经修饰纤维黏连蛋白片段或变体及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明大体上系关于细胞生物学，且特定言之，细胞外基质蛋白（extracellular matrixprotein)与整合素（integrin)的功能及相互作用。更特定言之，本发明系关于 作为整合素（尤其整合素a5M及整合素avf33)的特定拮抗剂的人类纤维黏连蛋白 (fibronectin)片段及/或其变体。随本文所提交的序列txt文件以全文引用的方式并入 本文中。
【背景技术】
[0002] 整合素为介导细胞-基质及细胞-细胞相互作用的醣蛋白膜受体家族。整合素为 杂二聚体，由a及0次单元组成。迄今为止已描述至少24种不同整合素杂二聚体，包括 18种a次单元及8种0次单元。整合素藉助于与不同细胞外基质（ECM)蛋白的特定相互 作用来介导细胞的固着及迀移。另外，细胞存活、分裂及分化亦依赖于有效的细胞-ECM结 合（Morgan等人 2009,IUBMBLife, 61:731-38) 〇
[0003] 整合素a5M及av0 3聚集在培养细胞的黏附接触处。整合素-ECM复合物不 仅用以维持固着及迀移所需的细胞-细胞及细胞-基质的相互作用，细胞-ECM复合物之形 成亦藉由在细胞内部补充酶及接附蛋白形成动力学复合物来触发整合素介导的细胞内信 号传导。整合素的细胞内信号输出可影响基因表达、细胞存活、分化及增殖。整合素已牵涉 许多病理性状况（诸如血管生成及肿瘤发展）。
[0004] 已知若干整合素与纤维黏连蛋白藉助于纤维黏连蛋白中存在的 Arg-Gly-Asp(RGD)基元（motif)而相互作用。此等整合素包括5种av整合素 (avM、av|3 3、av|3 5、av|36 及av|3 8)及两种M整合素（a5M及a8M) (Smith, W.，2008,J.Allergy Clin. Immunol.121:S375-S379)。纤维黏连蛋白为高分子量 (约440kDa)的细胞外基质醣蛋白，其与整合素以及其他细胞外基质蛋白结合。纤维黏连蛋 白以在C末端由双硫键键联的两个单体的二聚体形式存在。各纤维黏连蛋白单体的分子量 为230-250kDa，含有三种类型的域：类型I、II及III。类型I及II域由链内双硫键稳定， 而类型III域不含有任何双硫键。缺乏双硫键可使得FN类型III域的结构具有柔性。
[0005] 各域含有多个经组织以沿纤维黏连蛋白单体的长度方向形成功能性及结合蛋白 质的区的模块。举例而言，需要类型I域中的模块以用于引发纤维黏连蛋白受质组装，而类 型I及类型III域两者中的模块对与其他纤维黏连蛋白分子结合而言为至关重要的。RGD 基元位于类型III域的模块l〇(FNIII10)中，且构成纤维黏连蛋白与整合素a5M及 a3的结合位点。类型III域模块9(FNIII9)中的序列，尤其PHSRN协同环，促使纤维黏 连蛋白与整合素a5M结合。纤维黏连蛋白的整合素a 3结合不需要模块9的协同效 应。
[0006] 因为整合素在调控多种细胞功能中的作用，所以已研宄使用整合素拮抗剂治 疗疾病的可行性。举例而言，实验使用整合素aIIbf3 3(活化血小板凝集的整合素） 的拮抗剂作为用于治疗血栓症相关的局部缺血性血管疾病的抗凝剂（Co11er等人， 2008，Blood，112:3011_25)。解整合素（disintegrin)(诸如蛇毒蛋白（Rhodostomin))为 在蛇毒液中天然发现的抑制整合素介导的血小板凝集及细胞黏附的较小蛋白质整合素拮 抗剂家族。然而，解整合素不具有特异性，且具有高度免疫原性。其与纤维黏连蛋白竞争结 合细胞表面上含有0 1及0 3的整合素，且无差别地抑制整合素a5M、av0 3及整合素 aIlb0 3的活性。因此，使用解整合素作为整合素a501及av03的拮抗齐IJ具有高出血 风险，归因于其allb0 3拮抗剂活性防止血小板凝集及血液凝固。
[0007] 类似地，假结核耶尔森氏菌（Yersiniapseudotuberculosis)蛋白侵袭素为结合 整合素的蛋白。细菌侵袭素蛋白藉由与整合素结合来促使细菌进入细胞。使用侵袭素作为 整合素拮抗剂有问题，因为细菌蛋白质可能具有高度免疫原性，且因为侵袭素蛋白的特异 性不确定。
[0008] 在高浓度下，FNIII9-10在一定程度上模拟全长纤维黏连蛋白分子的生物活性 (vanderWalle等人，2002,ProteinEngineering15:1021-24)。FNIII9-10 与其他ECM 蛋白竞争结合整合素。与解整合素相比，该等包含整合素的结合域的截短纤维黏连蛋白分 子或片段（例如FNIII10或FNIII9-10)对人类具有较少免疫原性，且具有更高特异性， 且因此不造成出血。然而，在使用截短纤维黏连蛋白作为整合素拮抗剂时存在困难。困难 之一为稳定性及溶解性。单独的人类FNIII9或FNIII9-10在结构上不稳定（参见van derWalle，文献同前）。此外，高浓度下的FNIII9-10为不溶的，此对其大规模制备及生 产呈现较大挑战。因此，需要经较好设计的具有低免疫原性、高特异性且稳定性及溶解性增 强的整合素拮抗剂。
【发明内容】
[0009] 本发明尤其提供不受先前技术中所发现的限制妨碍的整合素拮抗剂及其用途。
[0010] 本发明者未预期地发现，本文所揭示的突变或经修饰的人类纤维黏连蛋白（FN) 片段呈现整合素拮抗剂活性。另外，与具有野生型序列的FN片段相比，本文所揭示的FNIII 10或FNIII9-10突变体或变体显示溶解性及稳定性增加。
[0011] 在人类FN中，R⑶基元位于很大程度上无序且移动性的类型III域10的环中，推 测弹性（flexibility)对其功能而言为至关重要的。本发明者未预期地发现，在FNIII10 内藉由引入经改造的双硫键来增加域内刚性赋予经改良的溶解性及稳定性，且/或维持或 改良针对整合素a5M及/或整合素av0 3的拮抗剂活性。在某些特定实施例中，本发 明的FNIII片段在pH7. 0的溶液中呈现至少约20至约24mg/mL的溶解度。在某些其他特 定实施例中，本发明的FNIII片段呈现至少约7至约27mg/mL的溶解度。在某些特定实施 例中，在不存在自由氨基酸Arg及Glu的情况下达成溶解度。在某些其他实施例中，与具有 野生型人类序列的FNIII片段相比，本发明的FNIII片段所展示的溶解度增加约10%至约 300%，尤其约 20%至约 280%，25%至约 250%，30%至约 200%，20%至约 150%。
[0012] 虽然对与整合素aV0 3结合而言并非必需，但模块9对整合素a5M的结合提 供协同性增强。本发明者未预期地发现，在存在FNIII9的情况下，藉助于侧接RGD基元 的两个Cys取代（例如包含式Cys-X8-Cys，此外例如包含式Cys149°X2RGDX3Cys1499)而在模 块10中引入的双硫键可改良FNIII9-10变体的溶解性及稳定性，且增加整合素a5M的 拮抗剂活性。此外，本发明者意外地发现，在侧接RGD基元的FNIII模块10 (例如包含式 〇78-\-078，此外例如包含式078 14911?0\0781499)中的经改造双硫键可改良？见1110变体 的溶解性及稳定性，及其对整合素aVf3 3的拮抗剂活性。此外，本发明者意外地发现，在 FNIII9-10的情形下，具有包含例如式Cys-X7_Cys及此外例如式Cys1491XRGDX3Cys1499的Cys 取代的变体展现对整合素av 0 3而非整合素a50 1的结合特异性。
[0013]因此，在一个态样中，本发明提供一种经分离的多肽，其包含经修饰的人类纤维 黏连蛋白片段，该蛋白片段包含人类纤维黏连蛋白类型III域模块lO(FNIIIlO)，其中该 FNIII10包含Arg-Gly-Asp(RGD)基元及两个Cys取代以形成双硫键，其中一个Cys取代 在RGD基元的N-末端，而另一个Cys取代在RGD基元的C-末端，且其中该FNIII10包含 与SEQIDN0:2至少85%，至少90%，至少95 %或至少98 %同源性的氨基酸序列。在某些 具体实施例中，多肽抑制或能够抑制整合素a5M或整合素av0 3活性，而不抑制整合素 allb0 3活性。在本申请案通篇中，经修饰的人类纤维黏连蛋白片段可视情况进一步包含人 类纤维黏连蛋白的其他模块及/或域。在某些实施例中，经修饰的人类纤维黏连蛋白进一 步包含类型III域模块9,且人类纤维黏连蛋白类型III域模块9及10(FNIII9-10)包含 与SEQIDN0:4至少85%、至少90%、至少95 %或至少98 %同源性的氨基酸序列。在某些 其他实施例中，FNIII9-10视情况在模块9中的氨基酸位置1408处进一步包含Leu经Pro 取代。
[0014] 在某些实施例中，两个Cys取代由约6至约9个氨基酸残基分离，且侧接RGD基 元。在某些其他实施例中，两个Cys取代由7或8个氨基酸残基分离。在某些实施例中，两 个Cys取代位于氨基酸位置1487-1501内。在某些其他实施例中，FNIII10在氨基酸位置 1491、1492、1496、1497或1498处进一步包含至少一个氨基酸取代，且其中位置1491处的 氨基酸取代为Arg或lie，位置1492处的氨基酸取代为Ala或Pro,位置1496处的氨基酸 取代为Met、Asn或Trp，位置1497处的氨基酸取代为Asn，且位置1498处的氨基酸取代为 Asp或Glu。本申请案通篇所使用的氨基酸编号系基于全长人类纤维黏连蛋白蛋白质（SEQ IDN0:74)的氨基酸编号。举例而言，基于SEQIDN0:74的序列的氨基酸位置1491处的 Thr残基系指如SEQIDN0:2中所示的FNIII10的氨基酸位置76处的Thr残基。
[0015] 在某些特定实施例中，Cys取代为氨基酸位置1491处的Thr经Cys取代（T1491C) 及氨基酸位置1499处的Ser经Cys取代（S1499C)。在某些实施例中，FNIII10包含式 C149%wRGDX2 fa)C1499，其中该n为1、2或3，其中X#X2可代表相同或不同的氨基酸残基。在 某些特定实施例中，FNIII10包含式C1491Xia)RGDX2WC1499。在某些特定实施例中，多肽抑制 整合素av 0 3活性。
[0016]在其他实施例中，FNIII10 包含式Cys^-Xi-Arg-Gly-Asp-XfXfXfCys1499,其中 \为Gly、Ala或Pro;X2为Ser、Met、Asn或Trp;X3为Pro或Asn;且X4为Ala、Asp或Glu〇 在某些特定实施例中，乂:为Pro,X2为Met，X3为Pro,且X4为Asp。在某些其他特定实施例 中，父丨为Pro,X2为Trp，X3为Asn，且X4为Glu。在其他特定实施例中，X丨为Ala，X2为Asn， 父3为？1'〇，且乂4为48?。在某些特定实施例中3 1为61732为561'33为？1'〇，且乂4为六1 &。 在某些其他实施例中，多肽具有3￡〇10勵:6、3￡〇10勵:8、3￡〇10勵：10或3￡〇10勵：12 的氨基酸序列。在某些特定实施例中，多肽具有SEQIDN0:6的氨基酸序列。在某些其他 特定实施例中，多肽选择性抑制或能够选择性抑制整合素av0 3活性。
[0017] 在某些其他实施例中，其中经修饰的人类纤维黏连蛋白片段进一步包含人类纤维 黏连蛋白类型III域模块9(FNIII9)，该模块视情况可在氨基酸位置1408处包含Leu经Pro取代，且其中FNIII9及FNIII10(FNIII9-10)包含与SEQIDN0:4的氨基酸序列至 少85 %，至少90 %，至少95 %或至少98 %同源性的氨基酸序列。在某些实施例中，多肽具 有SEQIDNO: 20、SEQIDNO: 22、SEQIDNO: 24 或SEQIDNO: 26 的氨基酸序列。在某些特 定实施例中，多肽具有SEQIDNO:20的氨基酸序列。
[0018] 在某些其他实施例中，Cys取代为在氨基酸位置1490处Val经Cys取代（V1490C) 及在氨基酸位置1499处Ser经Cys取代（S1499C)，其中经修饰的人类纤维黏连蛋白片段 视情况可进一步包含人类纤维黏连蛋白类型III域模块9,该模块视情况可在氨基酸位置 1408处进一步包含Leu经Pro取代。在某些实施例中，FNIII10包含式Cysi^-Xi-XfAr g-Gly-As-X3-Pr〇-X4-Cys1499,其中父丨为Thr、Arg或lie;X2为Gly、Ala或Pro;X3为Phe、 Arg、Asp、Ser、Met或Asn;且乂4为Ala或Asp。在某些特定实施例中，XArg，X2为Ala， X3SAsn，且乂4为Asp。在某些其他实施例中，多肽具有SEQIDNO: 28、SEQIDNO: 30、SEQ IDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO: 108、SEQIDNO: 109 或SEQIDNO: 110 的氨基酸序 列。在某些特定实施例中，多肽具有SEQIDNO:32、SEQIDNO: 108、SEQIDNO: 109或SEQ IDNO: 110的氨基酸序列。在某些特定实施例中，多肽选择性抑制或能够选择性抑制整合素 a5 0 1活性。在某些实施例中，Cys取代为在氨基酸位置1490处的Val经Cys取代（V1490C) 及在氨基酸位置1499处的Ser经Cys取代（S1499C)，其中经修饰的人类纤维黏连蛋白片 段视情况可进一步包含人类纤维黏连蛋白类型III域模块9,该模块视情况可在氨基酸位 置1408处进一步包含Leu经Pro取代，及视情况的在氨基酸位置1341处的Asn经Ala取 代、在氨基酸位置1377处的His经Pro取代、在氨基酸1376处的Pro经Lys取代或在氨基 酸位置1376处的Pro经Asp取代。在某些特定实施例中，多肽具有SEQIDNO: 111、SEQID NO: 112、SEQIDNO: 113或SEQIDNO: 114的氨基酸序列。在某些特定实施例中，多肽选择 性抑制或能够选择性抑制整合素a5M活性。
[0019] 认为FNIII9-10域间键联的弹性使人类FN蛋白中发生大规模构形变化。藉由 FNIII9-10界面处键联的延伸来使FNIII9及FNIII10部分结构解偶导致模块9的协同 结合的损失（Altroff等人，2004,J.BiologicalChemistry, 279:55995-56003)。前述结果 显示藉由跨模块9与10的接合处的双硫键来引入的域间刚性藉助于与整合素a5M结合 来消除FNIII9-10的协同细胞黏附活性，且减少其与不依赖于FNIII9的整合素avf3 3 结合的亲和性（Altroff等人，文献同前）。
[0020] 然而，本发明者未预期地发现，由非共价键产生的模块9与10之间的域间键联维 持其与整合素a5M的结合亲和性。非共价键联可为FNIII9及FNIII10提供恰当定向， 且促使与整合素a5M结合。
[0021]因此，在另一个态样中，本发明提供包含经修饰的人类纤维黏连蛋白片段的经分 离的多肽，该蛋白片段包含人类纤维黏连蛋白类型III域模块9及人类纤维黏连蛋白类型 III域模块10(FNIII9-10)，其中FNIII9视情况可在氨基酸位置1408处包含Leu经Pro 取代，其中FNIII9及/或FNIII10包含至少一个氨基酸取代，其中FNIII9及FNIII10 中的氨基酸残基形成非共价键，且其中FNIII9及FNIII10包含与SEQIDNO: 4的氨基酸 序列至少85%，至少90%，至少95%或至少98%同源且并非SEQIDNON0:64的氨基酸序 列。在某些特定实施例中，多肽抑制或能够抑制整合素a5M活性。
[0022] 根据本发明的此态样，在某些实施例中，FNIII9及FNIII10中的氨基酸取代形 成域间双硫键。在某些其他实施例中，FNIII9及FNIII10中的氨基酸取代形成域间氢键。 在某些特定实施例中，FNIII9中的氨基酸取代为在氨基酸位置1340处的Ala经Asp取代 (A1340D)，且FNIII10中的氨基酸取代为在氨基酸位置1442处的Val经Lys取代（V1442K) (图4)。在某些另外的实施例中，多肽具有SEQIDN0:40的氨基酸序列。在某些其他实施 例中，FNIII10中的氨基酸取代为在氨基酸位置1491处的Thr经Arg取代（T1491R)。在 某些特定实施例中，在氨基酸位置1341处的Asn与在位置1491处的氨基酸残基之间形成 非共价域间键联。在某些另外的实施例中，多肽具有SEQIDN0:72的氨基酸序列。
[0023] 在另一个态样中，本发明提供包含经修饰的人类纤维黏连蛋白片段的经分离的多 肽，该蛋白片段包含其中含有式Val^-Xi-X^Arg-Gly-Asp-m-Xe-Ser1?的人类纤维 黏连蛋白类型III域模块10(FNIII10)，其中乂丨为Thr或Arg;X2为Ala或Pro;X3为Met、 Trp或Asn;X4为Pro或Asn;X5为Asp或Glu;且X6为Ser或Gly，其中经修饰的纤维黏连 蛋白片段包含与SEQIDNO: 2至少85%，至少90%，至少95%或至少98%同源且并非SEQ ID勵:50的氨基酸序列。在某些特定实施例中，乂1为！111'32为？1' 〇33为也丨34为？1'〇; 父5为Asp;且X6为Ser。在某一个其他特定实施例中，X:为Thr;X2为Ala;X3为Asn;X4为 Pro;X5SAsp;且 乂6为Ser。在另外的实施例中，XiSArg;X2SAla;X3SAsn;X4SPro; 乂5为Asp;且X6为Ser。在某些特定实施例中，多肽抑制或能够抑制整合素a5M活性及 /或整合素av 0 3活性。在某些其他实施例中，多肽具有SEQIDNO: 48、SEQIDNO: 52或 SEQIDN0:54的氨基酸序列。在某些特定实施例中，多肽具有SEQIDN0:48的氨基酸序 列。
[0024] 根据本发明的此态样，在某些实施例中，经修饰的纤维黏连蛋白片段进一步包含 人类纤维黏连蛋白类型III域模块9(FNIII9)，该模块视情况可在氨基酸位置1408处包 含Leu经Pro取代，且其中FNIII9及FNIII10(FNIII9-10)包含与SEQIDN0:4的氨基 酸序列至少85%，至少90%，至少95 %或至少98%同源的氨基酸序列。在某些特定实施例 中，多肽具有SEQIDN0:56、SEQIDN0:58、SEQIDN0:60 或SEQIDN0:62 的氨基酸序列。 在某些特定实施例中。多肽具有SEQIDN0:60或SEQIDN0:62的氨基酸序列。
[0025] 本文所描述的所有实施例可与其他实施例组合，除非自上下文明确了解其不能组 合。举例而言，包含其中含有域内双硫键的FNIII9-10的经修饰的纤维黏连蛋白片段可进 一步包含FNIII9与FNIII10之间的经改造的域间键联。亦理解本发明涵盖可其他组合。
[0026] 在另一个态样中，提供包含本