热稳定性得到改善的d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体和使用其的d-阿洛酮糖的连续制备方法
【专利摘要】本发明涉及通过取代特定序列号的氨基酸改善热稳定性的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体。此外，本发明涉及包括D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体基因的重组载体，和使用所述重组载体转化的重组菌株。另外，本发明涉及使用酶突变体或重组载体制备的固定化反应器，以及使用所述固定化反应器制备D-阿洛酮糖的方法。
【专利说明】热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体和 使用其的D-阿洛酮糖的连续制备
【技术领域】
[0001] 本发明涉及来源于根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens)的热稳定性得到 改善的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体和使用其制备D-阿洛酮糖的方法。
【背景技术】
[0002] D-阿洛酮糖是一种被认为是稀有糖的单糖，因为它很少在天然材料中被发现或以 少量存在。D-阿洛酮糖具有超低能量密度和与糖类似的甜味，并且因此被广泛用作功能性 甜味剂。
[0003] D-阿洛酮糖是果糖的差向异构体并且具有非常类似于果糖的甜度和味道。然 而，与果糖不同，D-阿洛酮糖几乎不在体内代谢并且因此具有几乎零卡路里。D-阿洛酮 糖可用作减肥食品的有效成分，这是因为D-阿洛酮糖具有抑制脂质合成所涉及的酶的活 性和减少腹部肥胖的能力。另外，被广泛用作糖替代物的糖醇（如木糖醇等）可能具有副 作用，如在过度消耗的情况下导致腹泻。相反地，已知D-阿洛酮糖实质上不具有副作用 (松江（Matsue)，Τ·，Y.马场（Baba)，M.桥口（Hashiguchi)，K.竹下（Takeshita)，K.何 森（1仙111 〇1^)，以及!1.铃木（51^111^).2001.食用0-阿洛酮糖，0-果糖的(：-3差向异构 体，抑制大鼠肝脏脂肪生成酶的活性（Dietary D-psicose，a C_3epimer of D-fructose， suppresses the activity of hepatic lipogenic enzymes in rats.)亚太临床营养杂志 (Asia Pac. J. Clin. Nutr.) 10 :233-237.;松尾（Matsuo)，Τ·，和 K.何森 2004. D-阿洛酮糖， 不提供能量并且提供额外有利的临床营养作用的稀有糖（D-psicose，a rare sugar that provides no energy and additionally beneficial effects for clinical nutrition.) 亚太临床营养杂志13 :S127)。
[0004] 由于所述原因，D-阿洛酮糖作为食用甜味剂引起强烈的注意，并且对开发食品工 业中用于有效制备D-阿洛酮糖的方法存在不断增长的需求。随着开发D-阿洛酮糖的必要 性的提高，已进行许多使用常规生物学方法由果糖制备D-阿洛酮糖的研究。作为能够将果 糖转化成D-阿洛酮糖的酶，已知来源于根癌土壤杆菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶和来源 于菊苣假单胞菌（Pseudomonas cichorii)或类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides)的 D_塔格糖3-差向异构酶。已知D-阿洛酮糖3-差向异构酶具有比D-塔格糖3-差向异构 酶更高的活性。
[0005] 属于棒状杆菌属（genus Corynebacterium)的菌株是制备包含L-赖氨酸、L-苏 氨酸和在饲料、药品、食品等中具有不同用途的多种核酸的化学物质的工业微生物。所述棒 状杆菌属的菌株是公认为安全的（Generally Recognized As Safe ;GRAS)菌株，并且具有 易于被基因工程改造和大量培养的特性。此外，棒状杆菌属菌株具有在多种加工条件下的 高稳定性和与其他细菌相比相对强大的细胞膜结构。出于这些原因，菌株具有以下生物学 特性：细菌细胞由于高糖浓度等而在高渗透压下以稳定状态存在。
[0006] [现有技术文献]
[0007] 1)韩国专利第10-0744479B1号（在2007年8月1日公开）
[0008] 2)韩国专利公开第10-2011-0035805A号（在2011年4月6日公开）
【发明内容】
[0009] 技术问题
[0010] 本发明的发明人发觉来源于根癌土壤杆菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶尽管活 性高，但因低热稳定性而具有不良效用的问题，并且开发出热稳定性得到改善的D-阿洛酮 糖3-差向异构酶变异体，使得目前作为重要的食品材料引起高度注意的D-阿洛酮糖可被 大规模工业制备，从而提供一种使用所述变异体连续制备D-阿洛酮糖的方法。基于所述研 究，本发明的发明人已得出本发明。
[0011] 确切地说，本发明旨在提供通过取代在野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶氨基酸 序列的特定位置的氨基酸而使热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体。
[0012] 本发明的一个实施例还旨在提供一种包含D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体基因 的重组表达载体和一种用所述重组表达载体转化的重组菌株。
[0013] 另外，本发明旨在提供一种使用固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体或重组 菌株制备的填充床反应器和一种使用所述固定化反应器连续制备D-阿洛酮糖的方法。
[0014] 技术解决方案
[0015] 本发明提供一种通过取代在野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶氨基酸序列的特定 位置的氨基酸而使热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体。另外，本发明提 供一种包含D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体基因的重组表达载体和一种用所述重组表达 载体转化的重组菌株。此外，本发明提供一种使用D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体或重 组菌株制备的固定化反应器和一种使用所述固定化反应器连续制备D-阿洛酮糖的方法。
[0016] 更确切地说，本发明的一个实施例提供一种热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖 3_差向异构酶变异体，其中所述变异体为来源于根癌土壤杆菌的野生型D-阿洛酮糖3-差 向异构酶的变异体，并且具有在氨基酸序列位置33的异亮氨酸（lie)被由亮氨酸（Leu)、半 胱氨酸（Cys)以及缬氨酸（Val)所构成的族群中选出的氨基酸取代的氨基酸序列，或在氨 基酸序列位置213的丝氨酸（Ser)被半胱氨酸取代的氨基酸序列。
[0017] 本发明的另一个实施例提供一种热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖3-差向异构酶 变异体，其中所述变异体为来源于根癌土壤杆菌的野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶的变 异体，并且具有在氨基酸序列位置33的异亮氨酸（lie)被由亮氨酸（Leu)、半胱氨酸（Cys) 以及缬氨酸（Val)所构成的族群中选出的氨基酸取代且在氨基酸序列位置213的丝氨酸 (Ser)被半胱氨酸取代的氨基酸序列。
[0018] 本发明的又一个实施例提供一种包含编码D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体的基 因的重组表达载体。
[0019] 本发明的又一个实施例提供用重组表达载体转化的谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacterium glutamicum)pFIS-l_ATPE-2〇
[0020] 本发明的又一个实施例提供一种使用D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体由果糖制 备D-阿洛酮糖的方法。
[0021] 本发明的又一个实施例提供一种使用重组谷氨酸棒状杆菌pFIS-l-ATPE-2由果 糖制备D-阿洛酮糖的方法。
[0022] 本发明的又一个实施例提供一种用于制备D-阿洛酮糖的固定化反应器，包括用 珠粒填充的管柱，其中D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体被固定到所述珠粒。
[0023] 本发明的又一个实施例提供一种通过将果糖溶液引入固定化反应器中制备D-阿 洛酮糖的方法。
[0024] 有益效果
[0025] 本发明提供一种野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶氨基酸序列的特定位置的氨基 酸被取代的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体。D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体具有以 下优势：所述变异体在保持酶促活性的同时具有显著改善的热稳定性，从而使得目前作为 重要的食品材料引起高度注意的D-阿洛酮糖可被更有效地大规模工业制备。
[0026] 确切地说，与野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶相比，根据本发明的D-阿洛酮 糖3-差向异构酶变异体在一般酶反应温度下具有明显延长的半衰期，从而使得所制备的 D-阿洛酮糖3-差向异构酶可被用于长时间制备D-阿洛酮糖。因此，根据本发明的D-阿洛 酮糖3-差向异构酶变异体可减少制备时间和成本，从而改善制备效率。
[0027] 另外，本发明提供一种用于表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体的重组载体，和 一种重组菌株，即用所述重组表达载体转化的谷氨酸棒状杆菌PFIS-1-ATPE-2。因此，本发 明具有以下优势：提供一种用于通过使用D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体或重组菌株形 成固定化反应器来大规模连续制备D-阿洛酮糖的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0028] 图1描绘了包含来源于根癌土壤杆菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体基因的 重组表达载体。
[0029] 图2是使用差示扫描量热计（DSC)描绘来源于根癌土壤杆菌的D-阿洛酮糖3-差 向异构酶的野生型和变异体（S213C、I33L以及I33L-S213C)的表观解链温度分布的图形。 图形的峰值部分表示酶的表观解链温度。
[0030] 图3描绘来源于根癌土壤杆菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的野生型和变异体 (S213C、I33L以及I33L-S213C)的分子建模结果的图像。（a)和（b)分别表示野生型和 I33L-S213C变异体的二级结构。（c)和（d)分别表示野生型和S213C变异体的氨基酸序列 位置213的氨基酸（在野生型情况下的丝氨酸（Ser)，和在S213C变异体情况下的半胱氨酸 (Cys))周围的估计氢键。（e)和（f)分别表示野生型和I33L变异体的芳基之间的相互作 用。
[0031] 图4是描绘在根据本发明的一个实施例的方法中使用变异体的固定化反应器在 50°C反应温度下的操作稳定性的图形。
【具体实施方式】
[0032] 本发明提供一种通过取代在野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶氨基酸序列的特定 位置的氨基酸而使热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体。另外，本发明提 供一种包含D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体基因的重组表达载体和一种用所述重组表达 载体转化的重组菌株。此外，本发明提供一种使用D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体或重 组菌株制备的固定化反应器和一种使用所述固定化反应器连续制备D-阿洛酮糖的方法。
[0033] 在下文中将更详细地描述本发明的实施例。在此省略对此项技术或相关领域中具 有一般知识的人员显而易见的详情的描述。
[0034] 本发明的一个实施例提供一种热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变 异体，其中所述变异体为来源于根癌土壤杆菌的野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶的变异 体，并且具有在氨基酸序列位置33的异亮氨酸（lie)被由亮氨酸（Leu)、半胱氨酸（Cys) 以及缬氨酸（Val)所构成的族群中选出的氨基酸取代的氨基酸序列，或在氨基酸序列位置 213的丝氨酸（Ser)被半胱氨酸取代的氨基酸序列。
[0035] 根癌土壤杆菌是一种众所周知的菌株，并且根癌土壤杆菌ATCC33970可被用作实 例。
[0036] 来源于根癌土壤杆菌的野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶具有韩国专利公开案第 10-2011-0035805A号中SEQ ID N0:1的氨基酸序列或其功能片段。如在此所用，术语"功 能片段（functional fragment)"可指代在SEQ ID N0 :1的氨基酸序列中包含因部分氨基 酸的取代、插入或缺失造成的突变并且具有将果糖转化成D-阿洛酮糖的活性的片段。
[0037] D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体是指具有来源于根癌土壤杆菌的野生型D-阿洛 酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列特定位置的氨基被取代的氨基酸序列的酶。
[0038] 更优选地，D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体表示氨基酸序列位置33的异亮氨酸 被亮氨酸取代。
[0039] 本发明的另一个实施例提供一种热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖3-差向异构酶 变异体，其中所述变异体具有在氨基酸序列位置33的异亮氨酸（lie)被由亮氨酸（Leu)、 半胱氨酸（Cys)以及缬氨酸（Val)所构成的族群中选出的氨基酸取代且在氨基酸序列位置 213的丝氨酸（Ser)被半胱氨酸取代的氨基酸序列。
[0040] 更优选地，D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体表示氨基酸序列位置33的异亮氨酸 被亮氨酸取代，并且氨基酸序列位置213的丝氨酸被半胱氨酸取代。
[0041] 本发明的又一个实施例提供一种包含D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体基因的重 组表达载体（图1)。
[0042] 本发明的又一个实施例提供用重组表达载体转化的谷氨酸棒状杆菌 pFIS-l-ATPE-2。
[0043] 重组菌株谷氨酸棒状杆菌pFIS-l-ATPE-2根据布达佩斯条约（Budapest Treaty) 在2011年8月18日以保藏编号KCCM11204P被保藏在位于韩国首尔西大门区弘智1-洞 (Hongjel-dong，Seodaemun-ku，Seoul，Korea)的韩国微生物培养中心（Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)〇
[0044] 本发明的又一个实施例提供一种使用D_阿洛酮糖3-差向异构酶变异体或重组谷 氨酸棒状杆菌pFIS-l-ATPE-2由果糖制备D-阿洛酮糖的方法。
[0045] 本发明的又一个实施例提供一种用于制备D-阿洛酮糖的固定化反应器，包 括用珠粒填充的管柱，其中D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体或重组谷氨酸棒状杆菌 pFIS-l-ATPE-2被固定到所述珠粒。
[0046] 术语"固定化反应器（immobilized reactor) "是指通过囊封在海藻酸盐珠粒中的 菌株或经由用囊封在海藻酸盐珠粒中的菌株或酶填充的管柱进行制备D-阿洛酮糖的反应 的反应器。即，固定化意指提供生物活性的物质（在此情况下，D-阿洛酮糖3-差向异构酶 或包含其的菌株）被固定在载体上。
[0047] 作为固定酶变异体或重组菌株的载体，可使用（但不限于）相关技术中能够用于 固定酶或菌株的任何载体。优选地，可使用海藻酸钠。
[0048] 海藻酸钠是海藻细胞膜中大量存在的天然胶状多糖并且由β-D-甘露糖醛酸和 α-L-古罗糖醒酸（α-L-guluronic acid)组成。海藻酸钠按照含量随机形成β-1，4_键 结，并且可有利地用于菌株或酶的稳定固定。
[0049] 本发明的又一个实施例提供一种通过将果糖溶液引入固定化反应器中制备D-阿 洛酮糖的方法。
[0050] 如在此所用的术语"半衰期（half-life) "是指当酶或酶变异体的初始酶反应的 相对活性被假设为100时，酶或酶变异体的初始酶反应的相对活性被减小到50所耗费的时 段。
[0051] 如在此所用的术语"操作稳定性（operation stability) "是指反应器可在与初 始活性相比保持连续制备所需产物（在本发明中，D-阿洛酮糖）的合适生产率下操作的状 态。操作稳定性通常由操作时间（时间单位等）表示。
[0052] 在下文中，将参照以下实例和比较实例更详细地描述本发明。应了解，这些实例仅 被提供用于说明并且不以任何方式解释为限制本发明的范畴。
[0053] D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性的测量
[0054] 使用果糖作为底物测量D-阿洛酮糖3-差向异构酶的活性。将D-阿洛酮糖3-差 向异构酶或包括D-阿洛酮糖3-差向异构酶的样品添加到含有20mM底物的50mM哌嗪-N， Ν' -双（2-乙横酸）（piperazine-N，Ν' -bis(2_ethanesulfonic acid)，PIPES)缓冲溶 液pH8. 0中，接着在50°C下反应10分钟。向反应溶液中添加盐酸，使得最终浓度为200mM 来停止反应。使用配备有折射率（Refractive Index，RI)检测器的HPLC测量果糖和D-阿 洛酮糖的浓度。在样品被注射到设置为80°C的管柱（BP-100Ca 2+糖管柱）并且接着充当移 动相的蒸馏水以〇. 5毫升/分钟的速度流经的条件下进行HPLC分析。酶单位被定义为在 pH8. 0和50°C的条件下每分钟制备1微摩尔D-阿洛酮糖的量。
[0055] 实例 1
[0056] 通过随机诱变制备热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体
[0057] 使用来源于根癌土壤杆菌ATCC33970的D-阿洛酮糖3-差向异构酶（具有与韩国 专利公开案第10-2011-0035805A号中所披露的SEQ ID N0 :1 -致的氨基酸序列）作为模 板通过易错聚合酶链反应（易错PCR)构建D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体文库。
[0058] 确切地说，采用每1000个碱基对导致两个到三个突变的典型PCR诱变试剂盒。作 为引物，引入Ncol和PstI限制酶的限制酶识别位点序列的寡核苷酸被用于进行聚合酶链 反应，从而构建编码D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体的基因文库，所述变异体接着插入大 肠杆菌（E. coli)BL21 中。
[0059] 含有50微克/毫升氨苄西林（ampicillin)的LB培养基用于培养包含引入D-阿 洛酮糖3-差向异构酶变异体基因的质粒，接着在37°C下培养6小时的大肠杆菌BL21。从培 养液获取一部分，转移到包含50微克/毫升氨苄西林和0. ImM异丙基-β -D-1-硫代吡喃 半乳糖苷（Isopropyl-i3-D-l_thiogalactopyranoside，IPTG)的培养基，并且接着在 37°C 下培养6小时以便诱导酶表达。培养液在60°C下被热处理5分钟，接着添加果糖使得最终 浓度为15mM，并且随后在50°C下反应30分钟。接着，使用一般果糖分析试剂盒测量果糖的 残余量，通过使总共5000种变异体与野生型酶比较，选择活性比野生型酶高约1. 2倍的150 种变异体。
[0060] 以与上述相同的方式再次诱导所选择的150种变异体来表达酶。对所培养的细胞 进行超声波处理以破坏细胞。离心被破坏的细胞以便获得包括D-阿洛酮糖3-差向异构酶 的上清液。接着，使用上文提及的"测量D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性的方法"测量酶活 性。作为测量结果，再选择在55°C反应温度下展现高半衰期的23种变异体。
[0061] 23种再选择的变异体的基因从pTrc99A转移到pET_24a(+)，用于转化大肠杆菌 BL21。在37°C下，在含有50微克/毫升卡那霉素（kanamycin)的LB培养基中培养重组菌 株大肠杆菌BL21。当0D_达到0. 6时，添加 IPTG (异丙基-β -硫代吡喃半乳糖苷）使得 最终浓度为〇. ImM，接着在16°C下培养16小时。离心培养液以便收集细菌组分，接着将所 述细菌组分再悬浮于包含300mM KC1和10mM咪唑的50mM磷酸盐缓冲液中。对悬浮溶液进 行超声波处理以粉碎细胞。离心被破坏的细胞溶液以收集包含D-阿洛酮糖3-差向异构酶 的上清液，接着使用金属离子亲和色谱法纯化所述上清液。通过采用脱盐滤筒去除被纯化 的酶中的咪唑。
[0062] 在55°C下测量23种再选择的变异体的半衰期。选择展现最高半衰期的五种变异 体。5种所选变异体和野生型酶的相对活性和在55°C下的半衰期概述于表1中。
[0063] 表 1
[0064]
【权利要求】
1. 一种热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体，其中所述变异体为来 源于根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens)的野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶 的变异体，并且具有在氨基酸序列位置33的异亮氨酸（lie)被由亮氨酸（Leu)、半胱氨酸 (Cys)以及缬氨酸（Val)所构成的族群中选出的氨基酸取代的氨基酸序列，或在氨基酸序 列位置213的丝氨酸（Ser)被半胱氨酸取代的氨基酸序列。
2. -种热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体，其中所述变异体为来 源于根癌土壤杆菌的野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶的变异体，并且具有在氨基酸序列 位置33的异亮氨酸（lie)被由亮氨酸（Leu)、半胱氨酸（Cys)以及缬氨酸（Val)所构成的 族群中选出的氨基酸取代且在氨基酸序列位置213的丝氨酸（Ser)被半胱氨酸取代的氨基 酸序列。
3. -种重组表达载体，包括编码根据权利要求1或2所述的D-阿洛酮糖3-差向异构 酶变异体的基因。
4. 一种用根据权利要求3所述的重组表达载体转化的谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacterium glutamicum)pFIS-l_ATPE-2〇
5. -种使用根据权利要求1或2所述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体由果糖制备 D-阿洛酮糖的方法。
6. -种使用根据权利要求4所述的重组谷氨酸棒状杆菌pFIS-l-ATPE-2由果糖制备 D-阿洛酮糖的方法。
7. -种用于制备D-阿洛酮糖的固定化反应器，包括用载体填充的管柱，其中根据权利 要求1或2所述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体被固定到所述载体。
8. -种通过将果糖溶液引入根据权利要求7所述的固定化反应器中制备D-阿洛酮糖 的方法。
【文档编号】C12P19/02GK104160023SQ201280052112
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2012年8月21日 优先权日:2011年8月24日
【发明者】金良姬, 金镇夏, 李英美, 洪暎镐, 金敏会, 金成俌, 朴承源, 吴承贤, 吴德根, 崔珍根 申请人:Cj第一制糖株式会社