于氨基酸取代，使用下述命名法:初始氨基酸，位置，取代氨基酸。相应地，在226位用丙氨酸取代苏氨酸命名为“Thr226Ala”或“T226A”。多重突变可以用加号(“+”)分开，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，分别代表205和411位用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)，以及用苯丙氨酸(F)取代丝氨酸(S)。[0123]在一个方面，变体包含在一个或多个(几个)对应于位置100、283、456、和512的位置的取代。在另一个方面，变体包含在对应于位置100、283、456、和512的任何两个位置的取代。在另一个方面，变体包含在对应于位置100、283、456、和512的任何三个位置的取代。在另一个方面，变体包含在对应于位置100、283、456、和512的每位置的取代在的取代.[0124]在另一个方面，变体包含或组成为在对应于位置100的位置的取代。在另一个方面，在对应于位置100的位置的氨基酸被取代为Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gin,Glu,Gly,His,He,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr,或Val,优选为Asp。在另一个方面，S所述变体包含或组成为EQIDN0:6的成熟多肽的取代F100D。[0125]在另一个方面，变体包含或组成为在对应于位置283的位置的取代。在另一个方面，在对应于位置283的位置的氨基酸被取代为Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gin,Glu,Gly,His,He,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr,或Val,优选为Gly。在另一个方面,所述变体包含或组成为SEQIDNO:6的成熟多肽的取代S283G。[0126]在另一个方面，变体包含或组成为在对应于位置456的位置的取代。在另一个方面，在对应于位置456的位置的氨基酸被取代为Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gin,Glu,Gly,His,He,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr,或Val,优选为Glu。在另一个方面，所述变体包含或组成为取代SEQIDNO:6的成熟多肽的N456E。[0127]在另一个方面，变体包含或组成为在对应于位置512的位置的取代。在另一个方面，在对应于位置512的位置的氨基酸被取代为Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gin,Glu,Gly,His,He,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr,或Val,优选为Tyr。在另一个方面,所述变体包含或组成为SEQIDNO:6的成熟多肽的取代F512Y。[0128]在另一个方面，变体包含或组成为在对应于位置100和283的位置的取代，如上述的那些。[0129]在另一个方面，变体包含或组成为在对应于位置100和456的位置的取代，如上述的那些。[0130]在另一个方面，变体包含或组成为在对应于位置100和512的位置的取代，如上述的那些。[0131]在另一个方面，变体包含或组成为在对应于位置283和456的位置的取代，如上述的那些。[0132]在另一个方面，变体包含或组成为在对应于位置283和512的位置的取代，如上述的那些。[0133]在另一个方面，变体包含或组成为在对应于位置456和512的位置的取代，如上述的那些。[0134]在另一个方面，变体包含或组成为在对应于位置100，283，和456的位置的取代，如上述的那些。[0135]在另一个方面，变体包含或组成为在对应于位置100，283，和512的位置的取代，如上述的那些。[0136]在另一个方面，变体包含或组成为在对应于位置100，456，和512的位置的取代，如上述的那些。[0137]在另一个方面，变体包含或组成为在对应于位置283，456，和512的位置的取代，如上述的那些。[0138]在另一个方面，变体包含或组成为在对应于位置100、283、456、和512的位置的取代，如上述的那些。[0139]在另一个方面，变体包含或组成为一个或多个(几个)选自下组的取代:G142S，Q183R,H266Q，和D703G。[0140]在另一个方面，变体包含或组成为SEQIDNO:6的成熟多肽的取代F100D+S283G。[0141]在另一个方面，变体包含或组成为SEQIDNO:6的成熟多肽的取代F100D+N456E。[0142]在另一个方面，变体包含或组成为SEQIDNO:6的成熟多肽的取代F100D+F512Y。[0143]在另一个方面，变体包含或组成为SEQIDNO:6的成熟多肽的取代S283G+N456E。[0144]在另一个方面，变体包含或组成为SEQIDNO:6的成熟多肽的取代S283G+F512Y。[0145]在另一个方面，变体包含或组成为SEQIDNO:6的成熟多肽的取代N456E+F512Y。[0146]在另一个方面，变体包含或组成为SEQIDN0:6的成熟多肽的取代F100D+S283G+N456E。[0147]在另一个方面，变体包含或组成为SEQIDN0:6的成熟多肽的取代F100D+S283G+F512Y。[0148]在另一个方面，变体包含或组成为SEQIDN0:6的成熟多肽的取代F100D+N456E+F512Y。[0149]在另一个方面，变体包含或组成为SEQIDN0:6的成熟多肽的取代S283G+N456E+F512Y。[0150]在另一个方面，变体包含或组成为SEQIDN0:6的成熟多肽的取代F100D+S283G+N456E+F512Y。[0151]所述变体可组成为720至863个氨基酸，例如720至739，740至759，760至779，780至799,800至819，820至839，和840至863个氨基酸。[0152]所述变体可进一步包含在一个或多个(几个)其他位置的改变。[0153]所述酶组合物可进一步包含一个或多个(例如几个)选自下组的酶:纤维素酶，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，半纤维素酶，酯酶，棒曲霉素，漆酶，木质素分解酶，果胶酶，过氧化物酶，蛋白酶，和膨胀素。在另一个方面，所述纤维素酶优选为一个或多个(例如几个)选自下组的酶:内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶，和葡糖苷酶。在另一个方面，所述半纤维素酶优选为一个或多个(例如几个)选自下组的酶:乙酰甘露聚糖酯酶，乙酰木聚糖酯酶，阿拉伯聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，香豆酸酯酶，阿魏酸酯酶，半乳糖苷酶，葡糖醛酸糖苷酶，葡糖醛酸酯酶，甘露聚糖酶，甘露糖苷酶，木聚糖酶，和木糖苷酶。[0154]一种或多种(例如几种)酶可为野生型蛋白，重组蛋白，或野生型蛋白和重组蛋白的组合。例如，一种或多种(例如几种)酶可为细胞的天然蛋白，其可用作宿主细胞以重组表达酶组合物。[0155]可以用于本发明的方法的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，解纤维热酸菌(Acidothermuscellulolyticus)内切葡聚糖酶(W091/05039；W093/15186；美国专利5，275，944；W096/02551;美国专利5，536，655，W000/70031,W005/093050)；Thermobifidafusca内切葡聚糖酶III(W005/093050)jPThermobifidafusca内切葡聚糖酶V(W005/093050)。[0156]可以用于本发明的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，里氏木霉内切葡聚糖酶KPenttila等，1986，Gene45:253-263，里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I；GENBANK?登录号M15665);里氏木霉内切葡聚糖酶II(Saloheimo等，1988，Gene63:11-22，里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II;GENBANK?登录号M19373;SEQIDNO:6);里氏木霉内切葡聚糖酶III(Okada等，1988,Appl.Environ.Microbiol.64:555-563;GENBANK?登录号AB003694)；里氏木霉内切葡聚糖酶V(Saloheimo等,1994,MolecularMicrobiology13:219-228；GENBANK?登录号Z33381);棘孢曲霉内切葡聚糖酶(Ooi等，1990，NucleicAcidsResearchl8:5884);川地曲霉(Aspergilluskawachii)内切葡聚糖酶(Sakamoto等，1995，CurrentGenetics27:435-439);胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovara)内切葡聚糖酶(Saarilahti等，1990，Gene90:9-14);尖镰孢内切葡聚糖酶(GENBANK?登录号L29381);灰腐质霉thermoidea变种内切葡聚糖酶(GENBANK?登录号AB003107)；Melanocarpusalbomyces内切葡聚糖酶(GENBANK?登录号MAL515703);粗糙脉孢菌内切葡聚糖酶(GENBANK?登录号XM_324477);特异腐质霉内切葡聚糖酶V;嗜热毁丝霉CBS117.65内切葡聚糖酶；担子菌纲(basidi0myCete)CBS495.95内切葡聚糖酶；担子菌纲CBS494.95内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL6B内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL6C内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7C内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7E内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7F内切葡聚糖酶；CladorrhinumfoecundissimumATCC62373CEL7A内切葡聚糖酶；以及里氏木霉菌株VTT-D-80133内切葡聚糖酶(GENBANK?登录号M15665)。[0157]在一个方面，所述酶组合物进一步包含木霉属内切葡聚糖酶I。在另一个方面，所述酶组合物进一步包含里氏木霉内切葡聚糖酶I。在另一个方面，所述酶组合物进一步包含里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I(GENBANK?登录号M15665)。在另一个方面，所述里氏木霉内切葡聚糖酶I对于宿主细胞是天然的。在另一个方面，所述里氏木霉内切葡聚糖酶I是SEQIDNO:90的成熟多肽。[0158]在另一个方面，所述酶组合物进一步包含木霉属内切葡聚糖酶II。在另一个方面，所述酶组合物进一步包含里氏木霉内切葡聚糖酶I1.在另一个方面，所述酶组合物进一步包含里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II(GENBANK?登录号M19373)。在另一个方面，所述里氏木霉内切葡聚糖酶II对于宿主细胞是天然的。在另一个方面，所述里氏木霉内切葡聚糖酶I是SEQIDNO:92的成熟多肽。[0159]所述组合物可依照本领域中已知的方法制备，并可为液体或干组合物的形式。所述组合物可依照本领域中已知的方法稳定化。[0160]所述酶组合物亦可为发酵液制剂或细胞组合物。[0161]术语“发酵液”用于本文中指由细胞发酵产生、不经历或仅经历最低限的回收和/或纯化的制备物。举例而言，当将微生物培养物生长至饱和，在限制碳的条件下温育以允许蛋白合成(例如由宿主细胞表达酶)，并分泌入细胞培养基时，产生发酵液。所述发酵液可含有在发酵终止时衍生的发酵材料的未分级或分级的内容物。通常而言，发酵液是未分级的，并包含用过的培养基和例如通过离心去除微生物细胞(例如丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎块。在一些实施方案中，所述发酵液含有用过的细胞培养基，胞外酶，和生活和/或非生活的微生物细胞。[0162]在一个实施方案中，所述发酵液制剂和细胞组合物包含第一有机酸组分和第二有机酸组分，所述第一有机酸组分包含至少一个1-5碳的有机酸和/或其盐，而所述第二有机酸组分包含至少一个6个或更多个碳的有机酸和/或其盐。在一个具体实施方案中，所述第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述两个或更多个的混合物，而所述第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基缬草酸、苯乙酸、其盐，或前述两个或更多个的混合物。[0163]在一个方面，所述组合物含有有机酸，并任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎块。在一个实施方案中，从细胞杀灭的全培养液中移除所述杀灭的细胞和/或细胞碎块以提供不含这些组分的组合物。[0164]所述发酵液制剂或细胞组合物可进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾和其它本领域中已知的。[0165]所述细胞杀灭的全培养液或组合物可含有在发酵终止时衍生的发酵材料的未分级内容物。通常而言，所述细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的培养基和在将微生物细胞(例如丝状真菌细胞)生长至饱和，在限制碳的条件下温育以允许蛋白合成之后存在的细胞碎块。在一些实施方案中，所述细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基，胞外酶，和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施方案中，在细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞可使用本领域中已知的方法渗透和/或裂解。[0166]如本文中所述的全培养液或细胞组合物通常为液体，但可含有不溶性组分，如杀灭的细胞、细胞碎块、培养基组分和/或不溶性酶。在一些实施方案中，可去除不溶性组分以提供澄清的液体组合物。[0167]本发明的全培养液制剂和细胞组合物可通过W090/15861或W02010/096673中描述的方法来产生。[0168]宿主细胞[0169]本发明亦涉及重组丝状真菌宿主细胞，其包含编码下述的多核苷酸:(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I;(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II;(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；和(iv)具有纤维素分解增强活性的青霉属种GH61多肽；或其同源物。术语“宿主细胞”术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。[0170]所述宿主细胞可为酶或蛋`白的重组产生中可用的任何丝状真菌细胞。[0171]“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等，1995，见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行,而碳分解代谢可以是发酵的。[0172]丝状真菌宿主细胞可为枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属(Ceriporiopsis)、金抱子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、键抱属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨抱菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉抱菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂裙菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。[0173]例如，所述丝状真菌宿主细胞可为泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、黑剌烟管菌(Bjerkanderaadusta)、干拟錯菌(Ceriporiopsisaneirina)、Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、虫拟錯菌(Ceriporiopsissubvermispora)、Chrysosporiuminops、嗜角质金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、Chrysosporiummerdarium、租金抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、ChrysosporiumqueenslandicumΛ热带金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiumzonatum、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆抱状德抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、库威德抱(Fusariumcrookwellense)、大刀德抱(FusariumcuImorum)、禾本科德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、异抱德抱(Fusariumheterosporum)、合欢木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉红德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、肤色德抱(Fusariumsarcochroum)、拟分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圆德抱(Fusariumtorulosum)、拟丝抱德抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片德抱(Fusariumvenenatum)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糖脉抱菌(Neurosporacrassa)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、福射射脉菌(Phlebiaradiata)、剌序侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭抱霉(Thielaviaterrestris)、长域毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichoderma1ngibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或绿色木霉(Trichodermaviride)细胞。[0174]可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木`霉属宿主细胞的合适方法在EP238023和Yelton等，1984，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:1470-1474以及Christensen等，1988，Bio/Technology6:1419-1422中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等，1989，Gene78:147-156和W096/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母:Becker矛口Guarente，于AbelsonjJ.N.矛口Simon，Μ.1.编，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymologyjVolumel94,ppl82_187，AcademicPress,Inc.，NewYork；Ito等，1983，J.Bacteriol.153:163；和Hinnen等，1978，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA75:1920。[0175]所述木霉属宿主细胞可为任何可用于酶或蛋白的重组产生的木霉属细胞。例如，所述木霉属细胞可为哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichoderma1ngibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或绿色木霉(Trichodermaviride)细胞。在一个方面，所述木霉属细胞是哈茨木霉细胞。在另一个方面，所述木霉属细胞是康宁木霉细胞。在另一个方面，所述木霉属细胞是长枝木霉细胞。在另一个方面，所述木霉属细胞是里氏木霉细胞。在另一个方面，所述木霉属细胞是绿色木霉细胞。[0176]在另一个方面，所述里氏木霉细胞是里氏木霉RutC30。在另一个方面，所述里氏木霉细胞是里氏木霉TV10。在另一个方面，所述绿色木霉细胞是里氏木霉RutC30的突变体。在另一个方面，所述里氏木霉细胞是里氏木霉TVlO的突变体。在另一个方面，所述绿色木霉细胞是里氏木霉的形态学突变体。参见例如W097/26330，其通过全文提述并入本文。[0177]可以将木霉属细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的工艺以本身已知的方式转化。用于转化木霉属宿主细胞的合适方法在EP238023和Yelton等，1984，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:1470-1474以及Christensen等，1988，Bio/Technology6:1419-1422中描述。[0178]在木霉属宿主细胞中，可通过破坏或缺失一个或多个(例如几个)天然纤维素酶和/或半纤维素酶基因或其一部分来使所述基因失活，这导致突变细胞与亲本细胞相比，当在相同条件下培养时，产生较少或不产生所述纤维素酶和/或半纤维素酶。在一个方面，所述一种或多种(例如几种)纤维素酶基因编码选自下组的酶:纤维二糖水解酶I，纤维二糖水解酶II，内切葡聚糖酶I，内切葡聚糖酶II,β-葡糖苷酶，和膨胀素。在另一个方面，所述一种或多种(例如几种)半纤维素酶基因编码选自下组的酶:木聚糖酶I，木聚糖酶II，木聚糖酶III，和β-木糖苷酶。在另一个方面，所述一种或多种(例如几种)半纤维素酶基因编码选自下组的酶:乙酰甘露聚糖酯酶，乙酰木聚糖酯酶，阿拉伯聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，香豆酸酯酶，阿魏酸酯酶，半乳糖苷酶，葡糖醛酸糖苷酶，葡糖醛酸酯酶，甘露聚糖酶，和甘露糖苷酶。[0179]所述突变细胞可通过使用本领域公知的方法，例如插入、破坏、替代或缺失，来减少或消除编码木霉属纤维素酶或半纤维素酶的多核苷酸的表达。在一个优选的方面，所述多核苷酸经失活。待修饰或失活的多核苷酸可为，例如编码区或其对于活性必需的部分，或编码区表达所需的调节元件。此种调节或调控序列的实例可为启动子序列或其功能部分，即足以影响多核苷酸表达的部分。其它可供修饰的调控序列包括但不限于:前导序列，聚腺苷酸化序列，前肽序列，信号肽序列，转录终止子，和转录激活子。[0180]可以通过向亲本细胞施以诱变，并且选择其中已将多核苷酸的表达减少或消除的突变细胞来进行多核苷酸的修饰或失活。诱变可能是特异性的或随机的，可以通过例如使用合适的物理或化学诱变剂进行，通过使用合适的寡核苷酸进行，或通过将所述DNA序列进行PCR产生的诱变。此外，可以通过使用这些诱变剂的任何组合来进行诱变。[0181]适合于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲磺酸酯(ethylmethanesulphonate)(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。[0182]当使用这些试剂时，通常通过如下方法来进行所述诱变:在合适条件下存在所述诱变剂时温育待诱变的亲本细胞，并筛选和/或选择显示基因表达减少的或无基因表达的突变细胞。[0183]亦可通过插入、取代或缺失基因或其转录或翻译所需的调控元件中的一个或多个(例如几个)核苷酸实现多核苷酸的修饰或失活。例如，可以插入或去除核苷酸从而导致引入终止密码子，去除起始密码子，或改变开读框。按照本领域已知的方法通过定位诱变或PCR产生的诱变可以实现这种修饰或失活。尽管在理论上所述修饰可以在体内进行，即，直接在表达待修饰的多核苷酸的细胞上进行，但优选如下面所示例的那样在体外进行所述修饰。[0184]消除或减少多核苷酸表达的便利方式的实例是基于基因替代，基因缺失，或基因破坏的技术。例如，在基因破坏方法中，将对应于内源多核苷酸的核酸序列在体外进行诱变以产生缺陷性的核酸序列，然后将其转化入亲本细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组，所述缺陷性核酸序列替代了内源多核苷酸。理想的是所述缺陷性多核苷酸还编码标志物，其可用于选择其中多核苷酸被修饰或破坏的转化子。在一个方面，用选择性标志物(如本文所述的那些)来破坏所述多核苷酸。[0185]亦可通过在细胞中抑制由所述多核苷酸编码的酶的表达来实现对于多核苷酸的修饰或失活，即向细胞施用或在细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含编码所述酶的多核苷酸的亚序列。在一个优选的方面，所述dsRNA长度为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个双链体核苷酸。[0186]所述dsRNA优选为小干扰RNA(SiRNA)或微RNA(miRNA)。在一个优选的方面，所述dsRNA是用于抑制转录的小干扰RNA。在另一个优选的方面,所述dsRNA是用于抑制翻译的微RNA。在另一个方面，所述双链RNA(dsRNA)分子包含SEQIDNO:17,SEQIDNO:19,SEQIDNO:21，SEQIDNO:23，SEQIDNO:25，SEQIDN0:27，和/或SEQIDNO:29的成熟多肽编码序列的一部分，以供在细胞中抑制所述多肽的表达。尽管本发明并不限于任何具体作用机制，但所述dsRNA可进入细胞并导致类似或相同序列的单链RNA(ssRNA)，包括内源mRNA的降解。当细胞暴露于dsRNA时，来自同源基因的mRNA通过称为RNA干扰(RNAi)的过程受选择性降解。[0187]所述dsRNA可用于基因沉默以使用本发明的dsRNAi选择性降解RNA。该工艺可在体外、离体或体内实践。在一个方面，所述dsRNA分子可用于在细胞、器官或动物中生成功能丧失的突变。用于制备和使用dsRNA分子以选择性降解RNA的方法是本领域中公知的，参见，例如美国专利号6，489，127;6，506，559;6，511，824;和6，515，109。[0188]在一个方面，所述木霉属纤维二糖水解酶I或其同源物选自下组:(i)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为SEQIDNO:18的成熟多肽；(ii)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:18的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:17的成熟多肽编码序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQIDNO:17的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。[0189]在另一个方面，所述木霉属纤维二糖水解酶II或其同源物选自下组:(i)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为SEQIDN0:20的成熟多肽；(ii)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:20的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:19的成熟多肽编码序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQIDNO:19的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。[0190]在另一个方面，所述木霉属β_葡糖苷酶或其同源物选自下组:(i)β_葡糖苷酶，其包含或组成为SEQIDNO:22的成熟多肽；(ii)β-葡糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:22的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:21的成熟多肽编码序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQIDΝ0:21的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。[0191]在另一个方面，所述木霉属木聚糖酶或其同源物选自下组:(i)木聚糖酶，其包含或组成为SEQIDNO:24、SEQIDNO:26或SEQIDNO:28的成熟多肽；(ii)木聚糖酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:24,SEQIDN0:26或SEQIDNO:28的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:23,SEQIDN0:25或SEQIDNO:27的成熟多肽编码序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQIDNO:23,SEQIDN0:25或SEQIDNO:27的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。[0192]在另一个方面，所述木霉属木糖苷酶或其同源物选自下组:(i)木糖苷酶，其包含或组成为SEQIDNO:30的成熟多肽；(ii)β-木糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:30的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:29的成熟多肽编码序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQIDNO:29的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。[0193]在一个方面，木霉属纤维二糖水解酶I基因失活。在另一个方面，木霉属纤维二糖水解酶II基因失活。在另一个方面，木霉属β-葡糖苷酶基因失活。在另一个方面，木霉属木聚糖酶基因失活。在另一个方面，木霉属β-木糖苷酶基因失活。[0194]在另一个方面，木霉属纤维二糖水解酶I基因和木霉属纤维二糖水解酶II基因失活。[0195]在另一个方面，两个或更多个(例如几个)选自下组的基因失活:纤维二糖水解酶I，纤维二糖水解酶II，β-葡糖苷酶,木聚糖酶I,木聚糖酶II,木聚糖酶III,和β-木糖苷酶基因。在另一个方面，三个或更多个(例如几个)选自下组的基因失活:纤维二糖水解酶I，纤维二糖水解酶II，β-葡糖苷酶,木聚糖酶I,木聚糖酶II,木聚糖酶III,和β-木糖苷酶基因。在另一个方面，四个或更多个(例如几个)选自下组的基因失活:纤维二糖水解酶I，纤维二糖水解酶II，β-葡糖苷酶,木聚糖酶I,木聚糖酶II,木聚糖酶III,和β-木糖苷酶基因。在另一个方面，五个或更多个(例如几个)选自下组的基因失活:纤维二糖水解酶I，纤维二糖水解酶II，β-葡糖苷酶,木聚糖酶I,木聚糖酶II,木聚糖酶III,和β-木糖苷酶基因。在另一个方面，六个或更多个(例如几个)选自下组的基因失活:纤维二糖水解酶I，纤维二糖水解酶II，β-葡糖苷酶,木聚糖酶I,木聚糖酶II,木聚糖酶III,和β-木糖苷酶基因。[0196]在另一个方面，所述纤维二糖水解酶I,纤维二糖水解酶II,β-葡糖苷酶，木聚糖酶I，木聚糖酶II，木聚糖酶III，和β-木糖苷酶基因失活[0197]在另一个方面，一个或多个(例如几个)蛋白酶基因失活。在另一个方面，所述一个或多个(例如几个)蛋白酶基因是如W02011/075677(其通过全文提述并入本文)中所述的枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶，和胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因。[0198]核酸构建体[0199]包含编码酶或蛋白的核酸构建体可通过将一个或多个(例如几个)调控序列可操作地连接于所述多核苷酸以在与所述调控序列相容的条件下指导所述编码序列在丝状真菌宿主细胞中表达。取决于于表达载体，在将多核苷酸插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。[0200]调控序列可为启动子，其由用于表达编码酶或蛋白的多核苷酸的丝状真菌宿主细胞所识别。启动子含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。[0201]用于指导核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子:构巢曲霉(Aspergillusnidulans)乙酰胺酶、黑曲霉(Aspergillusniger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillusawamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉(Aspergillusoryzae)TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢(Fusariumoxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(W096/00787)、镶片镰孢(Fusariumvenenatum)淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、镶片镰抱Daria(W000/56900)、壤片键抱Quinn(W000/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉(Trichodermareesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶1、里氏木霉纤维二糖水解酶I1、里氏木霉内切葡聚糖酶1、里氏木霉内切葡聚糖酶I1、里氏木霉内切葡聚糖酶II1、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶1、里氏木霉木聚糖酶I1、里氏木霉木聚糖酶II1、里氏木霉β-木糖苷酶、里氏木霉翻译延伸因子，以及NA2_tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自在曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。其它启动子描述于美国专利号6，011，147，其通过全文提述并入本文。[0202]调控序列也可以是转录终止子，其由丝状真菌宿主细胞识别以终止转录。所述终止子与编码所述多肽的多核苷酸的3’末端可操作地连接。在本发明中可使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。[0203]对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得:构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶1、里氏木霉纤维二糖水解酶11、里氏木霉内切葡聚糖酶1、里氏木霉内切葡聚糖酶I1、里氏木霉内切葡聚糖酶II1、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶1、里氏木霉木聚糖酶I1、里氏木霉木聚糖酶II1、里氏木霉β-木糖苷酶和里氏木霉翻译延伸因子。[0204]调控序列还可以是合适的前导序列，其为对于丝状真菌宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的多核苷酸的5’-末端。可使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。[0205]对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得:米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。[0206]调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与多核苷酸的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，丝状真菌宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。[0207]对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得:构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉纤维二糖水解酶1、里氏木霉纤维二糖水解酶II和里氏木霉内切葡聚糖酶V。[0208]调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的N端相连的信号肽，并且指导所述多肽进入细胞分泌途径。多核苷酸的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码所述多肽的编码序列的区段一起天然地连接在翻译阅读框中。或者，编码序列5’端可含有对于所述编码序列外源的信号肽编码序列。当编码序列不天然地含有信号肽编码序列时，外源信号肽编码序列可能是必需的。或者，可以直接用外源信号肽编码序列取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，可使用指导表达的多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。[0209]对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列:黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉纤维二糖水解酶1、里氏木霉纤维二糖水解酶I1、里氏木霉内切葡聚糖酶1、里氏木霉内切葡聚糖酶I1、里氏木霉内切葡聚糖酶III和里氏木霉内切葡聚糖酶V。[0210]调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽的N端的前肽。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的，并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为活性多肽。可以从嗜热毁丝霉漆酶(W095/33836)和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶的基因获得前肽编码序列。[0211]当信号肽和前肽序列二者均存在时，将前肽序列置于紧接着(nextto)多肽N端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的N端。[0212]同样理想的是添加调节序列，其相对于丝状真菌宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节序列的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。调节序列包括黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAa-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子和里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(withheavymetal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。[0213]表达载体[0214]重组表达载体可构建为包含编码酶或蛋白的多核苷酸，启动子，终止子，和转录和翻译终止信号。多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(例如几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码所述多肽多核苷酸。或者，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述多核苷酸的核酸构建体或多核苷酸来表达所述多核苷酸。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的调控序列可操作地连接以供表达。[0215]重组表达载体可以是任何能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生多核苷酸的表达的载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。[0216]载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自我复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外,可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(totalDNA),或可以使用转座子(transposon)。[0217]所述载体优选地含有一个或多个(例如几个)选择性标志物，以便于容易地选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标志物是这样的基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophytoauxotrophs)等。[0218]用于丝状真菌宿主细胞的选择性标志物的实例包括但不限于adeA(磷酸核糖氨基咪唑玻拍羧酸胺合酶，phosphoribosylaminoimidazoIe-succinocarboxamidesynthase)>adeB(憐酸核糖氨基咪唑合酶，phosphoribosy1-aminoimidazoIesynthase)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitratereductase)>pyrG(乳清酸核苷_5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)bar基因。优选用于木霉属细胞的是adeA、adeB、amdS、hph和pyrG基因。细菌选择性标志物的实例是赋予抗生素抗性的标志物，所述抗生素抗性例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、壮观霉素或四环素抗性。[0219]所述选择性标志物可为W02010/039889A2(其通过全文提述并入本文)中所述的双重选择性标志物系统。在一个方面,所述选择性标志物是hph-tk双重选择性标志物系统。[0220]所述载体优选含有允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制的元件。[0221]为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置的额外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应含有足够数量的与相应的目标序列具有高度序列同一性的核酸，如100至10，000碱基对，400至10，000碱基对，和800至10，000碱基对，以提高同源重组的概率。整合元件可以是任何与宿主细胞基因组中的目标序列同源的序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。[0222]为了自主复制，载体可以还包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是在细胞中发挥功能的介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体体内复制的多核苷酸。[0223]在丝状真菌宿主细胞中有用的复制起点的实例是AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsRes.15:9163-9175;W000/24883)。分离AMAl基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于W000/24883中的方法完成。[0224]可以将多于一个拷贝的多核苷酸插入丝状真菌宿主细胞以增加多肽的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得:将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标志物基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectableagent)存在下培养细胞来选择含有选择性标志物基因的扩增拷贝，且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。[0225]用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等，1989，见上文)。[0226]产生方法[0227]本发明亦涉及产生酶组合物的方法，其包括:(a)在有助于产生所述酶组合物的条件下培养本发明的丝状真菌宿主细胞；和任选地(b)回收所述酶组合物。[0228]使用本领域已知的方法在适合于产生所述酶组合物的营养培养基中培养丝状真菌宿主细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述酶的条件下进行的摇瓶培养，或实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。[0229]可以使用本领域已知的对于多肽特异性的方法来检测所述酶。这些检测方法包括但不限于特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶测定法(enzymeassay)可用于确定活性。[0230]所述酶可以使用本领域已知的方法回收。例如，所述多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。在一个方面，回收了包含所述多肽的发酵液。[0231]可以使用多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的酶，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见,例如，ProteinPurification,Janson和Ryden编,VCHPublishers,NewYork,1989)。[0232]用途[0233]本发明还涉及下述使用包含本发明的酶组合物的的工艺。[0234]本发明还涉及降解或转化纤维素材料的工艺，其包括:用包含本发明的酶组合物处理纤维素材料。在一个方面，所述方法进一步包括回收已降解或转化的纤维素材料。所述纤维素材料的降解或转化的可溶性产物可从不溶性纤维素材料使用本领域已知的方法分离，如例如离心、过滤或重力沉降。[0235]本发明还涉及产生发酵产物的工艺，其包括:(a)用包含本发明的酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收发酵产物。[0236]本发明还涉及发酵纤维素材料的工艺，其包括:用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵纤维素材料，其中所述纤维素材料是用包含本发明的酶组合物糖化的。在一个方面，纤维素材料的发酵产生发酵产物。在另一个方面，所述工艺进一步包括从发酵回收发酵产物。[0237]本发明的工艺可以用于将纤维素材料糖化成可发酵糖，并且将可发酵糖转化成很多有用的发酵产物，例如燃料、饮用乙醇和/或平台化学品(platformchemical)(例如酸、醇、酮、气体等)。从纤维素材料产生期望的发酵产物通常涉及预处理、酶水解(糖化)和发酵。[0238]根据本发明的纤维素材料的处理可以使用本领域的常规方法完成。此外，本发明的工艺能使用经配置以依照发明操作的任何常规生物质加工设备进行。[0239]水解(糖化)和发酵，分别的或同时的，包括但不限于，分离的水解和发酵(SHF)、同时糖化和发酵(SSF)、同时糖化和共发酵(SSCF)、混合的水解和发酵(HHF)、分离的水解和共发酵(SHCF)、混合的水解和共发酵(HHCF)，和直接微生物转化(DMC)，有时也称为联合生物加工(consolidatedbioprocessing,CBP)。SHF使用分离的处理步骤以首先将纤维素材料酶水解为可发酵糖，例如，葡萄糖，纤维二糖和戊糖单体，然后将可发酵糖发酵成为乙醇。在SSF中，纤维素材料的酶水解和糖变为乙醇的发酵组合在一个步骤中(Philippidis,G.P.,1996,Cellulosebioconversiontechnology,于HandbookonBioethanol!ProductionandUtilization,Wyman,C.E编，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)oSSCF包括多种糖的共发酵(Sheehan,J.,和Himmel,Μ.,1999,Enzymes,energyandtheenvironment:AstrategicperspectiveontheU.S.DepartmentofEnergy’sresearchanddevelopmentactivitiesforbioethanol,Biotechnol.Prog.15:817-827)。HHF在同时糖化和水解步骤之外，还包括单独的水解步骤，所述各步骤可以在同一个反应器中进行。HHF过程中的步骤可以在不同的温度进行，即，高温酶法糖化，然后在发酵菌株能够耐受的较低温度进行SSF。DMC在一个或多个(例如几个)步骤中组合了所有三个过程(酶产生、水解和发酵)，其中使用相同的生物体产生用于将纤维素转化成可发酵糖并将可发酵糖转化成终产物的酶(Lynd,L.R.，Weimer,P.J.，vanZyl,W.H.,和Pretorius,1.S.，2002，Microbialcelluloseutilization!Fundamentalsandbiotechnology,Microbiol.Mol.Biol.Reviews66:506-577)。在本文可以理解的是，本领域中已知的任何方法，包括预处理、酶水解(糖化)、发酵，或它们的组合，均可用于实施本发明的工艺。[0240]常规设备可包括补料分批`式搅拌反应器、分批式搅拌反应器、具有超滤的连续流搅拌反应器和/或连续活塞流柱式反应器(FernandadeCastilhosCorazza,FlavioFariadeMoraes,GisellaMariaZanin和IvoNeitzel,2003,Optimalcontrolinfed-batchreactorforthecellobiosehydrolysis,ActaScientiarum.Techno1gy25:33-38；Gusakov,A.V.,和Sinitsyn,A.P.，1985，Kineticsoftheenzymatichydrolysisofcellulose:1.Amathematicalmodelforabatchreactorprocess,Enz.Microb.Technol.7:346-352)>研磨反应器(Ryu,S.Κ.，和Lee,J.M.,1983,Bioconversionofwastecellulosebyusinganattritionbioreactor,Biotechnol.Bioeng.25:53-65)，或者具有由电磁场引起的强烈搅拌的反应器(Gusakov,A.V.,Sinitsyn,A.P.,Davydkin,1.Y.,Davydkin,V.Y.,Protas,0.V.,1996,Enhancementofenzymaticcellulosehydrolysisusinganoveltypeofbioreactorwithintensivestirringinducedbyelectromagneticfield,App1.Biochem.Biotechnol.56:141-153)。其它反应器类型包括:流化床、升流层(upflowblanket)、固定化和用于水解和/或发酵的挤出机型的反应器。[0241]预处理。在本发明的工艺的实施中，可以使用本领域已知的任何预处理过程破坏植物细胞壁的纤维素材料组分(Chandra等，2007，Substratepretreatment:Thekeytoeffectiveenzymatichydrolysisoflignocellulosics?Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:67-93；Galbe和Zacchi，2007，Pretreatmentoflignocellulosicmaterialsforefficientbioethanolproduction,Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:41-65；Hendriks和Zeeman，2009，Pretreatmentstoenhancethedigestibilityoflignocellulosicbiomass，BioresourceTechnol.100:10-18；Mosier等，2005，Featuresofpromisingtechnologiesforpretreatmentoflignocellulosicbiomass，BioresourceTechnol.96:673-686；Taherzadeh和Karimi，2008，Pretreatmentoflignocellulosicwastestoimproveethanolandbiogasproduction:Areview,Int.J.0fMol.Sc1.9:1621-1651;Yang和Wyman，2008，Pretreatment:thekeytounlockinglow-costcellulosicethanol,BiofuelsBioproductsandBiorefining-Biofpr.2:26-40)。[0242]纤维素材料也可以在预处理之前使用本领域中已知的方法进行粒度减小、筛分、预浸泡、润湿、洗漆和/或调理(conditioning)。[0243]常规的预处理包括但不限于，蒸汽预处理(伴随或不伴随爆破)、稀酸预处理、热水预处理、碱预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆破、氨纤维爆破、有机溶剂预处理和生物预处理。其它预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界CO2、超临界H20、臭氧、离子性液体和Y辐射预处理。[0244]可以在水解和/或发酵之前预处理纤维素材料。预处理优选在水解前进行。或者，预处理可以与酶水解同时进行以释放可发酵糖，如葡萄糖、木糖和/或纤维二糖。在大多数情况下，预处理步骤本身使一些生物质转化成可发酵糖(甚至在不存在酶的情况下)。[0245]蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，加热纤维素材料以破坏植物细胞壁成分，包括木质素、半纤维素和纤维素，使纤维素和其它级分，例如，半纤维素能够被酶触及。将纤维素材料经过或通过反应容器，其中注入蒸汽以增加温度至需要的温度和压力，并且在其中保持期望的反应时间。蒸汽预处理优选在140-250°C，例如160-200°C，或170-190°C进行，其中最优的温度范围依赖于化学催化剂的添加。蒸汽预处理的停留时间优选1-60分钟，例如1-30分钟，1-20分钟，3-12分钟，或4-10分钟，其中最优的停留时间依赖于温度范围和化学催化剂的添加。蒸汽预处理允许相对较高的固形物加载量，以致于纤维素材料在预处理过程中通常仅仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后的物质的爆破放料(explosivedischarge)组合,这称为蒸汽爆破，即，快速闪变至大气压和物质的瑞流，以通过破碎增加可接触的表面积(Duff和Murray,1996,BioresourceTechnology855:1-33；Galbe和Zacchi,2002，Appl.Microbiol.Biotechnol.59:618-628;美国专利申请N0.20020164730)。在蒸汽预处理过程中，半纤维素乙酰基团被切开，并且得到的酸自催化半纤维素部分水解成为单糖和寡糖。木质素仅以有限的程度被去除。[0246]化学预处理:术语“化学处理”指能促进纤维素、半纤维素和/或木质素分离和/或释放的任何化学处理。此种预处理可将晶体纤维素转化为无定形纤维素。合适的化学预处理工艺的实例包括例如稀酸预处理、石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻爆破(AFEX)、氨渗滤(APR)、离子性液体和有机溶剂预处理。[0247]经常在蒸汽预处理之前加入催化剂如H2SO4或SO2(通常0.3至5%w/w)，其可减少时间，降低温度，增加回收率，并改进酶水解(Ballesteros等，2006，Appl.Biochem.Biotechnol.129-132:496-508;Varga等，2004，Appl.Biochem.BiotechnoI.113-116:509-523;Sassner等.,2006,EnzymeMicrob.Technol.39:756-762)。在稀酸预处理中，将纤维素材料与稀酸(通常是H2S04)和水混合以形成浆料，由蒸汽加热至期望的温度，并在一段停留时间后闪变至大气压。可以用很多反应器设计进行稀酸预处理，例如，活塞流反应器、逆流反应器或连续逆流收缩床反应器(Duff和Murray,1996,见上文；Schell等,2004,BioresourceTechnol.91:179-188；Lee等,1999,Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65:93-115)。[0248]还可以使用碱性条件下的几种预处理方法。这些碱预处理包括，但不限于，氢氧化钠、石灰、湿氧化、氨渗滤(APR)和氨纤维/冷冻爆破(AFEX)。[0249]用氧化钙或氢氧化钙，在85_150°C的温度进行石灰预处理，停留时间从I小时到几天(Wyman等，2005,BioresourceTechnol.96:1959-1966；Mosier等，2005,BioresourceTechnol.96:673-686)。W02006/11089UW02006/110899,W02006/110900和W02006/110901公开了使用氨的预处理方法。[0250]湿氧化是一种热预处理，通常在180-200V进行5_15分钟，加入氧化剂如过氧化氢或过压氧(Schmidt和Thomsen,1998,BioresourceTechnol.64:139-151；Palonen等，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.117:1-17;Varga等，2004，Biotechnol.Bioeng.88:567-574；Martin等,2006,J.Chem.Technol.Biotechnol.81:1669-1677)。预处理优选以1-40%干物质，例如2-30%干物质，或5-20%干物质进行，并且经常通过加入碱如碳酸钠来增加初始pH。[0251]湿氧化预处理方法的修改方`法，称为湿爆破(湿氧化和蒸汽爆破的组合)，能够处理高达30%的干物质。在湿爆破中，在预处理过程中，在一定的停留时间后引入氧化剂。然后通过闪变至大气压而结束预处理(W02006/032282)。[0252]氨纤维爆破(AFEX)涉及在温和温度如90-150°C和高压如17_20bar，用液氨或氨气将纤维素材料处理5-10分钟，其中干物质含量可以高达60%(Gollapalli等，2002，Appl.Biochem.Biotechnol.98:23-35;Chundawat等，2007，Biotechnol.Bioeng.96:219-231;Alizadeh等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121:1133-1141；Teymouri等,2005,BioresourceTechnol.96:2014-2018)。在AFEX预处理过程中，纤维素和半纤维素保持相对完整。木质素-糖复合物被切开。[0253]有机溶剂预处理通过用含水乙醇(40-60%乙醇)在160-200°C提取30-60分钟而将纤维素材料去木质素化(Pan等,2005,Biotechnol.Bioeng.90:473-481；Pan等，2006，Biotechnol.Bioeng.94:851-861;Kurabi等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121:219-230)。经常加入硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，大部分半纤维素和木质素得以去除。[0254]合适的预处理方法的其他实例如Schell等，2003，Appl.BiochemandBiotechn.Vol.105-108:69-85,和Mosier等，2005，BioresourceTechnology96:673-686,和美国专利公开申请2002/0164730所述。[0255]在一个方面，化学预处理优选作为稀酸处理，并且更优选作为连续稀酸处理进行。酸通常是硫酸，但也可以使用其它酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢或其混合物。弱酸处理在优选1-5，例如1-4，或1-2.5的pH范围内进行。在一个方面，酸浓度在优选0.01至，例如0.05至5wt%酸或0.1至2wt%酸的范围内。将酸与纤维素材料接触，并在优选140-200°C，例如165-190°C范围内的温度保持I至60分钟的时间。[0256]在另一个方面，预处理发生在含水浆料中。在优选的方面，在预处理过程中纤维素材料以优选10-80wt%，例如20-70wt%*30-60wt%，如约40wt%的量存在。预处理的纤维素材料可以不洗涤或者使用本领域任何已知的方法洗涤，例如，用水洗涤。[0257]机械预处理或物理预处理:术语“机械预处理”或“物理预处理”指任何促进颗粒大小减少的预处理。举例而言，此种预处理可涉及各种类型的研磨(grinding)或磨制(milling)(例如,干磨、湿磨或振动球磨)。[0258]纤维素材料可经物理(机械)和化学预处理。机械或物理预处理可与下述结合:汽蒸/蒸汽爆破、水热解(hydrothermolysis)、稀酸或弱酸处理、高温、高压处理、福射(例如微波福射)，或其组合。在一个方面，高压指优选约100至约400psi,例如约150至约250psi的范围的压力。在另一个方面，高温指约100至约300°C，例如约140至约200°C范围的温度。在一个优选的方面，机械或物理预处理在使用如上所定义的高温和高压的分批过程、使用蒸汽枪水解器系统，例如来自SundsDefibratorAB,Sweden的SundsHydrolyzer中进行。所述物理和化学预处理可视需要顺序进行或同时进行。[0259]因此，在一个优选的方面，对纤维素材料进行物理(机械)或化学预处理，或者它们的任何组合，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。[0260]生物预处理:术语“生物预处理”指可以促进纤维素、半纤维素和/或木质素从纤维素材料分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以包括应用溶解木质素的微生物和/或酶(参见，例如，Hsu,T.-A.，1996，Pretreatmentofbiomass,于HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization,Wyman,C.E编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212；Ghosh和Singh,1993，Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333；McMiIlan,J.D.,1994,Pretreatinglignocellulosicbiomass:areview,于EnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction,Himmel,M.E.,Baker,J.0.,和Overend,R.P.，编,ACSSymposiumSeries566,AmericanChemicalSociety,Washington,DC,第15章；Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,和Tsao,G.T.，1999，Ethanolproductionfromrenewableresources,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.,编,Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241；01sson和Hahn-Hagerdal,1996,Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312-331；和Vallander和Eriksson,1990,Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。[0261]趣化。在水解步骤中，将纤维素材料，例如经预处理的纤维素材料水解以将纤维素和半纤维素分解成可发酵糖，如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶的寡糖。水解通过包含本发明的酶组合物酶促进行。[0262]酶水解优选在易于由本领域技术人员确定的条件下，在合适的含水环境中进行。在一个方面，水解在适于酶的活性，即对于酶最佳的条件下进行。水解可以以补料分批或连续的过程进行，在连续过程中将纤维素材料逐渐补入，例如，补入含酶的水解溶液中。[0263]糖化通常在搅拌釜反应器或发酵罐中，在受控的pH、温度和混合条件下进行。合适的处理时间、温度和pH条件可以由本领域技术人员容易地确定。例如，糖化可以持续长达200小时，但是通常优选进行约12至约120小时，例如约16至约72小时，或约24至约48小时。温度为优选约25°C至约70°C的范围，例如约30°C至约65°C，约40°C至约60°C，或约50°C至约55°C。pH优选约3至约8，例如约3.5至约7，约4至约6，或约5.0至约5.5的范围。干固形物含量优选约5至约50wt%,例如约10至约40wt%,或20至约30wt%。[0264]在本发明的工艺中，所述包含本发明的酶组合物可在发酵之前或之中添加，例如在糖化之中或在发酵微生物繁殖之中或之后添加。[0265]包含本发明的酶组合物可为任何适用的形式，例如移除或不移除细胞的粗发酵液，含或不含细胞碎片的细胞裂解液，半纯化或纯化的酶制备物，或作为酶的来源的木霉属宿主细胞。所述酶组合物可为干粉或颗粒，无粉尘的颗粒，液体，稳定化液体或稳定化受保护的酶。液体酶制备物可根据确立的工艺，例如通过添加稳定剂如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或其他有机酸来稳定化。[0266]烟曲霉纤维素酶或半纤维素酶的最适量取决于几个因素，其包括但不限于，组分纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合物、纤维素材料、纤维素材料的浓度、纤维素材料的预处理、温度、时间、PH和包括发酵生物体(例如，同时糖化和发酵的酵母)。[0267]在一个方面，纤维素分解酶或半纤维素分解酶对于纤维素材料的有效量是约0.01至约50.0mg,例如约0.01至约40mg,约0.01至约30mg,约0.01至约20mg,约0.01至约IOmg,约0.01至约5mg,约0.025至约1.5mg,约0.05至约1.25mg,约0.075至约1.25mg,约0.1至约1.25mg,约0.15至约1.25mg,或约0.25至约1.0mg每g纤维素材料。[0268]在另一个方面，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽在W02008/151043中所述的可溶性活化二价金属阳离子，例如硫酸锰的存在下使用。[0269]在另一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽在二氧化合物、二环化合物、杂环化合物、含氮化合物、醌化合物、含硫化合物或从经预处理的纤维素材料(如经预处理的玉米秸杆(PCS))获得的液体的存在下使用。[0270]所述二氧化合物可包括任何含有两个或更多氧原子的合适化合物。在一些方面，所述二氧化合物含有如本文中所述的取代的芳基模块(moiety)。所述二氧化合物可包括一个或多个(例如几个)羟基和/或羟基衍生物，但亦包括缺乏羟基和羟基衍生物的取代的芳基模块。二氧化合物的非限定性实例包括邻苯二酚或儿茶酚；咖啡酸；3，4-二羟基苯甲酸；4_叔丁基-5-甲氧基-1，2-苯二酚；连苯三酚；没食子酸；甲基_3，4，5-三羟基苯甲酸；2，3，4-三羟基二苯甲酮；2，6-二甲氧基苯酚；芥子酸；3，5-二羟基苯甲酸；4-氯-1，2-苯二酚；4_硝基-1，2-苯二酚；鞋酸；没食子酸乙酯；羟乙酸甲酯；二羟基延胡索酸；2_丁炔-1,4-二醇；克酮酸；1，3_丙二醇；酒石酸；2，4_戊二醇；3-乙氧基-1，2-丙二醇；2，4，4’-三羟基二苯甲酮；顺-2-丁烯-1，4-二醇；3，4_二羟基-3-环丁烯-1，2-二酮；二羟基丙酮；乙酰丙烯醛（acroleinacetal);甲基_4_羟基苯甲酸；4_羟基苯甲酸；和甲基-3，5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸；或它们的盐或溶剂合物（solvate)。[0271]所述二环化合物可包括任何如本文中所述的合适的取代稠环系统。所述化合物可包含一个或多个（例如几个）另外的环，且除非另行说明，不限于具体的环数。在一个方面，所述二环化合物是类黄酮。在另一个方面，所述二环化合物是任选取代的异类黄酮(isoflavonoid)o在另一个方面，所述二环化合物是任选取代的花色銲离子(flavyliumion)，如任选取代的花色素或任选取代的花色苷，或其衍生物。二环化合物的非限定性实例包括表儿茶素（epicatechin);槲皮素（quercetin);杨梅黄酮（myricetin)；黄杉素(taxifolin);山奈酹(kaempferol);桑素(morin);金合欢素(acacetin);柚皮素（naringenin);异鼠李黄素（isorhamnetin);疗菜苷配基（apigenin);花青素(cyanidin);花色素苷（cyanin);kuromanin;花青素鼠李葡糖苷（keracyanin);或它们的盐或溶剂合物。[0272]所述杂环化合物可为任何合适的化合物，如本文中所述的任选取代的包含杂原子的芳环或非芳环。在一个方面，所述杂环是包含任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块的化合物。在另一个方面，所述任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块是任选取代的五元杂环烷基或任选取代的五元杂芳基模块。在另一个方面，任选取代的杂环烷基或任选取代的杂芳基模块是选自如下的任选取代的模块：吡唑基、呋喃基、咪唑基、异噁唑基、噁二唑基、噁唑基、吡咯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、噻唑基、三唑基、噻吩基(thienyl)、二氢噻吩-批唑基(dihydrothieno-pyrazolyl)、硫却基、咔唑基、苯并咪唑基、苯并噻吩基（benzothienyl)、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并三唑基、苯并噻唑基、苯并卩惡唑基（benzooxazolyl)、苯并咪唑基、异喹啉基、异H引哚基、(I丫唳基、苯并异口,惡唑基（benzoisazolyl)、二甲基乙内酰脲、吡嗪基、四氢呋喃基、吡咯啉基、吡咯烷基、吗啉基、卩引哚基、二氮杂环庚三烯基（diazepinyl)、氮杂环庚三烯基（azepinyl)、硫杂环庚三烯基（thiepinyl)、哌唳基和氧杂环庚三烯基（ox印inyl)。在另一个方面所述任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块是任选取代的呋喃基。杂环化合物的非限定性实例包括（1，2-二羟乙基）-3，4-二氢呋喃-2(5H)-酮；4-羟基-5-甲基_3_呋喃酮；5-羟基-2(5H)-呋喃酮；[1，2-二羟乙基]呋喃_2，3，4(5H)-三酮；a-羟基-Y-丁内酯；核糖酸内酯；己醒糖酸内酯（aldohexuronicaldohexuronicacidy-lactone);葡糖酸内酯；4-羟基香豆素；二氢苯并呋喃；5-(羟甲基）糠醛；糠偶姻（furoin);2(5H)_呋喃酮；5，6-二氢-2H-吡喃-2-酮；和5，6-二氢-4-羟基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮；或它们的盐或溶剂合物。[0273]所述含氮化合物可为任何具有一个或多个（例如几个）氮原子的合适化合物。在一个方面，所述含氮化合物包含胺、亚胺、轻胺或氧化亚氮（nitroxide)模块。含氮化合物的非限定性实例包括丙酮肟；紫尿酸；吡啶-2-醛肟；2_氨基苯酚；1，2-苯二胺；2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧(piperidinyloxy);5，6，7，8-四氢生物蝶呤；6，7-二甲基-5，6，7，8-四氢蝶呤；和马来酰胺酸；或它们的盐或溶剂合物。[0274]所述醌化合物可为任何本文中所述的包含醌模块的合适的化合物。醌化合物的非限定性实例包括1，4-苯醌；1，4-萘醌；2_羟基-1，4-萘醌；2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-苯醌或辅酶;2，3，5，6-四甲基-1，4-苯醌或四甲基对苯醌；1，4-二羟基蒽醌；3-羟基-1-甲基-5，6-二氢吲哚二酮或肾上腺色素；4_叔丁基-5-甲氧基-1，2-苯醌；批咯并喹啉醌(pyrroloquinolinequinone);或它们的盐或溶剂合物。[0275]所述含硫化合物可为任何包含一个或多个(例如几个)硫原子的合适的化合物。在一个方面，所述含硫化合物包含选自如下的模块:亚硫酰，硫醚，亚磺酰，磺酰，硫酰胺(sulfamide),磺酰胺(sulfonamide),磺酸和磺酸酯。含硫化合物的非限定性实例包括乙硫醇；2_丙硫醇；2_丙烯-1-硫醇；2_巯基乙磺酸；苯硫醇；苯-1，2-二硫醇；半胱氨酸；甲硫氨酸；谷胱甘肽；胱氨酸；或它们的盐或溶剂合物。[0276]在一个方面，此种如上所述的化合物对纤维素材料的有效量，以对纤维素糖单元的摩尔比例计为约10_6至约10，例如约10_6至约7.5，约10_6至约5，约10_6至约2.5，约I(T6至约1，约I(T5至约1，约I(T5至约KT1，约I(T4至约KT1，约I(T3至约KT1，或约I(T3至约10'在另一个方面，如上所述的化合物的有效量为约0.1μM至约1Μ，例如约0.5μM至约0.75Μ,约0.75μM至约0.5Μ,约IμM至约0.25Μ,约IμM至约0.1Μ,约5μM至约50mM，约10μM至约25mM，约50μM至约25mM，约10μM至约10mM，约5μM至约5mM，或约0.1mM至约ImM。[0277]术语“液剂(liquor)”意指在本文中所述的条件下，通过处理浆料中的木素纤维素和/或半纤维素材料，或其单糖例如木糖、阿拉伯糖、甘露糖等，所产生的溶液相，即水相、有机相或其组合，及其可溶性内容物。用于GH61多肽的纤维素分解增强的液剂可通过，任选在催化剂例如酸的存在下，任选在有机溶剂的存在下，且任选与对所述材料的物理破坏相组合来藉由施加热和/或压力来处理纤维素材料或半纤维素材料(或原料)，然后将溶液与残余固体分离来产生。此类条件决定了在借助纤维素酶制备物水解纤维素材料的过程中通过液剂和GH61多肽的组合可获得的纤维素分解增强的程度。所述液剂可使用本领域中的标准方法如过滤、沉积或离心从经处理的材料分离。[0278]在一个方面，所述液剂对纤维素的有效量为约10_6至约IOg每g纤维素，例如约10-6至约7.5g,约10-6至约5,约10-6至`约2.5g,约10-6至约Ig,约10-5至约Ig,约10-5至约10、，约I(T4至约10、，约I(T3至约10、，或约I(T3至约10、每g纤维素。[0279]发璧。可通过一种或多种(例如几种)能将糖直接或间接发酵成所需发酵产物的发酵微生物发酵自经水解的纤维素材料获得的可发酵糖。“发酵”或“发酵方法”指任何发酵方法或包含发酵步骤的任何方法。发酵方法还包括用于消费品醇工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品业(例如，发酵乳产品)、皮革业和烟草业的发酵方法。发酵条件依赖于期望的发酵产物和发酵生物体，并且能由本领域的技术人员容易地确定。[0280]在发酵步骤中，作为预处理和酶水解步骤的结果从纤维素材料释放的糖，通过发酵生物体(如酵母)发酵成为产物，例如，乙醇。如上所述，水解(糖化)和发酵可以是单独或同时的。[0281]在实施本发明的发酵步骤中可以使用任何合适的经水解的纤维素材料。通常根据所需发酵产品(即，要从发酵获得的物质)和使用的方法来选择所述材料，如本领域中所公知的。[0282]术语“发酵培养基”在本文中可理解为指加入发酵微生物之前的培养基，如，由糖化过程产生的培养基，以及同时糖化和发酵方法(SSF)中使用的培养基。[0283]“发酵微生物”指适用于理想的发酵方法产生发酵产物的任何微生物，包括细菌和真菌生物体。发酵生物体可以是己糖和/或戊糖发酵生物体，或它们的组合。己糖和戊糖发酵生物体在本领域均是公知的。合适的发酵微生物能将糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖和/或寡糖)直接或间接地发酵(即，转化)成所需的发酵产品。可产生乙醇的细菌和真菌发酵生物体的实例如Lin等，2006，Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627-642所述。[0284]能发酵己糖的发酵微生物的实例包括细菌和真菌生物体，如酵母。优选的酵母包括假丝酵母属、克鲁维酵母属和酵母属，例如Candidasonorensis、马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母的菌株。[0285]以其天然状态能发酵戊糖的发酵生物体的实例包括细菌和真菌生物体，如一些酵母。优选的木糖发酵酵母包括假丝酵母属，优选休哈塔假丝酵母(Candidasheatae)或Candidasonorensis;和毕赤酵母属,优选树干毕赤酵母(Pichiastipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS5773的菌株。优选的戍糖发酵酵母包括管囊酵母属(Pachysolen),优选嗜鞋管囊酵母(Pachysolentannophilus)的菌株。不能够发酵戍糖如木糖和阿拉伯糖的生物可通过本领域已知方法遗传修饰而发酵戊糖。[0286]能有效地将己糖和戊糖发酵成乙醇的细菌的实例包括，例如，凝结芽孢杆菌、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、热纤维梭菌(Clostridiumthermocellum)、Clostridiumphytofermentans、地芽抱杆菌属菌种、解糖热厌氧杆菌(ThermoanaerobactersaccharoIyticum)和运动发酵单胞菌(Philippidis,1996,见上文)。[0287]其它发酵生物包括芽孢杆菌属，如凝结芽孢杆菌；假丝酵母属，如Candidasonorensis、C.methanosorbosa、迪丹斯假丝酵母(Candidadiddensii)、近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)、C.naedodendra、C.blanki1、C.entomophilia、芸薹假丝酵母(C.brassicae)、假热带假丝酵母(Candidapseudotropicalis)、博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)、产I元假丝酵母(Candidautilis)和休哈塔假丝酵母(C.scehatae)；梭菌属，如丙酮丁醇梭菌、热纤维梭菌和C.phytofermentans;大肠杆菌，特别是经遗传修饰促进乙醇产率(yield)的大肠杆菌菌株；地芽孢杆菌属菌种；汉逊酵母属，如异常汉逊酵母(Hansenulaanomala);克雷伯氏菌属(Klebsiella),如产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca);克鲁维酵母属,如马克斯克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母(K.1atic)、K.thermotoIerans和脆壁克鲁维酵母；裂殖酵母属，如粟酒裂殖酵母(S.pombe);热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter),如解糖热厌氧杆菌,和发酵单胞菌属，如运动发酵单胞菌的菌株。[0288]在一个优选的方面，酵母是酒香酵母属(Bretannomyces)。在一个更优选的方面，酵母是克劳森酒香酵母(Bretannomycesclausenii)。在另一个更优选的方面,酵母是假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Candidasonorensis。在另一个更优选的方面,酵母是博伊丁假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Candidablankii。在另一个更优选的方面，酵母是芸薹假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是迪丹斯假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是CandidaentomophiIiia0在另一个更优选的方面,酵母是假热带假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是休哈塔假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是产朊假丝酵母。在另一个优选的方面，酵母是棒孢酵母属(Clavispora)。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(ClavisporaIusitaniae)。在另一个更优选的方面，酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavisporaopuntiae)。在另一个优选的方面，酵母是克鲁维酵母。在另一个更优选的方面，酵母是脆壁克鲁维酵母。在另一个更优选的方面，酵母是马克斯克鲁维酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Kluyveromycesthermotolerans。在另一个优选的方面，酵母是管囊酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是嗜鞣管囊酵母。在另一个优选的方面，酵母是毕赤酵母。在另一个更优选的方面，酵母是树干毕赤酵母。在另一个优选的方面，酵母是酵母属菌种。在另一个优选的方面，酵母是酿酒酵母。在另一个更优选的方面，酵母是糖化酵母(Saccharomycesdistaticus)。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)。[0289]在一个优选的方面，细菌是芽孢杆菌属。在一个更优选的方面，细菌是凝结芽孢杆菌。在另一个更优选的方面，细菌是梭菌属。在另一个更优选的方面，细菌是丙酮丁醇梭菌。在另一个更优选的方面，细菌是Clostridiumphytofermentans□在另一个更优选的方面，细菌是热纤维梭菌。在另一个更优选的方面，细菌是地芽孢杆菌属菌种。在另一个更优选的方面，细菌是热厌氧杆菌属。在另一个更优选的方面，细菌是解糖热厌氧杆菌。在另一个更优选的方面，细菌是发酵单胞菌属。在另一个更优选的方面，细菌是运动发酵单胞菌。[0290]商业上可得到的适合乙醇产生的酵母包括，例如BIOFERMtmAFT和XR(NABC-NorthAmericanBioproductsCorporation,GA,USA),ETHANOLREDtm酵母(RedStar/Lesaffre,USA)、FALI?(Fleischmann，sYeast,BurnsPhilpFoodInc.，USA)，FERMIOLtm(DSMSpecialties)，GERTSTRAND?(GertStrandABiSweden)以及SUPERSTART^和THERMOSACC^新鲜酵母(EthanolTechnology，WI，USA)。[0291]在一个优选的方面，发酵微生物已经经过遗传修饰，以提供发酵戊糖的能力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。[0292]已经通过将异源基因克隆入多种发酵微生物构建了能将己糖和戊糖转化成乙醇(共发酵)的生物体(Chen和Ho，1993，CloningandimprovingtheexpressionofPichiastipitisxylosereductasegeneinSaccharomycescerevisiae，Appl.Biochem.Biotechnol.39-40:135-147；Ho等，1998，GeneticallyengineeredSaccharomycesyeastcapableofeffectivelycofermentingglucoseandxylose,Appl.Environ.Microbiol.64:1852-1859；Kotter和Ciriacy，1993，XylosefermentationbySaccharomycescerevisiae,Appl.Microbiol.Biotechnol.38:776-783；Walfridsson等，1995，Xylose-metabolizingSaccharomycescerevisiaestrainsoverexpressingtheTKLlandTALlgenesencodingthepentosephosphatepathwayenzymestransketolaseandtransaldolase,Appl.Environ.Microbiol.61:4184-4190；Kuyper等，2004，MinimalmetabolicengineeringofSaccharomycescerevisiaeforefficientanaerobicxylosefermentation:aproofofprinciple，FEMSYeastResearch4:655—664;BealI等，1991，ParametricstudiesofethanolproductionfromxyloseandothersugarsbyrecombinantEscherichiacoli，Biotech.Bioeng.38:296-303；Ingram等，1998，Metabolicengineeringofbacteriaforethanolproduction，Biotechnol.Bioeng.58:204-214;Zhang等，1995，MetabolicengineeringofapentosemetabolismpathwayinethanologenicZymomonasmobilis，Science267:240-243;Deanda等，1996，Developmentofanarabinose-fermentingZymomonasmobilisstrainbymetabolicpathwayengineering,Appl.Environ.Microbiol.62:4465-4470；W02003/062430,XyloseIsomerase)。[0293]在一个优选的方面,经过遗传修饰的发酵微生物是Candidasonorensis。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是大肠杆菌。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)。在另一个优选的方面,所述经遗传修饰的发酵微生物是马克斯克鲁维酵母。在另一个优选的方面，所述经遗传修饰的发酵微生物是酿酒酵母。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是运动发酵单胞菌。[0294]本领域中公知的是，上述生物体还能用于产生其它物质，如本文所述。[0295]通常向降解的纤维素材料或水解物加入发酵微生物，并进行约8至约96小时，例如约24至约60小时发酵。温度通常为约26°C至约60°C，例如约32°C或50°C，并且在约pH3至约pH8，例如约pH4-5、6或7。[0296]在一个方面，对降解的纤维素材料施用酵母和/或另一种微生物，并进行约12至约96小时，如通常为24-60小时发酵。在另一个方面，温度优选为约20°C至约60°C，例如约25°C至约50°C，并且约32°C至约50°C，约32°C至约50°C，并且pH通常为约pH3至约PH7，例如约pH4至约pH7。然而，一些发酵生物体例如细菌，具有更高的最适发酵温度。酵母或另一种微生物优选以约IO5-1O12,优选约IO7-1Oltl,特别是约2xl08活细胞计数每ml发酵液的量施用。关于使用酵母进行发酵的进一步指导可以在例如“TheAlcoholTextbook，，(K.Jacques,T.P.Lyons和D.R.Kelsall编，NottinghamUniversityPress,UnitedKingdoml999)中找到,其通过提述并入本文。[0297]发酵刺激剂可以与本文所述的任何工艺组合使用，以进一步改进发酵方法，而且特定地，改进发酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率。“发酵刺激剂”指用于发酵微生物(特别是酵母)生长的刺`激剂。优选的用于生长的发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸(盐)、烟酸、内消旋肌醇(meso-1nositol)、硫胺素、吡唆醇(pyridoxine)、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素和维生素A、B、C、D^PE。参见，例如，Alfenore等,ImprovingethanolproductionandviabilityofSaccharomycescerevisiaebyavitaminfeedingstrategyduringfed-batchprocess,Springer-Verlag(2002),其通过提述并入本文。矿物质的实例包括能够提供营养物的矿物质和矿物质盐，所述营养物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。[0298]发酵产物:发酵产物可以是源自发酵的任何物质。发酵产物可以是，不限于，醇(例如，阿拉伯醇、正丁醇、异丁醇、乙醇、甘油、甲醇、乙二醇、1，3-丙二醇(丙二醇)、丁二醇、丙三醇、山梨醇和木糖醇)；烧烃(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二烷)；环烷烃(例如环戊烷、环己烷、环庚烷、和环辛烷)；烯烃(例如戊烯、己烯、庚烯和辛烯)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；气体(例如，甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO));异戊二烯；酮(例如，丙酮)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；和聚酮化合物。发酵产物还可以是作为高价值产品的蛋白质。[0299]在一个优选的方面，发酵产物是醇。可理解的是，术语“醇”包括包含一个或多个(例如几个)羟基基团的物质。在更优选的方面，所述醇是正丁醇。在另一个更优选的方面，所述醇是异丁醇。在另一个更优选的方面，所述醇是乙醇。在另一个更优选的方面，所述醇是甲醇。在另一个更优选的方面，所述醇是阿拉伯醇。在另一个更优选的方面，所述醇是丁二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是乙二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是甘油(glycerin)。在另一个更优选的方面,所述醇是甘油(glycerol)。在另一个更优选的方面，所述醇是1，3-丙二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是山梨醇。在另一个更优选的方面，所述醇是木糖醇。参见，例如，Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,和Tsao,G.T.,1999,Ethanolproductionfromrenewableresources,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.编，Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241；Silveira,M.M.,和Jonas,R.,2002,Thebiotechnologicalproductionofsorbitol,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:400-408；Nigam,P.,和Singh,D.,1995,Processesforfermentativeproductionofxylitol-asugarsubstitute,ProcessBiochemistry30(2):117-124；Ezeji,T.C.,Qureshi,N.和Blaschek,H.P.,2003,Productionofacetone,butanolandethanolbyClostridiumbeijerinckiiBAlOlandinsiturecoverybygasstripping,WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnologyl9(6):595-603。[0300]在另一个优选的方面，所述发酵产物是烷烃。所述烷烃是未支化或支化的烷烃。在另一个更优选的方面，所述烷烃是戊烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是己烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是庚烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是辛烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是壬烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是癸烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是十一烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是十二烷。[0301]在另一个优选的方面，所述发酵产物是环烷烃。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环戊烷。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环己烷。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环庚烷。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环辛烷。[0302]在另一个优选的方面，所述发酵产物是烯烃。所述烯烃可为未支化或支化的烯烃。在另一个更优选的方面，所述烯烃是戊烯。在另一个更优选的方面，所述烯烃是己烯。在另一个更优选的方面，所述烯烃是庚烯。在另一个更优选的方面，所述烯烃是辛烯。[0303]在另一个优选的方面，所述发酵产物是氨基酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是天冬氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是赖氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是丝氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是苏氨酸。参见，例如，Richard,A.,^PMargaritis,A.,2004,Empiricalmodelingofbatchfermentationkineticsforpoly(glutamicacid)productionandothermicrobialbiopolymers,BiotechnologyandBioengineering87(4):501-515。[0304]在另一个优选的方面，所述物质是气体。在另一个更优选的方面，所述气体是甲烷。在另一个更优选的方面，所述气体是H2。在另一个更优选的方面，所述气体是C02。在另一个更优选的方面，所述气体是CO。参见，例如，Kataoka，N.，A.Miya,和K.Kiriyama,1997,Studiesonhydrogenproductionbycontinuousculturesystemofhydrogen-producinganaerobicbacteria，WaterScienceandTechnology36(6-7):41-47jBGunaseelanV.N.于BiomassandBioenergy,Vol.13(1-2)，pp.83—114，1997，Anaerobicdigestionofbiomassformethaneproduction:Areview。[0305]在另一个优选的方面，所述发酵产物是异戊二烯。[0306]在另一个优选的方面，所述发酵产物是酮。应理解的是，术语“酮”涵盖了含有一个或多个(例如几个)酮模块的酮。在另一个更优选的方面，所述酮是丙酮。参见，例如Qureshi和Blaschek,2003,见上文。[0307]在另一个优选的方面，所述发酵产物是有机酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是醋酮酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是己二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是抗坏血酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是柠檬酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是2，5-二酮-D-葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是甲酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是反丁烯二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖醛酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是戊二酸。在另一个优选的方面，所述有机酸是3-羟基丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是衣康酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乳酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是苹果酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是草酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是琥珀酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是木糖酸。参见，例如，Chen,R.,和Lee,Y.Y.,1997,Membrane-mediatedextractivefermentationforlacticacidproductionfromcellulosicbiomass,Appl.Biochem.Biotechnol.63-65:435—448。[0308]在另一个优选的方面,所述物质是聚酮化合物(polyketide)。[0309]Μ--可以使用本领域已知的任`何`方法，任选地从发酵培养基回收发酵产物，所述方法包括，但不限于，层析、电泳方法、差示溶解度、蒸馏或提取。例如，通过常规蒸馏方法从发酵的纤维素材料分离并纯化醇。可以获得纯度高达约96ν01%的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、饮用乙醇，即，中性饮料酒,或工业乙醇。[0310]通过以下实施例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。实施例[0311]菌株[0312]里氏木霉菌株981-0-8(D4)是里氏木霉RutC30的诱变株(ATCC56765；Montenecourt和Eveleigh,1979,Adv.Chem.Ser.181:289-301)。[0313]里氏木霉菌株AgJgl15-104-7B1(PCT/US2010/061105，W02011/075677)是里氏木霉菌株981-0-8(D4)的ku70衍生物。[0314]培养基和缓冲溶液[0315]2XYT加氨苄青霉素平板由16g的胰蛋白胨，IOg的酵母提取物，5g的氯化钠，15g的Bacto琼脂，和去离子水加至I升构成。在经蒸汽灭菌的培养基冷却至55°C之后添加一ml的100mg/ml氨苄青霉素溶液。[0316]SOC培养基由20g的Bacto-胰蛋白胨，5g的Bacto酵母提取物，0.5g的NaCl，2.5ml的IMKC1，和去离子水加至I升构成。在蒸汽灭菌之前，将pH用IONNaOH调整至7.0。然后在即将使用前添加20ml的灭菌IM葡萄糖。[0317]COVE盐溶液由26g的KC1，26g的MgSO4.7H20,76g的KH2PO4,50ml的COVE痕量金属溶液，和去离子水加至1升构成。[0318]COVE痕量金属溶液由0.04g的NaB4O7.IOH2O,0.4g的CuSO4.5H20，1.2g的FeSO4.7H20，0.7g的MnSO4.H2O,0.8g的Na2MoO2.2H20,10g的ZnSO4.7H20，和去离子水加至I升构成。[0319]COVE平板由342.3g的蔗糖，20ml的COVE盐溶液，IOml的IM乙酰胺，IOml的1.5MCsCl,25g的Noble琼脂(Difco),和去离子水加至I升构成。[0320]C0VE2平板由30g的蔗糖，20ml的COVE盐溶液，10ml的IM乙酰胺，25g的Noble琼脂(Difco),和去离子水加至1升构成。[0321]木霉属痕量金属溶液由216g的FeCl3.6Η20，58g的ZnSO4.7Η20，27g的MnSO4.Η20，IOg的CuSO4.5Η20，2.4g的H3BO3,336g的柠檬酸，和去离子水加至I升构成。[0322]CIM培养基由20g的纤维素，IOg的玉米衆固形物(cornsteepsolids),1.45g的(NH4)2SO4,2.08g的KH2PO4,0.28g的CaCl2,0.42g的MgSO4.7H20，0.42ml的木霉属痕量金属溶液，1-2滴抑泡剂，和去离子水加至I升构成；pH调整至6.0。[0323]YP培养基由10g的酵母提取物，20g的Bacto蛋白胨，和去离子水加至I升构成。[0324]PEG缓冲液由500g的聚乙二醇4000(PEG4000)，IOmMCaCl2,IOmMTris-HClpH7.5，和去离子水加至I升构成；过滤灭菌。[0325]PDA平板由39g的PotatoDextrose琼脂(Difco)和去离子水加至I升构成。[0326]PDA覆盖培养基由39g的PotatoDextrose琼脂(Difco),2.44g的尿苷,和去离子水加至I升构成。将之前蒸汽灭菌的培养基在微波炉中熔融，然后在使用前冷却至55°C。[0327]STC由IM山梨醇，IOmMmMCaCl2，和10mMTris-HCl,pH7.5构成；过滤灭菌。[0328]TE缓冲液由IMTrisρΗ8.0和0.5MEDTAPH8.0构成。[0329]20ΧSSC由175.3g的NaCl，88.2g的柠檬酸钠，和去离子水加至I升构成。[0330]TrMM-G培养基由20ml的COVE盐溶液，6g的(NH4)2S04,0.6g的CaCl2,25g的Nobel琼脂(Difco)，20g的葡萄糖,和去离子水加至I升构成。[0331]NZY+培养基由5g的NaCl,3g的MgSO4.7Η20，5g的酵母提取物，IOg的NZ胺，1.2g的MgCl2,4g的葡萄糖，和去离子水加至I升构成。[0332]实施例1:里氏木霉cbhl-烟曲霉cbhl替代构建体pJfyS139的构建[0333]将烟曲霉纤维二糖水解酶(cbhl)编码序列(SEQIDNO:1[DNA序列]和SEQIDNO:2[推导的氨基酸序列])从pEJG93(W02011/057140)使用下示的基因特异性正向和反向引物进行扩增。斜体区域代表与IN-FUSION?反应的插入位点同源的载体，而下划线部分为引入的PacI位点[0334]正向引物:[0335]5，-cgcggactgcgcaccATGCTGGCCTCCACCTTCTCCTACC-3’(SEQIDNO:31)[0336]反向引物:[0337]5，-ctttcgccacggagcttaattaaCTACAGGCACTGAGAGTAATAATCA-3，(SEQIDNO:32)[0338]扩增反应物由20ng的pEJG93，各200μM的dNTP，0.4μM引物，IXHERCULASE?ReactionBuffer(Stratagene,LaJolla,CA,USA)，和1.875单位的HF.RCl.JLASFyK-;HotStartHigh-FidelityDNAPolymerase(Stratagene,LaJolla,CA,USA)构成，最终体积为50μI。将扩增反应物在EPPENDORF电MASTHRCYCLER^5333epgradientS(EppendorfScientific,Inc.,Westbury,NY,USA)中温育，其程序如下:I个循环，在95°C进行2分钟；30个循环，每循环在95°C进行30秒，55°C进行30秒，和72°C进行I分钟；和I个循环，在72°C进行7分钟。PCR产物通过使用40mMTris碱，20mM柠檬酸钠，ImMEDTA二钠盐(TAE)缓冲液的I%琼脂糖凝胶电泳分离，其中1.6kb片段从凝胶切出和使用MINEIXJTE?GelExtractionKit(QIAGENInc.，Valencia,CA,USA)依照生广商的实验方案提取。[0339]将1.6kbPCR产物使用IN-1'USH.1N'vAdvantagePCRCloningKit(Clontech，PaloAlto，CA，USA)依照生产商的实验方案插入NcoI/Pac1-消化的pSMail55(W005/074647)。所述IN-FUSION?,反应由IXIN-FUSION?ReactionBuffer(Clontech,PaloAlto,CA,USA)，125ng的NcoI/Pac1-消化的pSMail55,IOOng的所述1.6kbPCR产物，和IμI的IN-FUSION?Enzyme(Clontech,PaloAlto,CA,USA)构成，反应体积为10μI。将所述反应在37°C温育15分钟，接着在50°C温育15分钟。在温育期之后，将40μI的TE缓冲液添加至反应，使用2μI等分试样依照生产商的实验方案转化ONESHOT?T0P10感受态细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。将细胞在42°C热休克30秒并添加250μI的SOC培养基。将管在37°C，200rpm温育I小时，并将250μI铺板于150_直径2ΧΥΤ加氨苄青霉素平板，并在37°C温育过夜。将所得的转化体通过测序筛选，并鉴定出一个含有不具有PCR错误的插入物的克隆，将其命名为pJfyS139-A。将pJfyS139_A用于插入单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(tk)基因。[0340]将单纯疱疹病毒tk编码序列(SEQIDNO:33[DNA序列]和SEQIDN0:34[推导的氨基酸序列])从pJfyS1579-8-6(W02010/039840)通过用BglII和BamHI消化该质粒而释放出。对消化物进行使用TAE缓冲液的1%琼脂糖凝胶电泳，其中2.3kb条带从凝胶切出并使用MINELUTE?GelExtractionKit提取。将tk基因使用QUICKLIGAT10N?Kit(NewEnglandBiolabs,Inc.，Ipswich,MAUSA)依照生产商的实验方案插ΛBamH1-消化的、小牛肠磷酸酶处理的pJfyS139-A。连接反应由构成50ng的所述BamH1-消化的、小牛肠磷酸酶处理的ppJfyS139-A，50ng的2.3kbtk基因插入物，IXQUICKLIGATION?缓冲液(NewEnglandBiolabs,Inc.,Ipswich,MAUSA)，和5单位的QUICKLIGASE?(NewEnglandBiolabs,Inc.，Ipswich,MAUSA)，最终体积为20μI。将反应在室温温育5分钟，并使用2μI的反应物依照生产商的实验方案转化ONESHOT?T0P10感受态细胞。将细胞在42°C热休克30秒，并添加250μ1的SOC培养基。将管在37°C，200rpm温育I小时，并将250μI铺板于150_直径2ΧΥΤ加氨苄青霉素平板，并在37°C温育过夜。将所得的转化体通过用XmaI的限制性消化分析来筛选，以确定插入物的存在和取向，并鉴定出一个含有所述插入物的克隆，将其命名为pJfyS139-B。将pJfyS139-B用于插入里氏木霉3’cbhl基因侧翼序列。[0341]3’cbhI基因侧翼序列从里氏木霉RutC30基因组DNA使用下述正向和反向引物扩增。下划线部分代表用于克隆的引入的Notl位点。[0342]正向引物:[0343]5，-ttagactgcggccgcGTGGCGAAAGCCTGACGCACCGGTAGAT-3，(SEQIDNO:35)[0344]反向引物:[0345]5，-agtagttagcggccgcACGGCACGGTTAAGCAGGGTCTTGC-3，(SEQIDNO:36)[0346]将里氏木霉RutC30在250ml带挡板的摇瓶中50ml的补充2%葡萄糖(w/v)的YP培养基中在28°C在200rpm搅拌下生长2日。菌丝体通过使用MiR/U’LOTif丨_<)(Calbiochem,LaJolla,CA,USA)的过滤收获,在去离子水中洗漆两次,并在液氮下冻结。将冻结的菌丝体通过杵和研钵磨碎至精细粉末。总DNA使用DNEASY?PlantMaxiKit(QIAGENInc.，Valencia,CA，USA)分离，其中裂解温育延长至2小时。[0347]扩增反应物由150ng的里氏木霉RutC30基因组DNA，各200μΜ的dNTP，0.4μΜ引物，IXHERCULASE?ReactionBuffer,和1.875单位的HERCULASE?HotStartHigh-FidelityDNAPolymerase构成，最终体积为50μl。扩增反应物在EPPENDORF?MASTRRCYCLER?5333印gradientS中温育，其程序如下:1个循环，在95°C进行2分钟；30个循环，每循环在95°C进行30秒，60°C进行30秒，和72°C进行1分钟30秒；和1个循环，在72°C进行7分钟。[0348]对PCR反应物依照生产商的实验方案施以MINELUTE?NucleotideRemovalKit(QIAGENInc.，Valencia,CA，USA)。将所得的PCR混合物用NotI消化，并将消化的PCR产物通过使用TAE缓冲液的1%琼脂糖凝胶电泳分离。将含有3’cbhl基因侧翼序列的1.3kb片段从凝胶切出，并使用MINELUTE?GelExtractionKit提取。将所述1.3kb片段使用QUICKLIGAT10N?Kit插入Not1-直链化、小牛肠磷酸酶处理的pJfyS139_B。所述QUICKLIGATION?反应由IOOng的所述Not1-直链化、小牛肠磷酸酶处理的pJfyS139_B，20ng的所述1.3kb片段，IXQUICKLIGAT10N?Buffer，和5单位的QUICKLIGASE?构成，最终体积为20μl。将所述反应物在室温温育5分钟，并将2μI的的所述反应物用于依照生产商的实验方案转化ONESHOT?T0P10感受态细胞。将细胞在42°C热休克30秒，并添加250μI的SOC培养基。将管在37°C，200rpm温育I小时，并将250μI铺板于150mm直径2XYT加氨苄青霉素平板，并在37°C温育过夜。将所得的转化体通过用XmaI的限制性消化分析来筛选，以确定插入物的存在和取向，并对阳性克隆测序。将一个含有不具有PCR错误的3’cbhl基因侧翼序列的克隆命名为pJfyS139(图1)。将pJfyS139用作载体以替代里氏木霉cbhl基因。[0349]实施例2:里氏木霉原生质体生成和转化[0350]原生质体制备和转化使用Penttila等，1987,Gene61:155-164的修饰的实验方案进行。简言之，将里氏木霉菌株AgJgll5-104-7Bl(PCT/US2010/061105，W02011/075677)在补充2%(w/v)葡萄糖和IOmM尿苷的25ml的YP培养基在27°C在90rpm的轻柔搅拌下培养17小时。菌丝体通过使用VacuumDrivenDisposableFiltrationSystem(Millipore,Bedford,MA,USA)过滤来收集，并用去离子水洗涤两次，并用1.2M山梨醇洗涤两次。原生质体通过将经洗漆的菌丝体在34°C在90rpm的轻柔振荡下悬于20ml的含有15mg每ml的GLUCANEX?200G(NovozymesA/S,Bagsvaerd,Denmark)和0.36单位每ml的壳多糖酶(SigmaChemicalC0.，St.Louis,MO,USA)的1.2M山梨醇中15-25分钟来生成。将原生质体通过在400xg离心7分钟并用冷1.2M山梨醇洗涤两次来收集。将原生质体使用血细胞计数器计数，并在STC中重悬至IxlO8原生质体每ml的最终浓度。将过量的原生质体在-8CTC储藏于Cryol°CFreezingContainer(Nalgene,Rochester,NY,USA)。[0351]将大约100μg的下述实施例中所述的转化质粒用PmeI消化。将消化反应通过使用TAE缓冲液的I%琼脂糖凝胶电泳来纯化。将DNA条带从凝胶切出，并使用QIAQUICKRGelExtractionKit(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)提取。将所得的纯化的DNA添加至100μ1的原生质体溶液并轻柔地混合。添加PEG缓冲液(250μ1)，混合，并在34°C温育30分钟。然后添加STC(3ml)，混合，并铺板于补充IM蔗糖的PDA平板。在28°C温育16小时之后，将20ml的补充35μg每ml的潮霉素B的覆盖PDA培养基添加至每个平板。将平板在28°C温育4-7日。[0352]实施例3:用烟曲霉cbhl编码序列替代天然的里氏木霉cbhl基因[0353]为了用烟曲霉bhl编码序列(SEQIDNO:1[DNA序列]和SEQIDNO:2[推导的氨基酸序列])替代里氏木霉天然cbhl基因(SEQIDNO:17[DNA序列]和SEQIDNO:18[推导的氨基酸序列])，将里氏木霉ku70-菌株AgJgll5-104-7Bl(PCT/US2010/061105，W02011/075677)用4x2μg的PmeI直链化的pJfyS139(实施例1)依照实施例2中所述的步骤来转化。获得了七个转化体，并将每一个挑取并转移至PDA平板，并在28°C温育7日。将基因组DNA从转化体根据实施例1中所述的步骤分离，并对每个转化体施以Southern分析。[0354]对于Southern分析，将2μg的基因组DNA用33单位的BglII在50μI反应体积中消化，并对其进行TAE缓冲液中的1%琼脂糖电泳。将凝胶中的DNA用一次在0.25ΝHCl中的10分钟洗涤来去嘌呤，用两次在0.5NNa0H-l.5MNaCl中的15分钟洗涤来变性，用一次在1MTrispH8-l.5MNaCl中的30分钟洗涤来中和，并在20XSSC中温育5分钟。将DNA使用TURB0BL0TTER?System(Whatman,Inc.,FlorhamPark,NJ,USA)依照生产商的实验方案转移至NYTRΛN?.丨'Supercharge膜(Whatman,Inc.,FlorhamPark,NJ,USA。将DNA使用STRATALINKER?UVCrosslinker(Stratagene,LaJolla，CA，USA)UV交联至膜，并在42°C在20ml的DIGEasyHyb(RocheDiagnosticsCorporation,Indianapolis,IN,USA)中予页杂交1小时。[0355]杂交于3’cbhl基因侧翼序列的探针使用DigProbeSynthesisKit(RocheDiagnosticsCorporation,Indianapolis,IN,USA)依照生产商的指不用下不的正向和反向引物来生成。PCR反应由IXHERCULASE⑩ReactionBuffer,各400nM的引物，200μMDIG-标记的含dUTP-的dNTP，20ng的pJfyS139，和1.5单位的HF,RClI1.ASF(R)HotStartHigh-FidelityDNAPolymerase构成。扩增反应物在EPPHNDORF.1vMASTERt'YCLCR见5333印gradientS中温育，其程序如下:1个循环，在95°C进行2分钟；25个循环，每循环在95°C进行30秒，55°C进行30秒，和72°C进行40秒；和1个循环，在72°C进行7分钟。[0356]正向引物:[0357]5，-AAAAAACAAACATCCCGTTCATAAC-3，(SEQIDNO:37)[0358]反向引物:[0359]5，-AACAAGGTTTACCGGTTTCGAAAAG-3’(SEQIDNO:38)[0360]将探针通过使用TAE缓冲液的I%琼脂糖凝胶电泳纯化，其中对应于探针的0.5kb条带从凝胶切出并使用MINE.LUTE^H)GelExtractionKit提取。将探针煮沸5分钟,在冰上冷却2分钟，并添加至IOml的DIGEasyHyb以产生杂交溶液。杂交在42°C进行15-17小时。然后将膜在低严格条件下在2XSSC加0.1%SDS中在室温洗涤5分钟，接着进行在0.5XSSC加0.1%SDS中在65°C的两次高严格性洗涤，每次15分钟。探针-靶杂交通过化学发光测定(RocheDiagnostics,Indianapolis,IN,USA)依照生产商的指示来检测。Southern分析指示7个转化体中的3个含有在cbhl基因座的替代盒,且选择一个转化体里氏木霉JfyS139_8用于消除(cure)hpt和tk标志物。[0361]生成孢子的新鲜平板，即将在28°C生长7日龄PDA平板的孢子转移至PDA平板，并在28°C温育7日。将孢子在IOml的0.01%TWEEN?20中使用灭菌的涂布器收集。孢子的浓度使用血细胞计数器确定，并将105个孢子铺板于含有补充IμM5-氟_2’-脱氧尿苷(FdU)的TrMM-G培养基的150mm平板上。[0362]获得了三百个FdU抗性的孢子分离株，并从上述孢子分离株中的2个提取了DNA。对分离株进行如上所述的Southern分析，且结果指示两个孢子分离株均切出了替代和的同源重复之间的hpt/tk区。选择一个称作里氏木霉JfyS139-8A的菌株用于替代cbhll基因。[0363]实施例4:空里氏木霉cbhll替代构建体pJfyS142的构建[0364]为了生成构建体以用烟曲霉cbhll编码序列(SEQIDNO:3[DNA序列]和SEQIDNO:4[推导的氨基酸序列])替代里氏木霉cbhll基因(SEQIDNO:19[DNA序列]和SEQIDNO:20[推导的氨基酸序列])，里氏木霉cbhll启动子首先从里氏木霉RutC30基因组DNA使用下示的基因特异性正向和反向引物扩增。里氏木霉RutC30基因组DNA根据实施例1中所述的步骤制备。[0365]正向引物:[0366]5’-acgaattgtttaaacgtcgacCCAAGTATCCAGAGGTGTATGGAAATATCAGAT-3’(SEQIDNO:39)[0367]反向引物:[0368]5，-cgcgtagatctgcggccatGGTGCAATACACAGAGGGTGATCTT-3’(SEQIDNO:40)[0369]扩增反应物由20ng的里氏木霉RutC30基因组DNA，各200μM的dNTP，0.4μM引物，IXHERCULASECSReactionBuffer,和1.875单位的HERCULASE?HotStartHigh-FidelityDNAPolymerase构成，最终体积为50μI。扩增反应物在EPPENDRF?MATERCYCLER?中温育，其程序如下:I个循环，在95°C进行2分钟；25个循环，每循环在95°C进行30秒，55°C进行30秒，和72°C进行I分钟30秒；和I个循环，在72°C进行7分钟。PCR产物通过使用TAE缓冲液的I%琼脂糖凝胶电泳分离，其中1.6kb片段从凝胶切出并使用ExtractionKit提取。[0370]将1.6kbPCR产物使用IN-FUSION?AdvantagePCRCloningKit依照生产商的实验方案插入NcoI/Sal1-消化的pSMail55(W005/074647)。所述IN-FUSIONK.反应由IXIN-FUSION?ReactionBuffer,125ng的NcoI/Sal1-消化的pSMail55,IOOng的所述1.6kbPCR产物，和IμI的IN-FUSIONSEnzyme构成，反应体积为10μI。将所述反应在37°C温育15分钟和在50°C温育15分钟。在温育期之后将40μI的TE添加至反应。将2μI等分试样用于依照生产商的实验方案转化ONESHOT.!::T0P10感受态细胞。将细胞在42°C热休克30秒并添加250μI的SOC培养基。将管在37°C，200rpm温育I小时并将250μI铺板于150mm直径2XYT加氨苄青霉素平板并在37°C温育过夜。将所得的转化体通过用PciI的限制性消化来筛选并对正向克隆测序以确保不存在PCR错误。鉴定出了一个含有不具有PCR错误的插入物的克隆，并将其命名为pJfyS142-A。将质粒pJfyS142_A用于插入里氏木霉cbhll终止子。[0371]所述cbhll终止子从里氏木霉RutC30基因组DNA使用下示的基因特异性正向和反向引物扩增。斜体区域代表与IN-FUSKJNl反应中的插入位点同源的载体。[0372]正向引物:[0373]5，-atctacgcgtactagttaattaaGGCTTTCGTGACCGGGCTTCAAACA-3’(SEQIDN0:41)[0374]反向引物:[0375]5，-gcggccgttactagtggatccACTCGGAGTTGTTATACGCTACTCG-3’(SEQIDNO:42)[0376]扩增反应物由150ng的里氏木霉RutC30基因组DNA，各200μΜ的dNTP，0.4μΜ引物，IXHERCULASE⑧ReactionBuffer,和1.875单位的HERCULASE?HotStartHigh-FidelityDNAPolymerase构成，最终体积为50μI。扩增反应物在EPPENDORFMASTERCYUiRf中温育，其程序如下:1个循环，在95°C进行2分钟；25个循环，每循环在95°C进行30秒，5`4°C进行30秒，和72°C进行50秒；和I个循环，在72°C进行7分钟。将PCR产物通过使用TAE缓冲液的I%琼脂糖凝胶电泳来分离，其中将0.3kb片段从凝胶切出并使用MINELUTE?GelExtractionKit提取。[0377]将所述0.3kbPCR产物使用I\-丨'USIOW::AdvantagePCRCloningKit依照生产商的实验方案插入PacI/BamH1-消化的pJfyS142_A。所述IN-FUSION?反应由IXIN-FUSION?ReactionBuffer,150ng的Pacl/BamH1-消化的pJfyS142_A,50ng的0.3kbPCR产物，和IμI的IN-FUSION?Enzyme构成，反应体积为10μI。将所述反应在37°C温育15分钟和在50°C温育15分钟。在温育期之后将40μI的TE添加至反应。将2μI等分试样用于依照生产商的实验方案转化ONESHOT-T0P10感受态细胞。将细胞在42°C热休克30秒并添加250μI的SOC培养基。将管在37°C，200rpm温育I小时并将250μI铺板于150_直径2ΧΥΤ加氨苄青霉素平板并在37°C温育过夜。通过序列分析筛选转化体来鉴定阳性克隆和确保不存在PCR错误。鉴定出了一个含有不具有PCR错误的插入物的克隆，并将其命名为pJfyS142-B。将质粒pJfyS142_B用于插入单纯疱疹tk基因。[0378]将单纯疱疹病毒tk基因从pJfyS1579-8_6(W02010/039840)通过用BglII和BamHI消化所述质粒来释放出。对消化物施以使用TAE缓冲液的I%琼脂糖凝胶电泳，其中2.3kb条带从凝胶切出并使用MINELUTEiKGelExtractionKit提取。将tk盒使用QUICKLIGAT10N?Kit依照生产商的实验方案插入BamH1-消化的、小牛肠磷酸酯酶去磷酸的pJfyS142-B。所述连接反应由50ng的所述BamH1-消化的、小牛肠磷酸酯酶去磷酸的pJfyS142-B，50ng的2.3kbtk基因插入物，IXQUICKLIGAT10N?Buffer，和5单位的QUICKLIGASE?构成，连接体积为20μI。将反应物在室温温育5分钟并将2μI的所述反应物用于依照生产商的实验方案转化ONESiK)TTOPlO感受态细胞。将细胞在42°C热休克30秒并添加250μI的SOC培养基。将管在37°C，200rpm温育I小时并将250μI铺板于150mm直径2XYT加氨苄青霉素平板并在37°C温育过夜。将所得的转化体通过用XmaI和BamHI的限制性消化来筛选来确定插入物的存在和取向，并鉴定了含有插入物的克隆，并将其命名为pJfyS142-C。将质粒pJfyS142-C用于插入里氏木霉3’cbhll基因侧翼序列。[0379]所述3’cbhll基因侧翼序列使用下示的正向和反向引物从里氏木霉RutC30基因组DNA扩增。斜体区域代表与IN-FUSION?反应中的插入位点同源的载体。[0380]正向引物:[0381]5，-atccatcacactggcggccgcGCTTCAAACAATGATGTGCGATGGT-3，(SEQIDNO:43)[0382]反向引物:[0383]5，-gatgcatgctcgagcggccgcCTACCTTGGCAGCCCTACGAGAGAG-3，(SEQIDNO:44)[0384]扩增反应物由150ng的里氏木霉RutC30基因组DNA，各200μM的dNTP，0.4μM引物，IXHERCULASE?ReactionBuffer,和1.875单位的HERCULASE?HotStartHigh-FidelityDNAPolymerase构成，最终体积为50μI。扩增反应物在r:m:NI)()R[_K.MASTRRCYtinRx中温育，其程序如下:1个循环，在95°C进行2分钟；30个循环，每循环在95°C进行30秒，56°C进行30秒，和72°C进行I分钟50秒；和I个循环，在72°C进行7分钟。对PCR反应进行使用TAE缓冲液的I%琼脂糖凝胶电泳，其中1.5kb条带从凝胶切出并使用MiNELUTE?GelExtractionKit提取。将所述3’cbhll基因侧翼序列使用IN-FUSION?AdvantagePCRCloningKit依照生产商的实验方案插ΛNot1-线性化的pJfyS142_C。所述IN-FUSION?反应由IXIN-FUSION?ReactionBuffer,150ng的pJfyS142-C,80ng的所述1.5kbPCR产物，和IμI的IN-FUSION^:Enzyme构成，反应体积为10μI。将所述反应在37°C温育15分钟和在50°C温育15分钟。在温育期之后将40μI的TE添加至反应。将2μI等分试样用于依照生产商的实验方案转化ONESIΙΟ?、Τ0Ρ10感受态细胞。将细胞在42°C热休克30秒并添加250μI的SOC培养基。将管在37°C，200rpm温育I小时并将250μI铺板于150mm直径2XYT加氨苄青霉素平板并在37°C温育过夜。将所得的转化体通过用BglII的限制性消化来筛选，并将阳性克隆测序以确保不存在PCR错误。鉴定出了一个含有不具有PCR错误的插入物的克隆，并命名为pJfyS142(图2)。使用质粒pJfyS142插入烟曲霉cbhll编码序列。[0385]实施例5:里氏木霉cbhll-烟曲霉cbhll替代构建体pJfyS144的构建[0386]所述烟曲霉cbhll编码序列(SEQIDNO:3[DNA序列]和SEQIDNO:4[推导的氨基酸序列])从PAlLo33(W02011/057140)使用下示的正向和反向引物扩增。斜体区域代表与IN-FUSION⑩反应的插入位点同源的载体。[0387]正向引物:[0388]5，-ctctgtgtattgcaccATGAAGCACCTTGCATCTTCCATCG-3’(SEQIDNO:45)[0389]反向引物:[0390]5，-ccggtcacgaaagccTTAATTAAAAGGACGGGTTAGCGTT-3，(SEQIDNO:46)[0391]扩增反应物由20ng的pAlLo33，各200μM的dNTP，0.4μM引物，ImMHERCULASE?ReactionBuffer,和1.875单位的HERCULASE?HotStartHigh-FidelityDNAPolymerase构成，最终体积为50μI。扩增反应物在EPPENDORF?MASTERCYCLRR.r中温育，其程序如下:1个循环，在95°C进行2分钟；30个循环，每循环在95°C进行30秒，55°C进行30秒，和72°C进行2分钟；和I个循环，在72°C进行7分钟。[0392]对PCR反应进行使用TAE缓冲液的I%琼脂糖凝胶电泳，其中1.7kb条带从凝胶切出并使川Pv_llNhLU'l'L..KGelExtractionKit提取。将所述1.7kbPCR产物使用IN-FUSION?AdvantagePCRCloningKit依照生产商的实验方案插入Ncol/Pac1-消化的pJfyS142(实施例4)。所述IN-FUSION?.反应由IXIN-FUSION?ReactionBuffer,120ng的NcoI/Pac1-消化的pJfyS142，70ng的1.7kbPCR产物，和1μl的IN-FUSION?Enzyme构成，反应体积为10μl。将所述反应在37°C温育15分钟和在50°C温育15分钟。在温育期之后将40μl的TE添加至反应。将2μl等分试样用于依照生产商的实验方案转化ONESHOT?Τ0Ρ10感受态细胞。将细胞在42°C热休克30秒并添加250μl的SOC培养基。将管在37°C，200rpm温育I小时并将250μl铺板于150mm直径2XYT加氨苄青霉素平板并在37°C温育过夜。对所得的转化体测序以确保不存在PCR错误和确定插入物的存在。[0393]鉴定出了一个具有不含错误的序列的克隆并命名为pJfyS144(图3)。使用质粒pJfyS144以用来自烟曲霉的cbhll编码序列替代天然cbhll基因。[0394]实施例6:用烟曲霉cbhll编码序列替代天然里氏木霉cbhll基因[0395]为了用烟曲霉cbhll编码序列(SEQIDNO:3[DNA序列]和SEQIDNO:4[推导的氨基酸序列])替代天然里氏木霉cbhll基因(SEQIDNO:19[DNA序列]和SEQIDNO:20[推导的氨基酸序列])，将里氏木霉JfyS139-8A(实施例3)根据实施例2中所述的步骤用2μg的Pme1-直链化和凝胶纯化的pJfyS144(实施例5)转化。获得了七个转化体，挑取每一个，并转移至PDA平板并在28°C温育7日。使用下述的真菌孢子PCR方法以筛选携带基因替代的转化体，其中使用了下示的退火于5’cbhll基因侧翼序列上游超过整合区域的区域的正向引物，和下示的退火于烟曲霉cbhll编码序列的反向引物。[0396]正向引物:[0397]5，-AGCCACATGCCGCATATTGACAAAG-3’(SEQIDNO:47)[0398]反向引物:[0399]5，-AGGGATTCAGTGTGCTACAGGCTGC-3’(SEQIDNO:48)[0400]仅在cbhll基因座处发生准确的基因替代时会生成1.8kbPCR产物。若盒整合至基因组的别处，不会导致扩增。[0401]将来自每个转化体的少量孢子悬于25μI的TE缓冲液中，并在微波炉以“高”档加热I分钟。将每个经微波加热的孢子悬液用作PCR反应中的模板。[0402]所述反应由1μl的所述微波加热的孢子悬液，各1μl的IOmMdNTP,12.5μl的2ΧADVANTAGE?GC-MeltLA缓冲液(Clontech，MountainView,CA,USA)，25pmol的正向引物，25pmol的反向引物，1.25单位的ADVANTAGP^)GCGenomeLAPolymeraseMix(Clontech,MountainView,CA,USA),和9.25μl的水构成。反应在EPPHNDORFXMASTFR('VdJlRR:5333印gradients中温育，其程序如下:1个循环，在95°C进行10分钟；35个循环，每循环在95°C进行30秒，56V进行30秒，和72°C进行1分钟40秒；1个循环，在72°C进行7分钟；和4°C维持。对PCR反应进行使用TAE缓冲液的1%琼脂糖凝胶电泳。孢子PCR指示七个转化体中的四个在靶向的基因座含有所述替代盒，且对其中三个进行Southern分析以确认替代盒为单拷贝。[0403]将基因组DNA从三个转化体根据实施例1中所述的步骤分离，并对每个转化体施以Southern分析。对于Southern分析,将2μg的基因组DNA用50μI反应体积中的50单位的DraI消化，并对其进行TAE缓冲液中的1%琼脂糖电泳。将凝胶中的DNA用一次在0.25ΝHCl中的10分钟洗涤来去嘌呤，用两次在0.5ΝNaOH-1.5ΜNaCl中的15分钟洗涤来变性，用一次在IMTrisρΗ8-1.5ΜNaCl中的30分钟洗涤来中和，并在20ΧSSC中温育5分钟。将DNA转移至NYTRAN?Supercharge膜。将DNA使用STRATALINKERtmUVCrosslinkerUV交联至膜，并在42。。在20ml的DIGEasyHyb中预杂交I小时。[0404]杂交于3’cbhll基因侧翼序列的探针使用DigProbeSynthesisKit依照生产商的指示用下示的正向和反向引物来生成。PCR反应由IXHERCULASEiS)ReactionBuffer,各400nM的引物，200μMDIG-标记的含dUTP-的dNTP,150ng的里氏木霉RutC30基因组DNA,和1.5单位的HERCULASE?HotStartHigh-FidelityDNAPolymerase。扩增反应物在EPPENDORFKMASTERCYCLER?5333印gradientS中温育，其程序如下:1个循环，在95°C进行2分钟；30个循环，每循环在95°C进行30秒，51°C进行30秒，和72°C进行40秒；和I个循环，在72°C进行7分钟。【权利要求】1.一种酶组合物，其包含:(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I;(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；和(iv)具有纤维素分解增强活性的青霉属种GH61多肽；或其同源物。2.权利要求1的酶组合物，其中所述烟曲霉纤维二糖水解酶I或其同源物选自下组:(i)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为SEQIDNO:2的成熟多肽；(ii)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少.92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一I"生；(iii)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少.96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下，与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；其中所述烟曲霉纤维二糖水解酶II或其同源物选自下组:(i)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为SEQIDNO:4的成熟多肽；(ii)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:4的成熟多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少.92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一I"生；(iii)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下，与SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；其中所述烟曲霉葡糖苷酶或其同源物选自下组:(i)β-葡糖苷酶，其包含或组成为SEQIDNO:6的成熟多肽；(ii)β-葡糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDΝΟ:6的成熟多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少.93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDΝΟ:5的成熟多肽编码序列具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iv)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下与SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；和(V)β-葡糖苷酶变体，其在对应于SEQIDNO:6的成熟多肽的位置100、283、456、和512的一个或多个位置包含取代，其中所述变体具有β_葡糖苷酶活性；和其中所述具有纤维素分解增强活性的青霉属种GH61多肽或其同源物选自下组:(i)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含或组成为SEQIDNO:8的成熟多肽；(ii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:8的成熟多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:7的成熟多肽编码序列具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下与SEQIDNO:7的成熟多肽编码序列杂交或其全长互补链。3.权利要求1或2的酶组合物，其中所述β-葡糖苷酶变体包含一种或多种(几种)选自下组的取代:G142S,Q183R,H266Q，和D703G。4.权利要求1-3任一项的酶组合物，其进一步包含一种或多种选自下组的酶:(i)烟曲霉木聚糖酶或其同源物，(ii)烟曲霉β_木糖苷酶或其同源物；或(iii)(i)和(ii)的组合；其中所述烟曲霉木聚糖酶或其同源物选自下组:(i)烟曲霉木聚糖酶，其包含或组成为SEQIDNO:10,SEQIDNO:12，或SEQIDNO:14的成熟多肽；(ii)木聚糖酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:10,SEQIDNO:12，或SEQIDNO:14的成熟多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，其包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:9,SEQIDΝΟ:11，或SEQIDNO:13的成熟多肽编码序列具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下与SEQIDNO:9,SEQIDN0:11，或SEQIDNO:13的成熟多肽编码序列；或其全长互补链杂交；其中所述烟曲霉木糖苷酶或其同源物选自下组:(i)β-木糖苷酶，其包含或组成为SEQIDNO:16的成熟多肽；(ii)β-木糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDΝ0:16的成熟多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少.93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:15的成熟多肽编码序列具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少.97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下与SEQIDNO:15的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。5.权利要求1-4任一项的酶组合物，其进一步包含一种或多种选自下组的酶:纤维素酶，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，半纤维素酶，酯酶，棒曲霉素，漆酶，木质素分解酶，果胶酶，过氧化物酶，蛋白酶，和膨胀素。6.一种重组丝状真菌宿主细胞，其包含编码下述的多核苷酸:(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I;(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II烟曲霉葡糖苷酶或其变体；和(iv)具有纤维素分解增强活性的青霉属种GH61多肽；或其同源物。7.权利要求6的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述纤维二糖水解酶I或其同源物选自下组:(i)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为SEQIDNO:2的成熟多肽；(ii)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少.84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少.92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一I"生；(iii)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列SEQIDΝΟ:1的成熟多肽编码序列具有至少70%，至少75%，至少.80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少.88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少.96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性与；和(iv)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；其中所述烟曲霉纤维二糖水解酶II或其同源物选自下组:(i)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为SEQIDNO:4的成熟多肽(ii)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:4的成熟多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少，84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少，92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同，一I"生；(iii)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列具有至少70%，至少75%，至少，80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少，88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少，96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件或至少非常高严格条件下与SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；其中所述烟曲霉葡糖苷酶或其同源物选自下组:(i)β-葡糖苷酶，其包含或组成为SEQIDNO:6的成熟多肽；(ii)β-葡糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:6的成熟多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少，93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少，97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件非常高严格条件下与SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；(V)β-葡糖苷酶变体，其在对应于SEQIDNO:6的成熟多肽的位置100、283、456、和，512的一个或多个位置包含取代，其中所述变体具有β_葡糖苷酶活性；和其中所述具有纤维素分解增强活性的青霉属种GH61多肽选自下组:(i)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含或组成为SEQIDN0:8的成熟多肽；(ii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:8的成熟多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:7的成熟多肽编码序列具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少，95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下与SEQIDNO:7的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。8.权利要求6或7的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述β-葡糖苷酶变体包含一种或多种(几种)选自下组的取代:G142S，Q183R，H266Q，和D703G。9.权利要求6-8任一项的酶组合物,其进一步包含一种或多种多核苷酸,所述多核苷酸编码一种或多种选自下组的酶:(i)烟曲霉木聚糖酶，(ii)烟曲霉β_木糖苷酶；或(iii)⑴和(ii)的组合；其中所述烟曲霉木聚糖酶或其同源物选自下组:(i)烟曲霉木聚糖酶，其包含或组成为SEQIDNO:10,SEQIDNO:12，或SEQIDNO:14的成熟多肽；(ii)木聚糖酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:10,SEQIDNO:12，或SEQIDNO:14的成熟多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，其包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:9,SEQIDΝΟ:11，或SEQIDNO:13的成熟多肽编码序列具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下与SEQIDNO:9,SEQIDΝΟ:11，或SEQIDNO:13的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；和其中所述烟曲霉木糖苷酶或同源物选自下组:(?)β-木糖苷酶，其包含或组成为SEQIDNO:16的成熟多肽；(ii)β-木糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDΝΟ:16的成熟多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDΝΟ:15的成熟多肽编码序列具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下与SEQIDNO:15的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。10.权利要求6-9任一项的重组丝状真菌宿主细胞，其为木霉属细胞。11.权利要求10的重组丝状真菌宿主细胞，其为里氏木霉。12.权利要求6-11任一项的重组丝状真菌宿主细胞，其中对于所述丝状真菌宿主为内源的一种或多种纤维素酶基因，一种或多种半纤维素酶基因，或其组合已失活。13.权利要求12的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述纤维素酶基因是已失活的纤维二糖水解酶I基因，其中所述纤维二糖水解酶I基因编码选自下组的纤维二糖水解酶1:(i)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为SEQIDNO:18的成熟多肽；(ii)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:18的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一I"生；(iii)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:17的成熟多肽编码序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下，与SEQIDNO:17的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。14.权利要求12或13的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述纤维素酶基因是已失活的纤维二糖水解酶II基因，其中所述纤维二糖水解酶II基因编码选自下组的纤维二糖水解酶II:(i)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为SEQIDNO:20的成熟多肽；(ii)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:20的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:19的成熟多肽编码序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下，与SEQIDNO:19的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。15.权利要求12-14任一项的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述纤维素酶基因是已失活的葡糖苷酶基因，其中所述葡糖苷酶基因编码选自下组的葡糖苷酶:(i)β-葡糖苷酶，其包含或组成为SEQIDNO:22的成熟多肽；(ii)β-葡糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:22的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。；(iii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDΝ0:21的成熟多肽编码序列具有至少70%，例如至少75%，至少.80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少.88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少.96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下，与SEQIDΝΟ:21的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。16.权利要求12-15任一项的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述半纤维素酶基因是已失活的木聚糖酶基因，其中所述木聚糖酶基因编码选自下组的木聚糖酶:(i)木聚糖酶，其包含或组成为SEQIDNO:24,SEQIDNO:26、和SEQIDNO:28的成熟多肽；(ii)木聚糖酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:24,SEQIDNO:26JPSEQIDNO:28的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少.98%，或至少99%序列同一性；(iii)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:23,SEQIDNO:25JPSEQIDNO:27的成熟多肽编码序列具有至少.70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少.94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下，与SEQIDNO:23,SEQIDNO:25JPSEQIDNO:27的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。17.权利要求12-16任一项的重组丝状真菌宿主细胞，其中所述半纤维素酶基因是已失活的木糖苷酶基因，其中所述木糖苷酶基因编码选自下组的木糖苷酶:(i)β-木糖苷酶，其包含或组成为SEQIDNO:30的成熟多肽；(ii)β-木糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:30的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少.84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少.92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性(iii)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDΝ0:29的成熟多肽编码序列具有至少70%，例如至少75%，至少.80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少.88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少.96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件、非常高严格条件下，与SEQIDNO:29的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。18.权利要求6-17任一项的重组丝状真菌宿主细胞，其进一步包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码一种或多种选自下组的酶:纤维素酶，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，半纤维素酶，酯酶，棒曲霉素，漆酶，木质素分解酶，果胶酶，过氧化物酶，蛋白酶，和膨胀素。19.一种产生酶组合物的方法，其包括:在有助于所述酶组合物产生的条件下培养权利要求7-18任一项的宿主细胞。20.权利要求19的方法，进一步包括回收所述酶组合物。21.一种降解纤维素材料的工艺，其包括用权利要求1-6任一项的酶组合物处理所述纤维素材料。22.—种用于产生发酵产物的工艺，其包括:(a)用权利要求1-6任一项的酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收发酵产物。23.一种发酵纤维素材料的方法，其包括:用一种或多种发酵微生物发酵所述纤维素材料，其中所述纤维素材料是用权利要求1-6任一项的酶组合物糖化的。【文档编号】C12N1/22GK103890165SQ201280052443【公开日】2014年6月25日申请日期:2012年8月23日优先权日:2011年8月24日【发明者】J.沙斯基,S.迈尤兰,A.菲舍申请人:诺维信股份有限公司