核酸扩增方法、核酸基板、核酸分析方法及核酸分析装置制造方法

核酸扩增方法、核酸基板、核酸分析方法及核酸分析装置制造方法
【专利摘要】本发明涉及一种核酸扩增方法，其通过以高簇密度制作成为利用测序仪进行序列解析的对象的扩增核酸片段束(簇)，且使簇内核酸片段数达到10,000分子以上，提高核酸序列解析的通量且提高读取精度；通过预先使引物DNA在基体上形成图案状，在其上固定由试样DNA合成得到的大体积模板DNA进行扩增反应，实现高簇密度和提高簇内扩增片段数。
【专利说明】核酸扩增方法、核酸基板、核酸分析方法及核酸分析装置
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种核酸的碱基序列解析中使用的核酸扩增方法、核酸基板及核酸分析装置。
【背景技术】
[0002]正在陆续开发确定DNA、RNA的碱基序列的新技术。以前，碱基序列的确定采用利用了电泳的方法，预先调制序列确定用DNA片段或根据RNA试样进行反转录反应合成的cDNA片段试样,采用周知的桑格法(Sanger method)实施双脱氧反应后,进行电泳,测定分子量迁移展开谱图(pattern)并进行解析。
[0003]对此，近年来开发出将大量作为试样的DNA片段固定在基板上，并行确定大量片段的序列信息的方法，使碱基解析速度得到了飞跃性提高。这些技术中，将扩增作为解析对象的核酸序列得到的束(簇)配置在平面上，使用二维图像传感器进行测定，从而平行解析多个样品。例如，非专利文献I中，通过使用固定在基板上的引物在基板上进行PCR反应，从而在基板上形成扩增基因片段的簇。此外，非专利文献2中，进行乳液PCR，在微粒表面对核酸序列进行扩增和固定，并将该微粒固定在基板上，使多个样品配置在平面上。
[0004]在这些超并联型测序仪中，簇的形成是重要步骤，以高密度形成簇增加可以通过图像传感器一次获取的序列信息，提高每簇的扩增基因片段数可以提高序列信息的信号强度，提高序列信息的可靠性，同时实现检测装置的简化。
[0005]现有技术文献
[0006]专利文献
[0007]专利文献1:日本特表2002-525125号公报
[0008]专利文献2:日本特表2011-520420号公报
[0009]非专利文献
[0010]非专利文献1:Nucleic Acids Research, 2000, vol.28, N0.20, e87.[0011]非专利文献2:Science2005, vol.309，pp.1728-1732.[0012]非专利文献3:Nano Letter2010, vol.10，pp.788-792.[0013]非专利文献4:P.N.A.S.2006，vol.103，pp.19635-19640.
【发明内容】

[0014]发明要解决的问题
[0015]超并联型测序仪中，通过二维图像传感器获取由配置在平面上的扩增基因簇产生的荧光或者发光反应，得到各基因片段的序列信息。因此，随着扩增基因簇的密度的提高，则从一张图像得到的序列信息量增加，有望实现高通量。
[0016]关于在基板上通过扩增反应制作多个簇的现有方法，例如专利文献I中公开的那样，将作为模板的试样DNA随机地散布在基板上，以预先固定在基板上的引物作为反应起点进行扩增反应。这种随机散布模板DNA的方法中，如果想提高簇密度，则供给至一定面积的区划内的模板DNA相对于分子数的频率分布为泊松分布，所以仅供给一分子模板DNA的区划的极限是最大约37%。因此，例如，以向基板上平均500nm见方的区划供给各一分子为目标，理想状态下应该能够获得400万个/mm2的簇密度，但即使对模板DNA浓度进行最适化，也仅能获得为其约1/3的130万个/mm2的簇密度这样的极限。也就是说，残留的问题是，如果将作为模板的试样DNA以高浓度固定，则模板DNA会紧挨着被固定在基板上，因此多种DNA会在同一区划内被扩增，无法进行正确的碱基序列解析；另一方面，如果将试样DNA以低浓度固定，则簇密度会下降，通量会下降。
[0017]专利文献2中还公开了一种方法，其在进行扩增反应后，将其扩增产物固定在预先形成于基板上的固定用垫上。但是，在该方法中，扩增反应为滚环扩增(rolling circleamplification, RCA)反应，难以实现超过10，000倍那样的高扩增倍率。为了以高通量进行解析，不得不高速检测荧光亮点，并优选每簇的DNA片段数也多，但从DNA合成反应速度方面考虑，仅凭实用的数小时的反应时间的RCA反应，难以实现超过10，000倍的高扩增倍率。
[0018]本发明提供一种扩增方法，其与根据泊松分布的比例而设定的簇密度相比，实现了更高的簇密度，同时将各簇内的DNA片段数扩增至可以容易检测的10，000分子以上。
[0019]用于解决问题的手段
[0020]本发明的发明人等进行深入研究的结果，开发出一种扩增方法，其兼顾了与根据泊松分布求得的簇密度相比更高的簇密度、以及使簇内的DNA片段数为10，000分子以上的
高扩增率。
[0021]特别是开发出了一种核酸扩增方法，当把500nm见方作为簇的一个区划时，其簇密度与根据泊松分布求得的簇密度130万个/mm2相比更高，且将簇内的DNA片段数扩增至10，000分子以上。
[0022]本方法中，将高密度固定引物的区域孤立且高密度地设在基体上，对该区域供给各一分子扩增对象模板DNA。作为供给各一分子的方法，通过供给模板DNA作为以物理尺寸计大于或等于固定区域的分子，能够向各固定区域供给各一分子模板DNA。更具体而言，例如通过RCA反应，合成各模板DNA的巨大分子，将它们供给到固定有引物DNA的各固定区域，从而实现一分子供给。一分子供给后，通过PCR反应等扩增反应，在引物固定区域内以引物为起点的扩增产物被固定在基体上。RCA反应产物为巨大分子，但是按碱基序列计，只含一种模板DNA，因此各个引物固定区域中只合成出一种扩增产物。从而能够制作出可以充分适用于后续测序反应的扩增产物基板。
[0023]发明的效果
[0024]本发明中，与根据泊松分布的比例而设定的簇密度相比，实现了更高的簇密度，这是现有的将试样DNA随机固定在基板上的方法所无法实现的；同时实现可以将各簇内的DNA片段数扩增至10，000分子以上，增加了每一视野中的序列解析DNA片段数，并缩短检测所需曝光时间，从而可以实现高通量的序列解析。
【专利附图】

【附图说明】
[0025]图1是用于说明本发明的基因扩增方式的构成的一例的图。
[0026]图2是本发明的基因扩增方式中使用的基板的制作方法的一例。[0027]图3是本发明的基因扩增方式中使用的大体积的模板DNA的制作方法的一例。
[0028]图4是使用本发明中制作的扩增基因片段簇进行测序反应时的装置构成的一例。
[0029]图5是表示本发明的核酸分析方法的一例的图。
【具体实施方式】
[0030]实施例中公开一种核酸扩增方法，其特征在于，包含如下工序:在基体的表面配置固定有第一核酸的区域和未固定前述第一核酸的区域的工序；将同一链上具有至少两个以上作为解析对象的碱基序列的第二核酸固定在固定有前述第一核酸的区域上的工序；以及供给第三核酸并以前述第一核酸及第三核酸为引物进行前述第二核酸的扩增反应的工序。
[0031]此外，实施例中公开一种核酸扩增方法，其特征在于，前述核酸扩增方法中，第二核酸的直径的平均值大于固定有第一核酸的区域的直径的平均值的1/2。
[0032]此外，实施例中公开一种核酸扩增方法，其特征在于，前述核酸扩增方法中，第二核酸为单链，且具有自退火结构。
[0033]此外，实施例中公开一种核酸扩增方法，其特征在于，前述核酸扩增方法中，包含在扩增反应后去除第一核酸的延伸反应产物的互补链的工序。
[0034]此外，实施例中公开一种核酸扩增方法，其特征在于，前述核酸扩增方法中，第二核酸是以具有解析对象碱基序列的环状核酸为模板，在具有链置换活性的聚合酶作用下获得的链置换延伸反应产物。
[0035]此外，实施例中公开一种核酸扩增方法，其特征在于，前述核酸扩增方法中，扩增反应为恒温反应。
[0036]此外，实施例中公开一种`核酸基板，其特征在于，在基体上固定有包含作为解析对象的碱基序列的核酸的核酸基板上，固定有前述核酸的区域的直径的平均值为500nm以下，且前述核酸的固定区域中核酸的分子数的平均值为10，000分子以上。
[0037]此外，实施例中公开一种核酸基板，其具有至少一个以上的流路，用于进行前述核酸扩增方法。
[0038]此外，实施例中公开一种核酸分析装置，其具有至少一个温度调节装置和送液机构，用于进行前述核酸扩增方法。
[0039]以下参照附图对本发明的上述以及其它新颖特征和效果进行说明。这里，为了完全理解本发明而对特定的实施方式进行了详细说明，但本发明不限定于这里所记载的内容。
[0040]实施例1
[0041]本实施例中，使用图1对本发明的核酸扩增方法进行说明。以试样DNAlOl为基础合成大体积DNA分子102(1)。需要在每个大体积DNA分子102中不混淆那些作为基础的试样DNAlOl的碱基序列信息地被保持。为此，作为合成方法可以采用滚环扩增(RCA)反应。其详细内容在实施例3中公开。另一方面，预先将作为引物的DNA104呈图案状固定在基体103的表面上。关于将引物DNA104呈图案状固定的方法，其例子在实施例2中公开。通过杂交将大体积DNA分子102固定在固定有引物DNA104的区域(2)。为此，预先使引物DNA104中具有大体积DNA分子102的部分碱基序列的互补序列。引物DNA104可以在各固定区域中具有相同的碱基序列，也可以使大体积DNA分子102具有共通的碱基序列以使其具有与之互补的序列。
[0042]呈图案状固定的引物DNA104的各固定区域中需要供给各一种试样DNA101。当假设固定区域的直径为D，大体积DNA102的直径为d时，发现如果满足d > D/2，则各固定区域中不会固定2个以上的大体积DNA，即可以对各固定区域只供给一种试样DNA101，从而完成了本发明。如果满足d > D/2，固定有大体积DNA102的区域不会物理性地固定另一个大体积DNA，因此不满足独立事件的重复所产生的泊松分布条件，从而可以达到大于或等于根据泊松分布所设定的一分子固定比率约37%的较高的一分子固定比率。即使将大体积DNA102的浓度提高，使其与基体103进行反应，固定区域I处也不能固定2个以上的大体积DNA102，因此可以达到例如泊松分布极限值的2倍左右的、约70%以上的较高一分子固定比率。
[0043]然后，将基体浸入含有DNA合成酶、4种碱基底物的水溶液中，进行以大体积DNA分子102为模板的引物DNA104的延伸反应，进行双链合成(3)。以该大体积DNA分子102为模板的互补链合成反应(3)根据所用聚合酶的种类会有所差别，但可以通过在37°C左右的恒定温度下反应10分钟左右完成。然后，给予与引物DNA104方向相反的引物DNA105，进行PCR反应(4)。这里，PCR反应时，如果在通常的整个温度周期范围内，于通常的95°C左右条件下进行变性，则模板的大体积DNA分子102将从基板上剥离，因此无法获得所期望的扩增。因此，优选在恒定温度下进行PCR反应，当双链部分解离时引物DNA104退火，发生互补链合成反应。对反应条件进行积极研究的结果，判断反应温度和引物浓度是影响扩增效率的决定因素。当反应温度达到70°C以上时，大体积DNA分子102会发生剥离，扩增率下降。另一方面，当反应温度达到50°C以下时，扩增率降低，即使反应约3个小时，则扩增率也达不到10，000倍。从而得知，反应温度优选为50°C到70°C之间，更优选为60°C左右。然后，对引物DNA104的密度与扩增率的关系进行了积极研究。其结果是，得知如果固定密度达不到50，000分子/ μ m2 (~I分子/4.5nm见方)左右，则即使反应约3个小时，扩增率也达不到10，000倍。从而明确，引物DNA104的固定密度优选为10，000分子/μ m2以上，更优选为100，000分子/μ m2以上。关于引物DNA105的浓度，在与通常溶液中的PCR反应相同水平即0.1~0.5 μ M左右的条件下能够得到充分的扩增。聚合酶优选为具有链置换活性的酶，可以使用Phi29、Bst聚合酶、C`sa聚合酶、96-7聚合酶等。PCR反应后，基体103上会制作出预先固定在基体103上的引物DNA104的延伸反应产物与引物DNA105的延伸反应产物的双链。对于这些延伸反应产物，虽然会进行为了碱基序列解析的测序反应，但为了使该测序反应高效地进行，优选将引物DNA105的延伸反应产物去除，以单链形式留存。去除方法选用最简便的利用高温处理的变性，优选于70°C以上，更优选90°C以上处理2分钟左右，从而可以在测序反应中实施充分的单链化。
[0044]如本实施例所示，根据本发明，簇密度即固定区域密度取决于引物DNA104的固定区域密度，不受泊松分布限制，能够以较高的固定密度向各固定区域供给各一种试样DNAlOl0例如，如果在直径500nm范围制作固定区域，则可以达到200万个/mm2以上的高簇密度。另一方面，簇内的DNA密度取决于扩增率和每簇的面积来确定。例如，如果直径500nm的固定区域(簇形成区域)内，引物DNA密度为50，000分子/ μ m2以上，则在约3个小时的反应时间内扩增率将达到约10，000倍，因此可以达到10，000分子/簇。
[0045]实施例2[0046]本实施例中，参考图2对将引物DNA呈图案状固定在基体上的方法的一个优选例子进行说明，该方法用于本发明的核酸扩增方法中。
[0047]在平滑的支撑基体201上利用旋转涂布法涂布电子束用正型抗蚀剂202。作为平滑的支撑基体，可以使用玻璃基板、蓝宝石基板、硅片等。在作为核酸基板时，需要从与固定核酸的面相反侧的背面照射激发光时，使用光透过性优异的石英基板、蓝宝石基板即可。作为电子束用正型抗蚀剂，可以列举例如聚甲基丙烯酸甲酯、ZEP-520A(日本瑞翁公司制)。利用基板上的标记的位置进行位置对齐后进行电子束直写曝光，在抗蚀剂中形成通孔。例如，形成直径200nm的通孔。通孔虽然取决于平行处理所能够解析的核酸的分子数，但考虑到制造上的简便性、成品率的高低以及平行处理所能够解析的核酸的分子数，通孔以0.5μπι左右的间距形成是适宜的。通孔形成区域也取决于平行处理所能够解析的核酸的分子数，但也大幅依赖于检测装置侧的位置精度、位置分辨率。通孔形成区域也取决于平行处理所能够解析的核酸的分子数，但也大幅依赖于检测装置侧的位置精度、位置分辨率。例如，以0.5 μ m间距构成引物DNA固定区域时,每Imm见方可以形成400万簇。形成通孔后，通过溅射使构成粘接用垫203的材料例如金制膜。在使用玻璃基板、蓝宝石基板作为平滑的支撑基体、使用金作为粘接用垫材料时，就强化前述基板材料和前述粘接用垫材料间的粘接而言，优选引入钛、铬的薄膜。将抗蚀剂剥离后，对于形成了粘接用垫203以外的平滑基板表面实施防止非特异吸附的处理。为了实现防止对带荧光色素的核苷酸的吸附，用具有带负电荷官能团的分子进行涂布。例如，通过旋转涂布在表面涂布环氧硅烷并加热处理后，用弱酸性溶液(PH5~pH6左右)进行处理，从而使环氧基开环，在表面导入OH基，从而可以带来防止非特异吸附的效果。
[0048]优选预先用官能团204修饰引物DNA205。使用金作为粘接用垫材料时，可以使用巯基作为官能团204。将设有粘接用垫203的基体在具有官能团204的引物DNA205的水溶液中进行浸溃处理，经规定反应时间后取出，将多余的水溶液洗涤后，干燥，从而可以制作呈图案状地固定有引物DNA的核酸基板。本实施例中已示出使用电子束曝光装置的例子，可以采用完全相同的步骤使用光线曝光装置同样地制作核酸基板。
[0049]此外，除如上所述的光刻技术之外，也可以采用纳米压印、接触印刷(contactprint)等技术将粘接垫呈图案状设置。而且，还可以利用相容性不同的高分子彼此连接而成的嵌段共聚物形成微相分离结构，通过溶解一方的高分子相，制作凹型图案，并将其作为模板制作金属垫图案。
[0050]实施例3
[0051]本实施例中，参考图3对由试样DNA制作大体积DNA分子的方法的一个优选例子进行说明，该方法用于本发明的核酸扩增方法中。
[0052]采用酶解、剪切、或者超声处理等常规方法将试样DNA301进行片段化(I)。片段302的碱基长度优选为50个碱基到2000个碱基之间，更优选为100个碱基到500个碱基之间。因为后续工序中将与接头(Iinker)DNA接合形成环状DNA后，进行DNA的合成反应，所以片段如果过长，则有可能导致大体积DNA的结构与所期望的形状有所偏离。另一方面，如果过短，则会产生在基体上进行扩增反应时扩增率无法达到期望值的危险性。优选考虑上述情况来决定片段长度，并优选选择进行片段化(I)的方法，以获得该长度的片段。
[0053]优选将片段302的两个末端平滑化处理后，在两个末端连接(ligation)接头303(2)。平滑化处理可以采用以聚合酶和dNTP类将突出部分(overhang)的5’单链全部补齐的方法、使用具有3’外切酶活性的聚合酶将3’突出部分去除的方法。以防止片段彼此连接，进行平滑化处理时，优选预先利用例如T4激酶的3’磷酸酶活性将3’磷酸基转化为羟基。可以通过连接预先将接头303添加到所有的片段302上，使其与用于成环状的接头304接合，从而可以容易地合成环状DNA305(3)。用于成环状的接头304可以使用质粒DNA。例如，使用适当的限制酶将质粒DNA的多克隆位点切断，引入带有接头303的片段302。还可以通过大肠杆菌的转化对引入的质粒进行扩增。然后，将引物DNA306杂交于环状DNA305上(4)，利用具有链置换活性的聚合酶进行RCA反应(5)。作为可用于RCA反应的聚合酶，可以举出phi29聚合酶、Bst聚合酶、Csa聚合酶、96_7聚合酶。这些聚合酶的最适反应温度、条件各有不同，可以根据被杂交的引物序列的Tm值适当选择。为了控制RCA产物307的大小，需要控制反应时间及反应温度，选择聚合酶。而且，例如非专利文献3所公开那样，通过预先将形成自环结构的碱基序列导入用于成环状的接头304中，则可以控制RCA产物307使其形成球形形状。而且，作为形成自环结构的碱基序列，采用被称为回文结构的回文状碱基序列也是有效的。此外，还可以使用被称为适体(aptamer)的自环结构。如果将如上所述基于自杂交形成高级结构的碱基序列导入接头304，则长单链的RCA产物307将通过形成周期性缩短的结构而形成球形结构。与RCA产物的形状成为不定形的情况相比，通过使其形状呈球形，则容易根据固定区域的面积控制作为模板的DNA(RCA产物)的大小。非专利文献3中公开了直径为50~150nm的球形DNA的合成。
[0054]发明人等通过将10个到20个碱基长度的适体结构导入到500个碱基长度的质粒DNA中，并使用Csa聚合酶使其反应3个小时，得到了直径为100~200nm的RCA产物。采用实施例2中所述 电子束光刻技术法，将经巯基末端修饰的寡DNA作为引物固定在形成于石英基板上的直径为lOOnm、垫间间距为0.5 μ m的金垫基板上。将前述金垫基板放入含有规定量前述RCA产物、Csa聚合酶、反向引物、dNTP类的反应液中，首先于37 °C孵化10分钟，进行以引物为起点的互补链合成后，将温度上升到60°C进行3个小时扩增反应。通过洗涤去除未反应物后，将具有所合成DNA的互补链序列并以Cy3标记末端的荧光探针DNA杂交，通过荧光显微镜观察后，确认金垫上已合成有扩增产物。确认到扩增产物的金垫比率为约70%。从而确认，能够实现大约2.8百万簇/mm2的簇密度。此外，根据实施例4中所述，所含荧光分子数与已知荧光珠的荧光强度比较来判断，每垫的DNA分子数为每垫(每簇)至少合成约10，000分子的DNA。从而确认，能够达到约10，000DNA分子/簇的DNA片段密度。
[0055]由上述实施例表明，通过RCA反应等合成大体积DNA作为模板DNA，并将大体积模板DNA固定在将引物固定于孤立区域的基体上进行扩增，能够实现较高的簇密度和较高的每簇DNA片段密度。
[0056]实施例4
[0057]本实施例中，参考图4对使用了本发明的核酸基板的核酸分析装置的优选构成的一个例子进行说明。
[0058]本实施例的核酸分析装置具备:向表面形成有多个孤立的核酸固定用微小区域的核酸基板供给大体积模板DNA的水溶液、洗涤液、核酸合成酶溶液、带荧光标记的底物(dNTP)溶液的单元；用于控制大体积模板DNA的扩增反应的温度调节单元；对核酸基板照射光的单元；对带荧光标记的底物的荧光进行测定的发光检测单元。更具体而言，将核酸基板401置于温度调节板403上，在其上贴合设有流路404的流路形成部件402，从而形成反应室。流路形成部件402可以使用例如PDMS(Polydimethylsiloxane,聚二甲基硅氧烷)。注入口 714连接送液单元405,送液单元405中保管着反应和洗漆所需的全部药液。
[0059]大体积模板DNA的水溶液、核酸合成用底物(dNTP)溶液、反向引物溶液、核酸合成酶溶液依次从送液单元405经由注入口 714、流路404被供给至固定有引物的核酸基板401。将温度调节板403的温度升至37°C后，在规定的时间内保持温度恒定，进行以固定在基体上的引物为起点的互补链合成，保持时间优选为3分钟到10分钟左右。然后，将温度调节板403的温度升至60°C后，进行DNA的扩增反应。反应时间优选为2~7小时左右。DNA的扩增反应后，从送液单元405经由注入口 714、流路404供给洗涤液，所述洗涤液用于洗涤并除去未反应物、以引物为起点的延伸反应产物的互补链。
[0060]然后，进行测序反应，反复进行一碱基延伸反应和荧光检测。作为测序反应，采取例如逐次反应方式时，作为带荧光色素的核苷酸，可以使用非专利文献4中公开的、在核糖的3’ OH位置上导入3’ -O-烯丙基作为保护基，并在嘧啶的5位位置或嘌呤的7位位置上介由烯丙基与荧光色素相结合的核苷酸。烯丙基通过光照射(例如波长355nm)或者与钯接触来切断，因此能够同时实现色素的淬灭与延伸反应的控制。
[0061]荧光测定如下实施。从激发多种荧光体的必要性和经济性角度出发，优选使用氙灯作为光源407。通过准直透镜408调整至平行光线后，通过滤光器713滤除激发中不需要且对荧光色素有损伤的那样的近紫外光，通过分色镜409引导至物镜406，照射在核酸基板401上。标记在各碱基上的荧光色素分子发出的荧光与激发光沿着同轴光路逆向前进，通过物镜406聚光后通过分色镜409，通过成像透镜711在二维CXD相机712的感光面上成像。激发光的散射光通过滤光器710而被滤除。为了识别4种碱基，需要识别并观测4种荧光色素的荧光，但作为其方法之一，可以通过将分色镜409设为具有适于各荧光色素的波长特性的4种镜子，使它们保持在旋转式镜架上，以适合的角度进行旋转，从而切换测定波长(荧光色素)。
[0062]如上所述，通过由 送液单元、温度调节板、激发光源和荧光检测单元组成核酸分析装置，可以自动进行从试样DNA在基体上的扩增反应到测序反应、测定，可以实现对现有技术的通量(through-put)的大幅改善。
[0063]关于本发明检测装置的性能所要求的每簇DNA分子数，采用所含荧光分子数已知的突光珠(Invitrogen公司制fIuospheres珠、直径200nm、含1.1X IO5突光分子)，求算了信号噪声比达10以上的条件下检测所需要的荧光分子数。其结果表明，需要IXlO4分子以上。从而可知，为了在信号噪声比达10以上的条件下检测测序反应，需要每簇至少存在10，000分子，换算为扩增倍率，优选10，000倍以上的扩增率。
[0064]如实施例1中所述，采用本发明的扩增法能够使每簇DNA片段数达到10，000分子，从而确认在信号噪声比达10以上的条件下能够检测出测序反应。
[0065]实施例5
[0066]本实施例中，参考图5对使用了本发明的核酸扩增方法的核酸分析方法的一个例子进行说明。特别是公开了正确求算特定位点具有变异的异常序列片段与不具有变异的正常序列片段的丰度的方法。本发明的核酸扩增方法中，可以在基板上的不同位置各固定一分子已片段化的试样DNA并进 行扩增，因此能够容易地检测到其中包含的特定位点的突变，解析其丰度。
[0067]采用实施例1所记载的方法，在平滑基板501上形成解析对象核酸试样的片段束(簇)502。然后，向核酸试样片段束502供给具有截止到欲检测变异位置的相邻位置的碱基序列的引物503进行杂交。引物503末端修饰有荧光色素505。然后，供给具有各碱基所固有的荧光色素的双脱氧核苷酸溶液后，添加DNA合成酶进行延伸反应。图5中，正常序列导入双脱氧鸟嘌呤(ddG)停止延伸反应，变异序列导入双脱氧腺嘌呤(ddA)停止延伸反应。例如，双脱氧鸟嘌呤上标记有Cy3，双脱氧腺嘌呤上标记有Cy5。然后，使用普通的荧光显微镜向平滑基板501照射激发光，观察荧光。可以根据荧光色素505的有无来判断是否为含有变异解析对象碱基序列的片段。求出为荧光色素505的发光亮点且发出Cy3荧光的亮点数和为荧光色素505的发光亮点且发出Cy5荧光的亮点数，计算其比值，从而可以正确求算出试样DNA中所含的正常序列与异常序列的比率。
[0068]附图标记说明
[0069]101、301 试样 DNA
[0070]102大体积DNA分子
[0071]103 基体
[0072]104,205 引物 DNA
[0073]105反向引物DNA
[0074]106延伸反应产物
[0075]201支撑基体
`[0076]202电子束用正型抗蚀剂
[0077]203粘接用垫
[0078]204官能团
[0079]206防止非特异吸附膜
[0080]302 片段
[0081]303 接头
[0082]304用于成环状的接头
[0083]305 环状 DNA
[0084]306 引物 DNA
[0085]307 RCA 产物
[0086]401核酸基板
[0087]402流路形成部件
[0088]403温度调节板
[0089]404 流路
[0090]405送液单元
[0091]406 物镜
[0092]407 光源
[0093]408准直透镜
[0094]409分色镜
[0095]410、413 滤光器[0096]411成像透镜[0097]412 二维 CCD 相机
【权利要求】
1.一种核酸扩增方法,其特征在于，包含如下工序:在基体的表面配置固定有第一核酸的区域和未固定所述第一核酸的区域的工序；将同一链上具有至少两个以上作为解析对象的碱基序列的第二核酸固定在固定有所述第一核酸的区域上的工序；以及进行所述第二核酸的扩增反应的工序。
2.—种核酸扩增方法,其特征在于,包含如下工序:在基体的表面配置固定有第一核酸的区域和未固定所述第一核酸的区域的工序；将同一链上具有至少两个以上作为解析对象的碱基序列的第二核酸固定在固定有所述第一核酸的区域上的工序；以及供给第三核酸并以所述第一核酸及第三核酸为引物进行所述第二核酸的扩增反应的工序。
3.根据权利要求1所述的核酸扩增方法，其特征在于，第二核酸的直径的平均值大于固定有第一核酸的区域的直径的平均值的1/2。
4.根据权利要求1所述的核酸扩增方法，其特征在于，第二核酸为单链，且具有自退火结构。
5.根据权利要求1所述的核酸扩增方法，其特征在于，包含在扩增反应后去除第一核酸的延伸反应产物的互补链的工序。
6.根据权利要求1所述的核酸扩增方法，其特征在于，第二核酸是以具有解析对象碱基序列的环状核酸为模板，在具有链置换活性的聚合酶作用下获得的链置换延伸反应产物。
7.根据权利要求1所述的核酸扩增方法，其特征在于，所述扩增反应为恒温反应。
8.根据权利要求1所述的核酸扩增方法，其特征在于，固定有所述第一核酸的区域的直径的平均值为500nm以下，且各固定区域中所述第一核酸的分子数的平均值为10，000分子以上。
9.根据权利要求1所述的核酸扩增方法，其特征在于，固定有所述第一核酸的各个区域中，所述第一核酸的固定密度为10，000分子/μπι2以上。
10.根据权利要求9所述的核酸扩增方法，其特征在于，所述固定密度为100，000分子/μ m2以上。
11.根据权利要求1所述的核酸扩增方法，其特征在于，所述扩增反应的反应温度为50°C~70°C之间的温度。
12.根据权利要求1所述的核酸扩增方法，其特征在于，所述第二核酸是采用滚环扩增(RCA)反应合成的大体积核酸。
13.—种核酸分析方法,其特征在于,具有在进行权利要求1~12中任一项所述的核酸扩增方法之后，进行导入带荧光标记碱基的延伸反应的单元和对所述荧光标记进行荧光检测的单元。
14.一种核酸基板，在基体上固定有包含作为解析对象的碱基序列的核酸，其特征在于，固定有所述核酸的区域的直径的平均值为500nm以下，且所述核酸的固定区域中的核酸的分子数的平均值为10，000分子以上。
15.一种核酸基板，其具有至少一个以上的流路，用于进行权利要求1所述的核酸扩增方法。
16.一种核酸分析装置，其具有至少一个温度调节装置和送液机构，用于进行权利要求1所述的核酸扩增方法。
【文档编号】C12N15/09GK103890161SQ201280052238
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年10月19日 优先权日:2011年10月31日
【发明者】斋藤俊郎, 杉村祯昭 申请人:株式会社日立高新技术